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Artículo de método

Inducción de plasticidad a largo plazo de la excitabilidad neuronal intrínseca en neuronas del núcleo geniculado lateral dorsal

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DOI:

10.3791/65950

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20 de septiembre de 2024

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1Unité de Neurobiologie des canaux Ioniques et de la Synapse (UNIS), UMR1072, INSERM, Aix-Marseille University

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para inducir la plasticidad a largo plazo de la excitabilidad intrínseca neuronal en neuronas de relevo del núcleo geniculado lateral dorsal mantenido en cortes de cerebro ex vivo.

Resumen

El núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) se ha sostenido durante mucho tiempo que actúa como un relé básico para la información visual que viaja desde la retina a las áreas corticales, pero hallazgos recientes sugieren una plasticidad funcional en gran medida subestimada de las células principales de dLGN. Sin embargo, los mecanismos celulares que sustentan estos cambios no se han explorado completamente. Aquí, reportamos un protocolo para inducir la potenciación a largo plazo de la excitabilidad neuronal intrínseca (LTP-IE) en células de relevo dLGN dorsales a partir de cortes agudos de cerebro de ratas jóvenes. La plasticidad intrínseca generalmente se induce en paralelo con la plasticidad sináptica. Sin embargo, en las neuronas dLGN, LTP-IE es inducida de forma fiable por la actividad de picos a una frecuencia de 40 Hz durante 10 min. LTP-IE en las neuronas de relevo dLGN es de larga duración, ya que puede seguirse hasta 40 min después del protocolo de inducción. En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan la primera evidencia de la inducción de plasticidad intrínseca en las células de relevo dLGN, lo que apunta aún más al papel de las neuronas talámicas en la plasticidad visual dependiente de la actividad.

Introducción

El objetivo general de este artículo de método es proporcionar una forma sencilla de inducir una plasticidad duradera de la excitabilidad neuronal en las neuronas talámicas visuales de la rata in vitro, utilizando el modo estándar de pinza de corriente de la técnica de fijación de parches1,2. La razón detrás del desarrollo de esta técnica es su simplicidad y reproducibilidad. La ventaja sobre técnicas alternativas, como la estimulación de entradas sinápticas emparejadas o no con potenciales de acción postsinápticos entregados en un tiempo dado, es su fiabilidad.

Tradicionalmente se piensa que la plasticidad en el sistema visual se expresa exclusivamente a nivel cortical, mientras que el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN), una estructura receptora primaria de entradas retinianas a nivel talámico, se considera tradicionalmente como solo un relevo de información visual3. Sin embargo, esta conclusión inicial ha sido cuestionada por trabajos recientes que indican que esta visión simplista no se sostiene por más tiempo4,5,6. Por ejemplo, ya se observan déficits funcionales en la respuesta visual en pacientes ambliopes, en la etapa de la LGN7. Además, una gran proporción de neuronas de relevo dLGN en un territorio monocular determinado reciben entradas de cada ojo, lo que indica una binocularidad potencial para una gran proporción de neuronas dLGN8,9,10. Además, la privación monocular produce un cambio significativo en la dominancia ocular en las neuronas dLGN5,11,12.

Entre los mecanismos de plasticidad funcional que pueden ocurrir en el cambio de dominancia ocular, la plasticidad de la excitabilidad neuronal intrínseca es un candidato potencial. De hecho, muchas regiones del cerebro, incluidas las áreas visuales, expresan plasticidad intrínseca después de diversas tareas conductuales13,14. Se ha reportado plasticidad intrínseca a largo plazo en las neuronas centrales después de la estimulación de las entradas aferentes de glutamato15,16,17,18, spiking activity19,20, sensory stimulation21 o después de una actividad o privación sensorial20,22,23. Aquí, describimos un protocolo que permite la inducción de la potenciación a largo plazo de la excitabilidad intrínseca (LTP-IE) en neuronas de relevo dLGN después de la actividad de pico a una frecuencia de 40 Hz. La frecuencia de disparo de 40 Hz corresponde a una frecuencia observada en la mayoría de las neuronas dLGN in vivo tras la estimulación visual24,25.

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Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices europeas e institucionales (Directiva 86/609/CEE del Consejo Nacional de Investigación francés y aprobado por la autoridad sanitaria local (Servicios Veterinarios, Prefectura de Bouches-du-Rhône, Marsella)).

1. Animales

  1. Realizar experimentos con ratas Long Evans de 19 a 25 días de edad de ambos sexos (con un peso de entre 50 y 90 g).
  2. Aloja a los animales en jaulas de plástico convencionales, junto con su madre y su compañero de camada. Mantenga la temperatura constante con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y acceso ad libitum al agua y a los alimentos.

2. Cortes agudos de rata dLGN

  1. Preparar soluciones de corte/recuperación y registro extracelular.
    1. Para preparar la solución de corte/recuperación, mezcle 92 mM de n-metil-D-glutamina, 30 mM de NaHCO3, 25 mM de D-glucosa, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl, 0,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de NaH2PO4, 20 mM de Hepes, 5 mM de ascorbato de sodio y 3 mM de piruvato de sodio y burbujee con 95% de O2-5% de CO2 (pH 7,4). Mantenga la solución de corte fría durante el procedimiento de corte.
    2. Prepare la solución de registro (líquido cefalorraquídeo artificial, ACSF) mezclando 125 mM de NaCl, 26 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 2,5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 0,8 mM de NaH2PO4 y 10 mM de D-glucosa y equilibre permanentemente con 95% de O2-5% de CO2.
  2. Prepare las herramientas de disección y dos plataformas de hielo (Figura 1A).
  3. Coloque hielo en el tanque exterior y llene la cámara de corte del vibratomo con una solución de corte helada (Figura 1B).
  4. Anestesiar profundamente a ratas jóvenes Long Evans (edad: P19-P25) con isoflurano (5%). Después de confirmar que el animal está profundamente anestesiado (pellizcando firmemente la pata sin respuesta), eutanasiar al animal por decapitación con tijeras o una guillotina (dependiendo de la edad/tamaño del animal) a la altura de la médula. Coloque la cabeza en la primera plataforma helada y riegue el tejido aislado cada 10 s con la solución de corte oxigenada helada.
    NOTA: Los procedimientos de anestesia y eutanasia deben realizarse en una sala separada del animalario.
  5. Corta el cuero cabelludo en dirección caudal y, con unas tijeras pequeñas, corta el cráneo bilateralmente. Con pinzas romas, abra el cráneo y extraiga rápidamente el cerebro del cráneo con una espátula y colóquelo en la segunda plataforma >
  6. Hacer 2 cortes en el plano frontal del cerebro sobre todo el cerebro; el primero para eliminar la parte anterior de la corteza y los bulbos olfativos (ver Figura 1C) y el segundo a nivel del colículo inferior para eliminar la parte posterior de la corteza y el cerebelo.
  7. Pegue el bloque cerebral en la placa del vibratomo con el lado rostral hacia arriba (ver Figura 1D,E). Riegue el cerebro regularmente (cada 10 s) durante todo el procedimiento hasta que se sumerja en la cámara de corte del vibrátomo.
  8. Haga rodajas finas de 350 μm que contengan el dLGN con el vibratomo (Figura 1G). Retire la corteza y el hipocampo del mesencéfalo con un lápiz tirando suavemente de estas estructuras.
  9. Aspire las lonchas con una pipeta Pasteur rota conectada a una ventosa de goma flexible (Figura 1H).
  10. Deje que los cortes se recuperen durante 20-30 minutos en la solución de recuperación (Figura 1I).

3. Electrofisiología de patch-clamp de célula entera

NOTA: Para grabaciones de patch-clamp de células completas de neuronas de relé dLGN, utilice un amplificador de patch-clamp específico.

  1. Encienda las bombas del equipo para hacer circular la solución salina de registro extracelular (ver composición en el paso 2.1) en la cámara de grabación.
  2. Prepare la solución intracelular mezclando 120 mM de K-gluconato, 20 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,5 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2, 2 mM deNa2ATP y 0,3 mM de NaGTP (pH 7,4).
    NOTA: La solución intracelular puede prepararse con anticipación y mantenerse congelada a -80 °C. Cuando está descongelada, la solución se mantiene a 4 °C.
  3. Añadir el bloqueador de canales GABA A, picrotoxina (concentración final de 100 μM), y el antagonista del receptor ionotrópico de glutamato, cinurenato (2 mM, concentración final), a la solución salina extracelular.
  4. Transfiera el corte a una cámara sumergida montada en un microscopio vertical. La cámara se controla a temperatura a 30 °C y se perfunde continuamente con aCSF equilibrado.
  5. Coloque el alambre de platino en forma de U en la rebanada y coloque la rebanada para visualizar el dLGN (Figura 2A).
  6. Prepare pipetas de parche a partir de tubos de vidrio de borosilicato extraídos con un extractor. Asegúrese de que las pipetas de parche tengan una resistencia de 5-10 MΩ cuando se llenen con la solución intracelular.
  7. Visualice el dLGN a gran aumento (40x o 60x) y seleccione una neurona para el registro de patch-clamp utilizando videomicroscopía infrarroja de contraste de interferencia diferencial (Figura 2B). Seleccione las neuronas en función de su apariencia saludable (es decir, ligeramente hinchadas con contornos de membrana afilados).
  8. Coloque la pipeta de parche en la neurona seleccionada con presión positiva constante utilizando el micromanipulador.
    1. Configure el amplificador en modo VC e inyecte un paso de voltaje de 5 mV. Ajuste el voltaje a -65 mV. Luego, libere la presión positiva para obtener un sello de alta resistencia (correspondiente a la reducción de la corriente en respuesta a los pasos de voltaje). Aspire ligeramente a través de la pipeta para obtener transitorios claros.
    2. Configure el amplificador en modo CC, equilibre el puente para compensar la resistencia de acceso y mantenga la neurona a -65 mV.

4. Adquisición de datos

  1. Adquiera señales a 20 KHz para detectar mejor los potenciales de acción rápida. Ajuste el filtro de paso bajo a 10 kHz para señales de voltaje y corriente.
  2. Monitoree la excitabilidad neuronal durante un período de control de aproximadamente 10 minutos inyectando un pulso positivo de corriente (generalmente ~ 80-250 pA durante 500 ms) suficiente para provocar 3-5 potenciales de acción en condiciones de control a una frecuencia de 0,1 Hz.
  3. Monitoree la resistencia de entrada de la neurona durante todo el experimento con un breve pulso negativo de corriente (generalmente -20 pA durante 100 ms). Mantenga constante la amplitud del pulso de corriente antes y después de la inducción de LTP-IE.

5. Inducción de LTP-IE

  1. Después del período de control, induzca LTP-IE provocando trenes de 15 picos evocados por 15 pasos cortos (2-5 ms) de corriente despolarizante suministrada a 40 Hz durante 10 min.
  2. Elija la amplitud del pulso de corriente para obtener un solo potencial de acción cada vez (es decir, 15 potenciales de acción por tren).
    NOTA: Cada tren de 15 picos se obtiene a una frecuencia de 0,1 Hz (es decir, 60 trenes y 900 picos).

6. Análisis de datos

NOTA: El procedimiento de análisis es el mismo antes (condiciones de control) y después de la inducción LTP-IE.

  1. Para cada traza registrada, calcule la resistencia de entrada (Rin) a partir de la respuesta de voltaje al pequeño pulso de corriente negativa inyectado antes del paso de prueba de corriente (Rin =paso V/paso I). Si hay un aumento o una disminución de la resistencia de entrada (más del 10%) durante el período de control, descarte el experimento.
  2. Seleccione las trazas registradas en función del potencial de membrana antes de cualquier inyección de corriente. Conserve solo las trazas con un potencial de membrana en reposo de -67 a -63 mV.
  3. Cuantifique LTP-IE durante un período de 10 min, 20 min después del comienzo del período posterior a la inducción midiendo el número de AP evocados por cada pulso de corriente y promediando cada minuto mediante el uso de una rutina casera en un software de análisis de datos (consulte el Archivo complementario 1 para la rutina Igor Pro). Detecte picos cuando la señal de voltaje cruza 0 mV.
    NOTA: LTP-IE se expresa como el número de potenciales de acción provocados por la inyección de pulsos de corriente después del protocolo de inducción en comparación con antes (%). El análisis se realizó a -10-0 min para la línea de base y +20/+30 min para la prueba.

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Resultados

Se registraron neuronas del dLGN en configuración de célula íntegra, y se indujo la PTL-IE mediante la generación de potenciales de acción a 40 Hz durante 10 min en presencia de antagonistas de los receptores ionotrópicos de glutamato y GABA (Figura 3A). Se observó un aumento de tres veces en el número de potenciales de acción 20-30 min después de la inducción (Figura 3B), sin ningún cambio en la resistencia de entrada, Rin (Figur...

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Discusión

Informamos aquí la inducción de LTP-IE en neuronas dLGN mantenidas vivas en cortes cerebrales agudos mediante la estimulación de la neurona registrada para evocar potenciales de acción a una frecuencia de 40 Hz durante 10 min. Este protocolo es fácil de implementar en cualquier laboratorio de neurofisiología, ya que requiere un número mínimo de equipos (cortadora, microscopio, 1 amplificador, 1 placa de adquisición y computadora). Sin embargo, se deben respetar algunos pasos críticos para recopilar datos valiosos. El pri...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Apoyado por INSERM, CNRS (a DD), AMU (a MR), FRM (DVS20131228768 a DD y DEQ20180839583 a DD), NeuroSchool (programa "Francia 2030" a través de A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) y financiación ANR (ANR-17-EURE-0029 a AW), y ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 a DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 a DD). Agradecemos a A Venture & K Milton por el excelente cuidado de los animales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cuchilla vibratoria automatizada micrótomoLeicaVT-1200Svibrátomo/cortador
Tubo de vidrio de borosilicatoPhymepB-15086-10
Controlador Typ VLuigs& ControladortemperaturaNeumann Typ V
Software Igor softwarewavemetricssoftware de análisis
Videomicroscopía infrarrojaCámara OlympusXM-10 Kynurenate
Merk/SigmaK3375Bloqueador de receptores AMPA/NMDA
Sistema de adquisición de datos de bajo ruidoAxon - Molecular devicesDigidata 1440A Interfazanalógica/digital
MicromanipuladoresLuigs& NeumannLN Mini25
Multiclamp 200BAxon - Molecular devicesN/AAmplificador de patch-clamp
Multiclamp 700BAxon - Molecular devicesN/Ade patch-clamp
PC-100puller NarishigePC-100tirador de micropipetas
PClamp10Axon - Molecular devicesN/Asoftware
PicrotoxinaAbCamab120315Bloqueador de receptores GABAA
Slice mini cámara Luigs& Microscopio vertical decámara sumergidaLN Chambre Slice mini I-II
OlympusBX51 WI
de amplificador de grabación patch-clampNeumann

Referencias

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