Cultivo ex vivo de organoides de glioma derivados de pacientes con un picador de tejidos

Los gliomas de bajo grado (LGG, por sus siglas en inglés) son un grupo de tumores cerebrales relativamente raros que generalmente se presentan como de crecimiento lento y menos agresivos en comparación con los gliomas de alto grado como el glioblastoma. Pueden ocurrir tanto en adultos como en niños, con una prevalencia ligeramente mayor en adultos. La prevalencia exacta varía según la región y la población, pero los LGG representan aproximadamente entre el 15% y el 20% de todos los tumores cerebrales primarios¹. Las estrategias de tratamiento para los LGG a menudo implican una combinación de cirugía, radioterapia y quimioterapia, con el objetivo de maximizar la resección tumoral y preservar la función neurológica. El manejo de los LGG puede ser complejo, y la elección del tratamiento puede depender de factores como la localización del tumor y las características moleculares². Los avances en la comprensión de los fundamentos genéticos y moleculares de los LGG han dado lugar a terapias más dirigidas, y la investigación en curso continúa perfeccionando los enfoques de tratamiento.

Por otro lado, el glioblastoma de tipo IDH-salvaje, grado 4 de la OMS (GBM) del SNC, es el tumor cerebral primario más prevalente encontrado en adultos, con una tasa de incidencia entre 3,19-4,17 casos por 100.000 años-persona³. El GBM causa síntomas como dolores de cabeza, convulsiones, déficits neurológicos focales, cambios en la personalidad y aumento de la presión intracraneal. El tratamiento estándar para la GBM consiste en la citorreducción del tumor, si es posible, seguida de radioterapia combinada con temozolomida⁴. Además, la combinación de temozolomida y lomustina puede mejorar la mediana de la tasa de supervivencia global en pacientes con metilación del promotor de la O-6-metilguanina-metiltransferasa (MGMT) 5. Sin embargo, a pesar de estos enfoques terapéuticos recientes, la GBM sigue siendo una enfermedad incurable con mal pronóstico, caracterizada por una mediana de supervivencia global de los pacientes de 16 meses a 20,9 meses cuando se añaden los campos de tratamiento tumoral (TTFields) ^3,6. Se han investigado varios enfoques inmunoterapéuticos en GBM, pero han demostrado una eficacia limitada in vivo. Además, las limitaciones clínicas y preclínicas dificultan los avances terapéuticos⁷. El establecimiento de un modelo ex vivo adecuado y realista ha sido un reto debido a la heterogeneidad inter-8 e intratumoral⁹ de la MBG.

Las líneas celulares convencionales de pacientes bidimensionales (2D) representan poblaciones celulares homogéneas y son adecuadas para el cribado de fármacos de alto rendimiento. Sin embargo, las líneas celulares derivadas de pacientes e inmortalizadas no logran imitar adecuadamente la GBM debido a las diferencias en las condiciones de crecimiento y las desviaciones en las características genotípicas y fenotípicas después de múltiples pasadas 10,11,12.

Por otro lado, los modelos organoides 3D han surgido recientemente como sistemas prometedores que replican la heterogeneidad fenotípica y molecular de órganos y varios tipos de cáncer 13,14,15,16,17,18. En el contexto de la GBM, los organoides cerebrales han sido modificados genéticamente para simular características similares a las tumorales^16,17 o co-cultivados con GSCs o esferoides para inducir la infiltración de células tumorales ^18,19. Si bien los organoides de GBM derivados de pacientes cultivados con Matrigel y EGF/bFGF exhiben características distintivas de GBM como la heterogeneidad de las células madre y la hipoxia²⁰, sigue siendo incierto hasta qué punto este modelo puede representar las propiedades moleculares clave de las neoplasias de los pacientes.

Los organoides GBM (PDO) derivados de pacientes son modelos prometedores que pueden mantener las características predominantes de sus tumores parentales análogos, incluidas las características histológicas, la diversidad celular, la expresión génica y los perfiles mutacionales. Además, se infiltran rápidamente al implantarse en cerebros de roedores adultos, lo que proporciona un modelo realista para las pruebas de drogas y la terapia personalizada²¹. Sin embargo, la disección manual del tejido tumoral para generar PDO requiere mucho tiempo y es costosa. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un método rápido que pueda producir un gran número de PDO, lo que permite una evaluación exhaustiva de los diferentes enfoques terapéuticos que son prometedores para las pruebas individualizadas de drogas. En este estudio se describe un nuevo método para la fabricación de PDOs directamente a partir de tejido tumoral recién diseccionado utilizando un picador automático de tejidos. Además, las PDOs generadas por este método se compararon con las PDOs disecadas manualmente de los mismos pacientes en términos de recuento de PDO, características morfológicas, apoptosis y proliferación de células tumorales.

Todos los pacientes fueron tratados en el Departamento de Neurocirugía del Hospital Universitario de Würzburg, Alemania, después de dar su consentimiento informado por escrito de acuerdo con la declaración de Helsinki y según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Würzburg (#22/20-me). El material de tejido tumoral de cuatro pacientes con GBM y un astrocitoma, mutante en IDH, pacientes de grado 2 de la OMS del SNC (glioma de bajo grado, LGG) (Tabla 1) se obtuvo de la cirugía y se procesó mediante el siguiente protocolo. El proceso automatizado de generación de PDO utilizando un picador de tejido se denomina picador (C) y el proceso de corte manual del tejido con dos bisturíes bajo control microscópico como manual (M). Se diseccionaron seis secciones de igual tamaño (1-2 cm³) de la muestra tumoral, luego cada una se cortó por la mitad y se procesó homogéneamente utilizando los dos métodos. Debido a la heterogeneidad intratumoral antes mencionada, se generó una placa de 6 pocillos para cada abordaje de cada paciente, cada pocillo representando las PDO de un sitio diferente dentro del tumor original. Ambos procedimientos se llevaron a cabo bajo una cabina de flujo de aire laminar y todos los instrumentos utilizados fueron esterilizados antes de su uso. La descripción general del enfoque se ilustra en la Figura 1.

1. Preparación de bloques de agarosa (solo para el enfoque C, opcional)

1. Llene 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un vaso de precipitados, agregue una tableta de agarosa (consulte la Tabla de materiales) y mezcle bien hasta que se suspenda.
2. Calentar la mezcla en el microondas durante 30-40 s, evitando que hierva. A continuación, enfríe la mezcla hasta que alcance los 47 °C.
3. Vierta la mezcla de agarosa en un molde de fundición sellado en forma de cilindro y evite la formación de burbujas. Enfríe inmediatamente el yeso con una pinza congelada (-20 °C) o colocándolo sobre hielo seco durante 30 min.

2. Procesamiento del material tumoral

1. Prepare una caja de hielo para mantener el material tumoral refrigerado en el camino desde el quirófano hasta el laboratorio.
2. Transfiera el tejido tumoral (4-5 cm³) a un tubo estéril de 50 ml que contenga 25 ml de hibernación A (consulte la Tabla de materiales) que cubre el tumor y coloque el tubo en la caja de hielo.
3. Bajo una cabina de flujo de aire laminar, transfiera el material tumoral junto con el Hibernate A a una placa de Petri de vidrio esterilizada.
4. Eliminar el tejido necrótico y diseccionar los vasos sanguíneos cuidadosamente con un bisturí y pinzas de tejido bajo control microscópico. Identifique el tejido necrótico por áreas hemorrágicas que exhiben un tono marrón como resultado del sangrado, o tejido que exhibe una apariencia más pálida o más blanca en relación con el tejido viable adyacente. Preste atención a no apretar ni alterar el tejido.
5. Cortar el material tumoral en seis pedazos con un tamaño aproximado de 1-2 cm³. Distribuir las piezas en placas de Petri de plástico (n = 6) precargadas con 3 mL de medio H-GPSA (Tabla 2), cada²². Coloque las placas de Petri en hielo.

3. Configuración de la picadora de tejidos

1. Coloque la cuchilla como se describe en el manual del fabricante²³.
2. Ajuste el grosor de la rebanada a 0,45-0,50 mm. Ajuste la fuerza de la cuchilla a media. Fije la perilla de liberación de la mesa en el modo "inicio".

4. Procesamiento de las piezas de tejido tumoral

1. Procesamiento del tejido tumoral con el chopper (método C)
   1. Corta los bloques de agarosa en cilindros de 2 cm de longitud y pega uno de estos cilindros en el plato de plástico circular picador con el pegamento histoacrílico (ver Tabla de Materiales).
   2. Cree una profundización en el cilindro de agarosa con un bisturí y luego coloque el tejido tumoral del primer pocillo (paso 2.5) dentro de esta fosa.
      NOTA: El material tumoral debe manipularse con cuidado y no apretarse ni empujarse en el espacio. El espacio debe ser lo suficientemente grande como para que quepa fácilmente en el tumor, pero lo suficientemente pequeño como para mantener estable el material tumoral durante el proceso de corte. Pasos 4.1.1. y 4.1.2. son opcionales.
   3. Coloque el disco de plástico en el disco de montaje de la mesa de corte (consulte la tabla de materiales).
   4. Encienda el picador y presione el botón de reinicio. La picadora ahora comienza a cortar (primera ronda). La máquina se detiene automáticamente después de que la mesa llega al final y tanto la agarosa como el tejido tumoral se cortan en el diámetro deseado.
   5. Gire el disco de montaje 90° y, a continuación, ajuste la perilla de liberación de la mesa al modo de inicio.
   6. Presione el botón de reinicio y deje que la máquina vuelva a cortar el tejido creando tejido de forma rectangular (segunda ronda).
   7. Retire el disco de plástico con el material procesado y gire con cuidado solo el tejido tumoral 90° con una espátula de tejido.
   8. Coloque el disco de plástico en la mesa de corte, luego ajuste la perilla de liberación de la mesa al modo de inicio y presione el botón de reinicio para una ronda de corte final (tercera ronda).
   9. Apague la picadora y retire el disco de plástico. Limpie la picadora y las cuchillas.
   10. Con una pipeta monocanal de 5 ml, aspire el material procesado junto con el medio en la pipeta y vuelva a enjuagar la suspensión en la placa.
   11. Repita el paso anterior 2-3 veces para separar el tejido correctamente.
   12. Vuelva a colocar la placa de Petri sobre hielo y repita los pasos (4.1.1-4.1.12.) con las otras 5 placas de cada tumor.
2. Procesamiento manual del tejido tumoral (método M)
   1. Transfiera el tejido tumoral de la primera placa de Petri de plástico (paso 2.5) junto con 3 ml de medio H-GPSA (Tabla 2) a una placa de Petri de vidrio. Diseccionar el segmento manualmente bajo el microscopio en secciones de 0,5 mm con dos bisturís.
   2. Transfiera el tejido diseccionado a su placa de Petri de plástico con una pipeta de 2 ml.
   3. Repita los pasos (4.2.1.-4.2.3.) para las secciones tumorales de las otras cinco placas de Petri (paso 2.5).

5. Lavado del tejido tumoral

1. Incline cada placa de Petri hacia arriba a 45° y espere 30 s hasta que los trozos de tumor se hundan hasta el fondo de la placa.
2. Aspire 2,5 ml del medio H-GPSA (Tabla 2) con cuidado con una pipeta de 1 ml y tenga cuidado de no extraer ningún tejido tumoral.
3. Agregue 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (consulte la tabla de materiales) a cada muestra. Las piezas tumorales procesadas deben cubrirse completamente con un tampón de lisis.
4. Coloque los 6 platos en una máquina agitadora orbital de laboratorio a velocidad lenta durante 10 minutos.
5. Aspire 2 ml del tampón de lisis con cuidado para no absorber ningún tejido tumoral.
6. Repita los pasos de lavado anteriores (paso 5.1-5.5) dos veces utilizando 2 ml de medio H-GPSA (Tabla 2) en lugar de tampón de lisis cada vez.

6. Cultivo del tejido tumoral

1. Aspire el medio H-GPSA (Tabla 2) de cada plato y reemplácelo con 4 ml de medio PDO (Tabla 2).
2. Transfiera los trozos de tejido de cada plato a un pocillo respectivo de una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja (consulte la Tabla de materiales).
3. Coloque la placa en un agitador orbital dentro de una incubadora e incube a 37 °C, 5% CO₂ y 150 rpm durante 2-4 semanas.
4. Realice un cambio de medio medio cada dos días aspirando 2 mL de medio de cada pocillo y reemplazándolo con 2 mL de medio PDO fresco (Tabla 2) precalentado a 37 °C.
5. Observe el tejido bajo el microscopio (morfología, crecimiento, color medio) y corte las PDO en crecimiento (>0,7 mm) o el tejido adhesivo para prevenir la hipoxia tisular.
   1. Para ello, transfiera los PDO del pozo de fijación ultrabajo a una placa de Petri de vidrio esterilizada y utilice un bisturí para cortar. Alternativamente, los PDO adhesivos se pueden resolver aspirándolos con una pipeta de 1 ml. Tenga cuidado de no apretar las PDO y manéjelas suavemente.
6. Evalúe la formación de PDO contando la PDO cada dos días y verifique minuciosamente la morfología redonda deseada (Figura 2).

7. Fijación e incrustación de las DOP

1. Fijar dos PDOs de cada pocillo de cada paciente con formalina al 4% durante 24 h después de 6 semanas de cultivo.
2. Sumerja los PDO fijos en formalina tamponada neutramente (fosfato de sodio) hasta su inclusión.
3. Coloque cada PDO en un casete (consulte la Tabla de materiales) para su posterior procesamiento.
4. Inicie un proceso de deshidratación sumergiendo el casete en las siguientes soluciones como se menciona en la NOTA a continuación:
   NOTA: Etanol al 50% durante 20 minutos, Etanol al 70% durante 20 minutos, Etanol al 80% durante 20 minutos, Etanol al 96% durante 20 minutos, Etanol al 100% durante 20 minutos, Etanol al 100% durante 30 minutos, Etanol al 100% + cloroformo (proporción 1:1) durante 30 minutos, Cloroformo absoluto durante 30 minutos, Cloroformo absoluto durante 30 minutos, Cloroformo absoluto durante 30 minutos, Parafina durante 30 min, Parafina durante 30 min usando el STP 120.
5. Incrustar los PDO deshidratados en cera de parafina a 58-60 °C.
6. Cortar los PDO incrustados con un grosor de 2,5 μm y montarlos en portaobjetos para teñirlos.

8. Tinción de inmunofluorescencia

1. Montar las DOP después de 6 semanas de cultivo.
2. Posteriormente, se realizó doble tinción frente a la proteína ácida fibrilar glial (GFAP, dilución: 1:100) y el marcador de proliferación Ki67 (dilución: 1:1000) (ver Tabla de Materiales), como se informó previamente²².
3. Del mismo modo, se evaluará la apoptosis mediante doble tinción de PDOs frente a GFAP y anti-caspasa-3 (CC3, dilución: 1:400) (ver Tabla de Materiales).
4. Capture imágenes de las PDO utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 40x.
5. Analice las imágenes de las células positivas para GFAP, Ki67 y CC3, así como de las células doble positivas para GFAP/Ki67 y GFAP/CC3.
6. Utilice el programa de código abierto Fiji (ImageJ-win 32) para el análisis de imágenes.

9. Evaluación y análisis de datos

1. Capture imágenes microscópicas diarias de campo claro durante la primera semana de cultivo con ajustes estándar y un aumento de 5x.
2. Observe los cambios morfológicos y realice un seguimiento del proceso de maduración tanto en enfoques de procesamiento manual como automatizado.
3. Realice análisis morfológicos utilizando el microscopio en la configuración estándar del modo de campo claro.
4. Evaluar el número y la morfología de las PDO durante las primeras 4 semanas de cultivo en las PDO de los cinco pacientes.
5. Obtenga tres lecturas de cada recuento de PDO de cada paciente para calcular la media y el error estándar de la media (SEM).
6. Investigar la proliferación y apoptosis en PDOs de tres pacientes.
7. Analice los datos utilizando un paquete de software estadístico disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).
8. Aplique las pruebas T de Student-T y U de Mann-Whitney para determinar las diferencias entre la generación manual y automatizada de PDO en términos de recuento, proliferación y apoptosis de PDO.

Se incluyeron cuatro pacientes con GBM y uno con LGG después de la confirmación anatomopatológica por parte de un neuropatólogo (CMM) experimentado. La mayoría de los pacientes tenían un promotor de MGMT no metilado, y todos los pacientes con GBM eran de tipo salvaje IDH1 e IDH2 (Tabla 1). En promedio, el proceso de fabricación duró 88,8 min (+/- 6,3 min) en el enfoque C y 322 min (+/- 17,2 min) en el enfoque M. La tasa de éxito global fue del 87% en el enfoque manual y del 93% en el de chopper después de 4 semanas de cultivo (n = 5). Además, las PDOs derivadas del grupo C alcanzaron la forma redondeada deseada en 1 semana y estaban lo suficientemente maduras como para ser utilizadas en experimentos in vitro , mientras que las PDOs del grupo M permanecieron en su mayoría con bordes nítidos e indefinidos (Figura 2). El tejido tumoral procesado con el abordaje C dio como resultado un total de 281 PDO (media por paciente = 56 +/- 43) después de la primera semana de cultivo, mientras que 250 PDO (media por paciente = 50 +/- 41) se desarrollaron con el abordaje M. Durante la segunda semana de cultivo, el tejido de los cinco pacientes arrojó números más altos de PDO cuando se generaron con el abordaje C (801; Media por paciente= 130 +/- 38) en comparación con el abordaje M (601; Media por paciente= 76 +/- 44; P = 0,018). Durante la tercera semana de cultivo, el abordaje C acumuló un total de 1105 PDOs de todos los pacientes (Media por paciente = 221 +/- 32) frente a 771 PDOs (Media por paciente = 155 +/- 34) en el abordaje M (P = 0,032). Además, un total de 1195 PDOs (Media por paciente= 239 +/- 50) se formaron después de cuatro semanas de cultivo cuando se generaron con el abordaje C en comparación con 784 (Media por paciente= 157 +/- 36) utilizando el abordaje M (P < 0,01). Por lo tanto, el método C mostró un recuento significativamente mayor de DOP a partir de la segunda semana (Figura 3). Además, se evaluaron las fluctuaciones relativas en los recuentos de PDO para explorar las tendencias dinámicas entre semanas sucesivas. El análisis reveló un aumento impresionante en los recuentos de PDO durante la transición inicial de la primera a la segunda semana en el enfoque C (265%), lo que fue indicativo de un rápido progreso. Posteriormente, hubo un menor aumento en los recuentos durante la tercera semana (75%), lo que refleja un ajuste temporal. Por el contrario, el enfoque M demostró un aumento constante y constante en los recuentos de PDO (92% en la segunda semana, 67% respectivamente en la tercera semana), lo que contribuyó a una notable estabilidad en los recuentos durante la cuarta semana. Esta tendencia constante al alza en los recuentos de PDO subraya la confiabilidad y resiliencia del enfoque C a lo largo del período de observación.

Se incluyeron dos pacientes con GBM y un paciente con LGG para el análisis del número de astrocitos (GFAP) dentro de las PDO, la proliferación celular de la PDO (Ki67) y la apoptosis (CC3). El recuento de astrocitos determinado no reveló diferencias significativas entre los dos métodos de procesamiento, con un promedio del 43% en el abordaje C y del 45% en el abordaje M (Figura 4 y Figura 5, Figura 1 y Figura 2 suplementarias). Del mismo modo, las tasas de proliferación dentro de las DOP fueron comparables entre los enfoques C (3%) y M (1%). Solo las PDOs generadas con el abordaje C del paciente 5 mostraron una tasa de proliferación del 26% frente al 1% con el abordaje M (P = 0,001; Figura 4C). En general, se detectaron tasas de apoptosis bajas en las PDO procesadas con el abordaje C (3%) en comparación con el 2% del abordaje M para todos los pacientes, que no fueron significativamente diferentes (Figura 5C). Además, no hubo diferencias significativas entre los dos métodos en cuanto al número de astrocitos sometidos a apoptosis (Figura 5D).

Figura 1: Descripción gráfica del proceso de fabricación de organoides derivados del paciente (PDO) utilizando una picadora automatizada frente a un enfoque manual. La ilustración muestra los diversos pasos involucrados, incluyendo (A) recolección de muestras, (B) disección del material tumoral, (C) lavado y (D) incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Morfología de la DOP durante la primera semana de cultivo. Comparación de la formación de PDOs después de la disección utilizando tanto el picador automatizado como el método manual. Barras de escala = 1000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Recuento de PDO durante las primeras cuatro semanas de cultivo. El eje x muestra el tiempo en semanas (W) y el eje y el número de PDO de los enfoques C (azul) y M (rojo) (n = 5). Cada punto de datos representa el recuento de la media, con barras de error que indican el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tasas de proliferación celular dentro de las PDO. (A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia (n = 3) de células positivas para GFAP (verde), células positivas para Ki67 (rojo) y DAPI (azul) en las PDO de los pacientes 3, 4 y 5 (Tabla 1). Todas las DOP se procesaron utilizando los métodos chopper (C) y manual (M). Barras de escala = 100 μm. (B) Comparación de los dos métodos con respecto al número relativo de células positivas para GFAP, (C) células positivas para Ki67 y (D) células positivas para Ki67/GFAP. Los resultados no significativos se indican con "ns". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Tasas de apoptosis dentro de las PDO. (A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia (n = 3) de células positivas para GFAP (verde), células positivas para CC3 (rojo) y DAPI (azul) en las PDO de los pacientes 3, 4 y 5 (Tabla 1). Todas las DOP se procesaron utilizando los métodos chopper (C) y manual (M). Barras de escala = 100 μm. (B) Comparación de los dos métodos con respecto al número relativo de células positivas para GFAP, (C) células positivas para CC3 y (D) células positivas para CC3/GFAP dobles. Los resultados no significativos se indican con "ns". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Características y parámetros clínicos de los pacientes. GBM = glioblastoma de tipo IDH natural, grado 4 de la OMS en el SNC; LGG = glioma de bajo grado; KPS = puntuación de rendimiento de Karnofsky; MGMT = O 6-metilguanina-ADN metiltransferasa; IDH1 = isocitrato deshidrogenasa 1, IDH2 = isocitrato deshidrogenasa 2, ATRX = α-talasemia/retraso mental, gen ligado al cromosoma X; M = morfología; CC = recuento de células; p = proliferación; A = apoptosis. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Composiciones medias. H-GPSA = Hibernar A-Glutamax pencillin estreptomicina anfotericina B. PDO = Organoides derivados del paciente DMEM: Medio de águila modificado de Dulbecco. NEAA: aminoácidos no esenciales. Estreptococo de la pluma: Penicilina / Estreptomicina Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Resumen de las técnicas utilizadas para generar modelos de cultivo celular. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Canales individuales de tinción de proliferación de PDOs. (A) DAPI (azul), (B) células positivas para GFAP (verde), (C) células positivas para Ki67 (rojo) y (D) canal de superposición en PDO de pacientes 3, 4 y 5. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Canales individuales de tinción por apoptosis de PDOs. (A) DAPI (azul), (B) células positivas para GFAP (verde), (C) células positivas para CC3 (rojo) y (D) canal de superposición en PDO de los pacientes 3, 4 y 5. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.