Imágenes en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y la exocitosis en espermatozoides de ratón vivos

Resumen

El modelo de ratón AcroSensE y los métodos de obtención de imágenes de células vivas descritos aquí proporcionan un nuevo enfoque para estudiar la dinámica del calcio en el compartimento subcelular del acrosoma, el espermatozoide, y cómo regulan los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.

Resumen

La exocitosis acrosómica (EA), en la que la única vesícula exocitótica del espermatozoide se fusiona con la membrana plasmática, es un proceso complejo dependiente del calcio esencial para la fertilización. Sin embargo, nuestra comprensión de cómo la señalización del calcio regula la EA aún es incompleta. En particular, la interacción entre la dinámica del calcio intraacrosómica y los pasos intermedios que conducen a la EA no está bien definida. Aquí, describimos un método que proporciona información espacial y temporal sobre la dinámica del calcio acrosómico y su relación con la fusión de la membrana y la posterior exocitosis de la vesícula acrosómica. El método utiliza un nuevo ratón transgénico que expresa un sensor de exocitosis dirigido a acrosomas (AcroSensE). El sensor combina un indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP) fusionado con mCherry. Esta proteína de fusión fue diseñada específicamente para permitir la observación simultánea de la dinámica del calcio acrosómico y los eventos de fusión de membrana. La monitorización en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y de los EA en espermatozoides vivos de AcroSensE se logra mediante una combinación de imágenes de alta velocidad de fotogramas y un sistema de administración de estimulantes que puede dirigirse a un solo espermatozoide. Este protocolo también proporciona varios ejemplos de métodos básicos para cuantificar y analizar los datos sin procesar. Debido a que el modelo AcroSensE está codificado genéticamente, su importancia científica puede aumentarse mediante el uso de herramientas genéticas fácilmente disponibles, como el cruzamiento con otros modelos genéticos de ratón o métodos basados en la edición de genes (CRISPR). Con esta estrategia, se pueden resolver los roles de las vías de señalización adicionales en la capacitación y fertilización de los espermatozoides. En resumen, el método descrito aquí proporciona una herramienta conveniente y efectiva para estudiar la dinámica del calcio en un compartimento subcelular específico, el acrosoma, y cómo esa dinámica regula los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.

Introducción

Los espermatozoides adquieren la capacidad de fertilizar durante un proceso llamado capacitación¹. Un punto final de este proceso es que los espermatozoides adquieren la capacidad de sufrir EA. Más de dos décadas de datos respaldan la presencia de un modelo complejo y de varios pasos de EA en espermatozoides de mamíferos (resumido en ^2,3). Sin embargo, el estudio de la EA en espermatozoides vivos es un reto, y los métodos disponibles actualmente para monitorizar este proceso con una resolución adecuada son engorrosos y requieren múltiples pasos de preparación⁴, s....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo las pautas y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cornell (#2002-0095). Para el presente estudio se utilizaron ratones AcroSensE² de 8-10 semanas de edad. Las solicitudes de información sobre la disponibilidad de los ratones AcroSensE pueden enviarse al autor correspondiente.

1. Recolección y lavado de esperma

1. Recolectar espermatozoides del epidídimo de la cola (se proporcionan más detalles sobre este procedimiento en¹¹) de ratones AcroSensE. Espere 15 m....

Resultados

La Figura 2 proporciona una ilustración simplificada que muestra la secuencia de cambios de fluorescencia esperados después de la estimulación exitosa de los espermatozoides. El panel superior de la Figura 2 ilustra los cambios en la intensidad de la fluorescencia de GCaMP3, donde la señal es inicialmente tenue (las concentraciones de calcio acrosómica basales son más bajas que las de GCaMP3 KD), y tras la entrada de iones de calcio a través de los poro.......

Discusión

Aquí, se describe un método basado en microscopía para utilizar el modelo de ratón AcroSensE recientemente generado para el monitoreo y análisis en tiempo real de una sola célula de la interacción entre la dinámica del calcio acrosómico y los pasos intermedios que conducen a la EA. Junto con los enfoques genéticos fácilmente disponibles, como el cruzamiento con otros modelos genéticos de ratón o la edición de genes, este modelo y método proporcionan un poderoso sistema para estudiar el papel de varios componentes y vías .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Objetivo de aceite 100x	Olympus Japan
	Sigma	C0926
Plato deslizante de 35 mm, espesor 1,5	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
Tubo de fondo redondo de 5 mL	Falcon	352054
Vidrio de borosilicato capilarries	Sutter Instrument Co., CA, EE. UU.	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Microscopio confocal	Olympus Japón	Olympus FluoView
Glucosa	Sigma	G7528
Punta graduada	TipOne, EE. UU. Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	Institutos Nacionales de Salud		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Ácido láctico	Sigma	G5889
Sistemas de incubación de microscopio de células vivas	TOKAI HIT Shizuoka, Japón	Modelo STX
MgCl2	Sigma	M8266
Extractor de micropipetas	Sutter Instrument Co., CA, EE. UU.	Modelo P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Pipeta de transferencia de plástico	FisherBrand	13-711-6M
	Sigma	P7280
Ácido pirúvico	Sigma	107360
Sistema de administración de celda única	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III

UPlanApo,2-hidroxipropil-b-ciclodextrina Poly-D-lisina