Pseudomonas aeruginosa produce los biosurfactantes ramnolípidos. La cromatografía en capa fina detecta y determina la proporción de mono y di-ramnolípidos producidos por cada cepa. La cuantificación de los ramnolípidos totales implica la evaluación de los equivalentes de ramnosa presentes en estos biosurfactantes extraídos de los sobrenadantes de cultivo mediante el método de orcinol.
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Artículo de método
Detección y cuantificación de mono-ramnolípidos y di-ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa
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Resumen
Resumen
La bacteria ambiental Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista con alta resistencia a los antibióticos que representa un peligro para la salud. Esta bacteria produce altos niveles de biosurfactantes conocidos como ramnolípidos (RL), que son moléculas con un importante valor biotecnológico pero que también se asocian a rasgos de virulencia. En este sentido, la detección y cuantificación de RL puede ser útil tanto para aplicaciones biotecnológicas como para proyectos de investigación biomédica. En este artículo, demostramos paso a paso la técnica para detectar la producción de las dos formas de RL producidas por P. aeruginosa mediante cromatografía en capa fina (TLC): mono-ramnolípidos (mRL), moléculas constituidas por un dímero de ácidos grasos (principalmente C10-C10) unido a una fracción de ramnosa, y di-ramnolípidos (dRL), moléculas constituidas por un dímero de ácido graso similar unido a dos partes de ramnosa. Además, presentamos un método para medir la cantidad total de RL basado en la hidrólisis ácida de estos biosurfactantes extraídos de un sobrenadante de cultivo de P. aeruginosa y la posterior detección de la concentración de ramnosa que reacciona con el orcinol. La combinación de ambas técnicas se puede utilizar para estimar la concentración aproximada de mRL y dRL producida por una cepa específica, como se ejemplifica aquí con las cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) y PA7 (filogrupo 3).
Introducción
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental y un patógeno oportunista de gran preocupación debido a su producción de rasgos asociados a la virulencia y su alta resistencia a los antibióticos 1,2. Un metabolito secundario característico producido por esta bacteria es el biosurfactante RL, que se produce de forma coordinada con varios rasgos asociados a la virulencia como la fenazina piocianina, un antibiótico con actividad redox, y la proteasaelastasa 3. Las propiedades tensioactivas y emulsificantes de RL han sido explotadas en diferentes aplicaciones industriales y actualmente se comercializan4.
La mayoría de las cepas de P. aeruginosa, pertenecientes a los filogrupos 1 y 2, producen dos tipos de RL: mRL, que consiste en una fracción de ramnosa unida a un dímero de ácidos grasos principalmente de 10 carbonos, y dRL, que contiene una fracción de ramnosa adicional unida a la primera ramnosa4 (ver Figura 1). Sin embargo, se ha reportado que dos filogrupos menores de P. aeruginosa (grupos 3 y 5) solo producen mRL 5,6. Los dos tipos de RL contienen una mezcla de dímeros de ácidos grasos, que, como se mencionó, son principalmente C10-C10, pero también se producen proporciones más pequeñas de moléculas que contienen dímeros C12-C10, C12-C12 y C10-C12:1. Se ha reportado la caracterización de los congéneres RL producidos por diferentes cepas utilizando HPLC MS/MS 7,8. Los métodos descritos en este trabajo solo pueden diferenciar entre mRL y dRL, pero no se pueden utilizar para la caracterización de los congéneres de RL.
P. aeruginosa y algunas especies de Burkholderia son productoras naturales de RL9, pero la primera bacteria es la productora más eficiente. Sin embargo, actualmente se produce RL de uso comercial en derivados de Pseudomonas putida KT2440 que expresan genes de P. aeruginosa para evitar el uso de este patógeno oportunista10,11. La detección y cuantificación de RL producida por P. aeruginosa son de gran importancia para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de rasgos relacionados con la virulencia12, en la caracterización de cepas pertenecientes a los clados 3 o 513, y para la construcción de derivados de P. aeruginosa que sobreproduzcan estos biosurfactantes y tengan una virulencia reducida14. La producción de biosurfactantes por parte de diferentes microorganismos se ha detectado a partir de algunas características generales de estos compuestos, como el método de la gota de colapso o el índice de emulsificación15, pero estos métodos no son precisos ni específicos16.
En este trabajo se describe el protocolo para la detección de mRL y dRL mediante la extracción líquida de RL total a partir de los sobrenadantes de cultivo de diferentes cepas de tipo P. aeruginosa y la separación de ambos tipos de RL mediante TLC. En este método, los RL extraídos del sobrenadante de cultivo se separan por su solubilidad diferencial en los disolventes utilizados para el TLC, lo que provoca una migración diferencial en la placa de gel de sílice. Por lo tanto, los mRL tienen una migración más rápida que los dRL, y se pueden detectar como puntos separados cuando las placas se secan y se tiñen con α-naftol.
El método descrito aquí para la detección de mRL y dRL por TLC se basa en un artículo17 publicado anteriormente, que es fácil de realizar y no requiere equipos costosos. Este método ha sido útil para detectar RL en varios aislados de P. aeruginosa 13 utilizando controles apropiados, como un mutante derivado de P. aeruginosa incapaz de producir RL. Sin embargo, no es el método preferido para caracterizar nuevos biosurfactantes producidos por bacterias distintas de Pseudomonas aeruginosa debido a su falta de especificidad.
Además, se presenta un método para cuantificar los equivalentes de ramnosa de RL total extraído de un sobrenadante de cultivo de P. aeruginosa . Este método cuantifica estos biosurfactantes a partir de la reacción del orcinol con azúcares reductores, dando como resultado un producto que puede medirse espectrofotométricamente a 421 nm, como se ha descrito anteriormente18. Dado que la reacción con orcinol no es específica de la ramnosa, es importante realizar este método con RL extraído del sobrenadante del cultivo que no contenga cantidades significativas de otras moléculas que contengan azúcares, como los lipopolisacáridos (LPS). Aquí se utiliza una mezcla acidificada de cloroformo y metanol para la extracción líquida de RL18, pero también se puede utilizar acetato de etilo, y la extracción en fase sólida (SPE) da muy buenos resultados19. El método de orcinol descrito aquí no requiere equipos sofisticados y puede proporcionar resultados confiables si se realiza con especial cuidado en la preparación de las muestras analizadas, como se discutió. Para garantizar una preparación adecuada de la muestra, es importante incluir un mutante de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapaz de producir RL20 y realizar tres réplicas biológicas y tres técnicas para cada determinación.
Ha existido una importante controversia en la literatura16,21 en relación a la determinación de RL por el método de orcinol, con algunos estudios que sugieren que la producción de RL está sobreestimada y que el ensayo carece de especificidad para la ramnosa, potencialmente detectando otros azúcares. Sin embargo, demostramos aquí que los métodos descritos pueden ser precisos y específicos en las condiciones adecuadas. Además, para la comparación con los procedimientos descritos en este artículo, utilizamos la detección UPLC-MS/MS de un estándar dRL y demostramos que se obtienen resultados similares con el método orcinol. El protocolo detallado para cuantificar el RL utilizando este método se incluye en el Archivo Complementario 1.
Estos protocolos se ejemplifican utilizando las cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) y PA7 (filogrupo 3). Se eligieron estas cepas porque están bien caracterizadas y producen diferentes perfiles de RL.
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Protocolo
Este procedimiento se esquematiza en la Figura Suplementaria 1. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Detección de mRL y dRL en sobrenadantes de cultivo de P. aeruginosa mediante TLC
- Comenzar con el caldo centrifugado de la cepa de interés P . aeruginosa , cultivado en medio líquido durante 24 h (para llegar a la fase estacionaria de crecimiento donde se produce RL). Por lo general, estos cultivos contienen 1 x 109 bacterias por ml.
- Ajuste el pH del cultivo a 2 utilizando HCl concentrado.
- Poner 5 mL del sobrenadante de cultivo acidificado en un tubo de polipropileno de 50 mL y añadir 5 mL de una mezcla 2:1 de cloroformo: metanol.
- Agite el tubo por inversión tres veces, cada vez durante 10 s, y deje el tubo sin inversión durante 2 minutos entre cada agitación.
- Deje el tubo sin agitación durante aproximadamente 3 h hasta que se separen las dos fases, o centrifugue el tubo durante 10 min a 3.000 x g a 4 °C.
- Transfiera la fase orgánica (capa inferior) a un tubo limpio y deje el tubo en una campana de extracción hasta que se seque.
- Repita el proceso a partir del paso 1.3, colocando la fase orgánica del segundo cloroformo: extracción con metanol, en el tubo que se utilizó en la primera extracción.
- Evaporar la fase orgánica hasta que queden 1 mL o 1,5 mL. Transfiera este volumen a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y evapore el solvente hasta que se seque durante la noche.
- Agregue 50 μL de metanol al tubo seco para resuspender RL.
- Realice cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice.
NOTA: El tamaño de la placa TLC debe cortarse de acuerdo con el número de muestras que se analizarán. Cada muestra debe aplicarse a 1,5 cm, y el punto de aplicación debe estar a 1 cm del borde de la placa (dibuje una línea horizontal con un lápiz). - Aplique 5 μL de cada muestra con una micropipeta de 10 μL.
- La fase líquida de TLC consiste en una mezcla 65:15:2 de cloroformo: metanol y ácido acético. Para preparar 35 mL de esta mezcla, mezcle 26 mL de cloroformo, 6 mL de metanol y 0,8 mL de una solución madre al 20% de ácido acético. Mezcle estos solventes y colóquelos en la cámara TLC cerrada durante al menos 10 minutos antes de comenzar la cromatografía, de modo que la atmósfera esté saturada con los solventes volátiles.
- Coloque la placa TLC en la cámara, evitando el contacto con el punto donde se aplicaron las muestras.
- Cierre la cámara y deje el TLC hasta que el solvente alcance 1 cm antes del borde de la placa. En este punto, retire la placa y déjela secar (se puede aplicar un flujo de aire para acelerar el proceso).
- Prepare una solución de α-naftol disolviendo 5 g de este compuesto en 33 mL de etanol. Una vez disuelto, añadir 127,5 mL de etanol, 12,6 mL de agua y 20,5 mL de H2SO4 frío.
- Para detectar la presencia de mRL y dRL, rocíe la solución de α-naftol sobre la placa en la campana de extracción y coloque la placa rociada en un horno a 85 °C durante varios minutos hasta que la marca rosada de RL sea evidente.
- Utilice una imagen del TLC para calcular la proporción de mono- y di-RL presentes en cada muestra utilizando un software que detecte la densidad de cada mancha.
2. Cuantificación de la cantidad total de RL midiendo los equivalentes de ramnosa presentes en el biosurfactante
- Colocar 1,2 mL de un cultivo en fase estacionaria (cultivado durante 24 h) en un tubo de centrífuga de 1,5 mL y centrifugar durante 3 min a 3.000 x g a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo limpio.
- Transfiera 333 μL a un tubo limpio (realice este paso por triplicado) y agregue 1 mL de éter.
- Mezcle vigorosamente en un vórtice durante 30 s. Repita este procedimiento con un tubo a la vez.
- Centrifugar durante 2 min a 3.000 x g a 4 °C. Recoja la fase orgánica (fase superior), transfiérala a un tubo limpio y déjela abierta en la campana de extracción hasta que se produzca la sequedad.
- Repita la extracción con éter como se describe en el paso 2.2. Repita los pasos 2.3 y 2.4.
- Una vez que esté completamente seco, agregue 1 mL de agua a cada tubo. Deje los tubos durante 12 h para permitir que el RL se hidrate, luego agite vigorosamente en el vórtice.
- Coloque un matraz limpio en hielo durante 5 min (ya que es una reacción exotérmica). Preparar una solución de 60% H2SO4 (proteger el matraz de la luz).
- En un tubo limpio, prepare una solución de orcinol al 1,6% en agua destilada. Para preparar el reactivo de orcinol, mezcle 4,4 mL de la solución de H2SO4 al 60% con 0,6 mL de la solución de orcinol al 1,6%.
- Calcular el volumen final del reactivo de orcinol necesario. Añadir 900 μL de este reactivo a cada muestra y a cada concentración de la curva de calibración, utilizando diferentes concentraciones de ramnosa (normalmente, se utilizan 9 concentraciones de ramnosa en el rango de 1 μg/mL a 9 μg/mL), y una con 100 μL de agua, asegurándose de que todas se realicen por triplicado.
- Añada 100 μL de cada muestra de RL a 900 μL del reactivo de orcinol en un tubo de vidrio y mezcle las dos soluciones.
- Incubar durante 30 min en un baño de agua precalentado a 80 °C.
- Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente.
- Lea la absorbancia de las muestras y la curva de calibración a 421 nm utilizando una celda de cuarzo.
- Calcule la concentración de ramnosa en cada muestra interpolando la absorbancia en la curva de calibración y considerando el volumen utilizado para la determinación.
- Para calcular la concentración en μM, divida la concentración obtenida en μg/mL por 182,2 (el peso molecular de la ramnosa) y multiplíquela por 1000.
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Resultados
En este artículo, se utilizaron tres cepas diferentes de P. aeruginosa para representar tres filogrupos, cada uno con diferentes niveles de producción de RL y proporciones de mRL y dRL. Estas cepas incluyen PAO1 (un aislado de herida de Australia, 195522), PA14 (un aislado de planta de los EE. UU., 197723) y PA7 (un aislado clínico de Argentina, 201024). Como control negativo, se empleó el mutante PAO1 rhlA, que es incapaz de producir RL. To...
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Discusión
El método más preciso para detectar y cuantificar el RL es la HPLC acoplada a la espectrometría de masas (MS)7,8,27; Sin embargo, requiere equipos especializados y costosos que pueden no ser accesibles para muchos investigadores. Los métodos descritos aquí se pueden realizar de forma rutinaria con materiales y equipos básicos de laboratorio para detectar y estimar las concentraciones de RL, pero tienen algunas limitaciones, en p...
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
El laboratorio del GSCh se financia en parte con IN201222 de apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-NAFTOL | SIGMA-ALDRICH | 70442 | |
| ÁCIDO ACÉTICO | J.T. BAKER | 9508-02 | |
| CENTRÍFUGA | Para tubos de centrifugación de 1,5 mL y 50 mL | ||
| CLOROFORMO | J.T. BAKER | 9180-02 | |
| HORNO | |||
| ETHER | J.T. BAKER | 9244-02 | |
| PIPETA | DE VIDRIO SIGMA-ALDRICH | ||
| ÁCIDO CLORHÍDRICO | J.T. BAKER | 5622-02 | |
| LB | |||
| L-RAMNOSA MONOHIDRATO | SIGMA-ALDRICH | R-3875 | |
| METANOL | J.T. BAKER | 9049-02 | |
| ORCINOL MONOHIDRATO | SIGMA-ALDRICH | O1875 | |
| Caldo | Tris HCL (0.12M), cloruro de potasio (0.02M), cloruro de amonio (0.02M), Peptona (1%), pH 7,4 Autoclave. Agregar Glucosa (5%) y sulfato de magnesio (0.0016M) | ||
| CELDA DE CUARZO (CUBETA) | SIGMA-ALDRICH | Z276669 | |
| TANQUE DE DESARROLLO TLC RECTANGULAR | FISHER SCIENTIFIC | ||
| RHAMNOLÍPIDOS | ESPECTROFOTÓMETRO | ||
| VIS | |||
| > 80 ° C |
Referencias
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