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Cuantificación de la tasa de colonización de hongos micorrízicos arbusculares en el estudio de plantas exóticas invasoras

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DOI:

10.3791/65971

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1 de diciembre de 2023

 ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un enfoque simple y fácil de usar para determinar la tasa de colonización de hongos micorrízicos arbusculares (HMA) en las raíces de plantas invasoras.

Resumen

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) son hongos del suelo ampliamente distribuidos en los ecosistemas y pueden formar asociaciones simbióticas (micorrizas) con las raíces de la mayoría de las plantas terrestres. Las plantas proporcionan fuentes de carbono a los HMA a través de asociaciones micorrícicas, mientras que las hifas de HMA pueden ampliar el rango de absorción de nutrientes por las raíces y promover la absorción de nutrientes por parte de las plantas. Hay muchas especies diferentes de HMA, y las relaciones simbióticas entre las diferentes especies de HMA y las diferentes plantas varían. Las plantas invasoras pueden enriquecer las especies de HMA con mejores capacidades simbióticas a través de los exudados de las raíces, promoviendo su crecimiento y, por lo tanto, aumentando su colonización en las raíces de las plantas invasoras. Al mismo tiempo, las plantas invasoras también pueden alterar la relación simbiótica entre los HMA y las plantas nativas, afectando a la comunidad vegetal local, que es uno de los mecanismos para una invasión exitosa de plantas. La tasa de colonización de HMA en las raíces de plantas invasoras y nativas refleja indirectamente el papel de HMA en el proceso de invasión de plantas invasoras. En este método, las raíces de las plantas recolectadas se pueden procesar directamente o guardar en un fijador para un procesamiento posterior por lotes. A través de la decoloración, la acidificación, la tinción y el tratamiento decolorante de las raíces, se pueden observar claramente las hifas, las esporas y las estructuras arbusculares de la HMA en el sistema radicular. Este método se puede completar en un laboratorio básico para observar y calcular la tasa de colonización de HMA en los sistemas radiculares de plantas invasoras.

Introducción

Los hongos micorrícicos son prevalentes en los ecosistemas naturales y establecen relaciones simbióticas con las raíces de la mayoría de las plantas, formando micorrizas1. Estas asociaciones son mutuamente beneficiosas, ya que las plantas proporcionan compuestos de carbono fijados fotosintéticamente, como ácidos grasos y azúcares, para apoyar el crecimiento de hongos micorrícicos, mientras que los hongos son recíprocos suministrando nutrientes minerales como fósforo y nitrógeno a las plantas huésped, promoviendo asíel crecimiento de las plantas. Según sus tipos de micorrizas formados con las raíces de las plantas, los hongos micorrícicos se pueden dividir en cuatro tipos principales: hongos ectomicorrícicos (ECM), hongos micorrícicos ericoides, hongos micorrícicos de orquídeas (ORM) y hongos micorrícicos arbusculares (AM)1. Entre ellos, los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) tienen la distribución más amplia y pueden formar asociaciones micorrícicas con más del 80% de las especies de plantas 3,4.

Los HMA desempeñan un papel crucial en la mejora del ciclo de nutrientesdel suelo 5, la mejora de la absorción de nutrientes de las plantas6 y la regulación de la competencia y la sucesión de las plantas. Desempeñan un papel importante en el proceso de invasión de especies vegetales invasoras 7,8. HMA, clasificada bajo el filo Mucoromycota9, abarca más de 250 especies10. Las relaciones simbióticas específicas entre las diferentes especies de HMA y las diferentes plantas pueden variar. Las especies de plantas invasoras tienen el potencial de alterar la diversidad de HMA y promover el enriquecimiento de las especies de HMA con mejores capacidades simbióticas que contribuyen a su ventaja competitiva durante el crecimiento y la colonización 8,11,12,13. Comprender la dinámica de los HMA y sus interacciones con las especies de plantas invasoras es esencial para comprender los mecanismos subyacentes a las invasiones de plantas y sus impactos ecológicos.

Los estudios cualitativos de las especies de HMA suelen implicar dos métodos principales. Una de ellas es la identificación morfológica, como la recolección de esporas de HMA del suelo utilizando métodos como el tamizado húmedo y la centrifugación de sacarosa, seguida de la clasificación y cuantificación de las esporas en función de su morfología14. El otro método involucra técnicas moleculares, amplificando regiones conservadas de genes de HMA y secuenciarlas para su identificación15. Sin embargo, estos métodos a menudo requieren una amplia experiencia en identificación morfológica o mayores recursos financieros. Por otro lado, los estudios cuantitativos de las tasas de colonización por HMA, aunque no pueden determinar los cambios en las especies y la composición de HMA, proporcionan una evaluación completa de la relación simbiótica entre HMA y las plantas. Estos estudios son indispensables tanto en la investigación básica como en el posterior trabajo de validación de los experimentos de inoculación.

La colonización de HMA desempeña un papel crucial en la determinación de la distribución de los recursos entre las especies de plantas coexistentes7. Refleja el establecimiento y la fuerza de la relación simbiótica entre los HMA y las raíces de las plantas hospederas. En el mismo hábitat, las especies de plantas invasoras a menudo exhiben tasas de colonización más altas en comparación con las plantas nativas16,17. Esta colonización mejorada de HMA contribuye a la invasión exitosa de especies invasoras como Ambrosia artemisiifolia18, Solidago canadensis19, Sapium sebiferum20, Ageratina adenophora21, Sphagneticola trilobata22 y Flaveria bidentis7. Comprender la tasa de colonización de HMA en las raíces de las plantas invasoras proporciona una base para desentrañar los mecanismos microbianos del suelo que subyacen a la invasión exitosa de estas especies. La investigación de la tasa de colonización de HMA en las raíces de las plantas invasoras arroja luz sobre las implicaciones ecológicas de las interacciones entre plantas y microbios y contribuye a nuestra comprensión de los mecanismos que impulsan las invasiones de plantas.

La determinación de la tasa de colonización por HMA implica una técnica de microscopía de tinción, que incluye varios pasos: preservación de la raíz, clarificación, acidificación, tinción, decoloración y examen microscópico (Figura complementaria 1). En las últimas décadas, los investigadores han explorado varios métodos de observación para la HMA y han desarrollado varias técnicas de tinción. En las primeras etapas, la tinción con azul de tripán fue ampliamente utilizada23,24. Sin embargo, este método tiene limitaciones debido a la toxicidad del azul de tripán. La tinción ácida con fucsina, por otro lado, es un método comúnmente utilizado que proporciona colores brillantes y muestra resultados de tinción confiables y estables25. Además, la solución de tinción se puede reutilizar, lo que la hace más rentable. La tasa de colonización se determina utilizando el método de intersección de líneas de cuadrícula, que proporciona resultados estadísticos más objetivos en comparación con otros enfoques26. Este método se caracteriza por su simplicidad, bajo costo y requisitos mínimos de equipo, lo que lo hace factible para su realización en entornos básicos de laboratorio. Ofrece un enfoque práctico y accesible para evaluar la tasa de colonización de HMA y contribuye a nuestra comprensión de las asociaciones simbióticas entre HMA y las raíces de las plantas.

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Protocolo

Realizamos experimentos utilizando una planta invasora , F. bidentis , y una planta nativa, Setaria viridis. Ambas plantas se cultivaron en parcelas experimentales en la Base Piloto de Investigación Científica Langfang de la Academia China de Ciencias Agrícolas (CAAS), Hebei, China. Cada especie de planta se plantó individualmente en parcelas separadas, cada parcela de 2 m x 3 m y un espacio de 1 metro entre parcelas. Las plantas se dejaron crecer de forma natural y, después de aproximadamente dos meses, se recolectaron muestras de raíces.

1. Preparación y conservación de la raíz

  1. Para cada parcela, seleccione al azar tres plantas con condiciones de crecimiento similares. Afloje la tierra alrededor de las plantas con una pala y saque suavemente las plantas. Después de sacudir la tierra de las raíces, corte todo el sistema de raíces y llévelo al laboratorio. Frote las muestras de raíz recolectadas completamente bajo agua corriente y mezcle las raíces de tres plantas dentro de la misma parcela para formar una réplica.
    NOTA: Para facilitar la descripción del proceso operativo, este protocolo proporciona instrucciones para una réplica biológica. Para garantizar la fiabilidad de los resultados experimentales, se recomienda recoger muestras de al menos tres réplicas biológicas de acuerdo con el diseño experimental durante las operaciones reales.
  2. Usa un papel de filtro para eliminar el exceso de humedad de las raíces limpias y déjalas secar al aire.
  3. Use tijeras para recortar las raíces dañadas, corte las raíces finas intactas y consérvelas para almacenarlas o continúe con el siguiente paso. Si continúa con el siguiente paso dentro de los 2 días, guárdelos en un refrigerador a 4 ° C. Para preservar las muestras de raíz para su uso posterior, guárdelas en una solución fijadora, como la solución de formalina-aceto-alcohol (FAA, 5 mL de formalina al 38% + 5 mL de ácido acético + 90 mL de alcohol al 70%).
    NOTA: El fijador de la FAA NO es obligatorio. Si solo hay un pequeño número de muestras y puede teñir y contar las raíces dentro de un corto período después de la recolección, omita el paso de fijación FAA y proceda directamente después de lavar la tierra de las raíces. Cuando use un fijador FAA, asegúrese de que la operación se realice en un área bien ventilada debido a la presencia de formaldehído.

2. Tinción de las raíces

  1. Retire las raíces preservadas de la solución de almacenamiento y enjuague las raíces. Coloque las raíces en un vaso de precipitados de 100 ml y agregue aproximadamente 50 ml de solución de KOH al 10% (10 g de KOH + 100 ml de agua), asegurándose de que todas las raíces estén completamente sumergidas en la solución. Calentar el vaso a 90 °C durante 30 min.
    NOTA: Ajuste el tiempo de calentamiento en función de la madurez de las raíces. Este paso elimina los pigmentos de las raíces, haciéndolas transparentes para la observación microscópica.
  2. Vierta la solución de KOH del vaso de precipitados y enjuague suavemente la muestra de raíz con agua del grifo de 3 a 6 veces para eliminar cualquier resto de KOH. Vierte el exceso de agua.
    NOTA: Asegúrese de que el vaso de precipitados y todas las herramientas utilizadas se limpien a fondo de los residuos de KOH, ya que cualquier resto puede resultar en una acidificación incompleta en el siguiente paso, lo que afecta la eficacia de la tinción del ácido fucsina.
  3. Agregue una solución de HCl al 2% al vaso de precipitados, asegurándose de que el líquido cubra completamente las raíces. Deje que las raíces se remojen en la solución ácida a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  4. Deseche la solución de HCl del vaso de precipitados y añada unos 50 ml de solución de fucsina ácida al 0,01 % (874 mL de ácido láctico, 63 mL de glicerol, 63 mL de agua destilada, 0,1 g de fucsina ácida). Teñir las raíces a 90 °C durante 20-60 min. Después de la tinción, la solución ácida de fucsina se puede recuperar y reutilizar para futuras tinciones.
    NOTA: El tiempo de tinción puede variar según la edad y la condición de las raíces, y las raíces más jóvenes y tiernas pueden requerir tinción durante la noche a temperatura ambiente.

3. Decoloración y microscopía

  1. Coloque las raíces teñidas en aproximadamente 50 ml de solución de ácido láctico (85%) para eliminar el ácido fucsina de las células de la raíz. El tratamiento de separación dará como resultado que los tejidos de HMA se tiñan de rojo, mientras que las células de la raíz permanecen incoloras o coloreadas de rojo claro. El cilindro central puede aparecer en rojo.
  2. Observe los tejidos de la raíz y los tejidos fúngicos bajo un microscopio de 200x para garantizar una clara distinción antes de detener la decoloración. Cuando la estructura de AMF y las células de la raíz pudieron distinguirse claramente, se pudo completar el proceso de decoloración.
    NOTA: Ajuste el tiempo de decoloración en función de la madurez de la raíz. Durante el proceso, seleccione algunas raíces para la preparación de la calabaza para observarlas bajo un microscopio.
  3. Retire las raíces de la solución de ácido láctico y transfiéralas a aproximadamente 50 ml de solución de glicerol (99%). La fucsina ácida en la estructura de HMA y las células de la raíz ya no se separará y se puede usar para el examen microscópico posterior.
  4. Coloque una gota de glicerol en un portaobjetos de vidrio. Para cada réplica, seleccione al azar de 30 a 50 raíces, corte segmentos de raíz de 1 cm de largo de cada raíz. Colóquelos en portaobjetos de vidrio con glicerol, paralelos al lado corto del portaobjetos, y colóquelos paralelos entre sí (Figura complementaria 1). Coloque 10 secciones de raíz en cada portaobjetos, lo que da como resultado de 3 a 5 réplicas para cada réplica.
    NOTA: Este paso describe el número de segmentos raíz utilizados para la observación, refiriéndose al número de réplicas técnicas para cada réplica. El número de segmentos de raíz observados para cada muestra debe organizarse razonablemente en función de la especie de planta y la morfología de la raíz. Para raíces finas, es suficiente observar 30-50 segmentos de raíz, cada uno de 1 cm de largo, por muestra. Sin embargo, para raíces más grandes, como las del maíz, es necesario aumentar adecuadamente el número de observaciones. Para garantizar la fiabilidad de los resultados estadísticos, cada tratamiento debe tener al menos 3 réplicas biológicas, y cada réplica biológica debe ser operada siguiendo el método antes mencionado.
  5. Cubra con un cubreobjetos. Después de colocar el cubreobjetos, evite mover horizontalmente las muestras para evitar cualquier roce o deformación de las raíces. Esto asegura que el estado normal de la morfología de las hifas se pueda observar sin interferencias, manteniendo así la precisión de los cálculos de la tasa de colonización.
  6. Usando un microscopio de 200x, emplee el método de conteo cruzado para determinar la tasa de colonización con referencia al diagrama esquemático (Figura suplementaria 2).
    1. Instale un micrómetro con retícula en el ocular del microscopio. Mueva el campo de visión a un extremo de la raíz y alinee uno de los puntos de mira paralelo a la raíz. Observa si la otra línea se cruza con las hifas, los arbúsculos o las vesículas.
    2. Mueva el campo de visión a lo largo de la dirección de la raíz hasta el otro extremo, moviéndose la misma distancia cada vez en función de las coordenadas de la platina del microscopio. Registre las intersecciones en cada campo de visión utilizando un enfoque binario (0 o 1). Si el otro punto de mira se cruza con hifas, arbúsculos o vesículas de HMA, se registra como 1 en la celda correspondiente de la tabla. De lo contrario, se registra como 0. Si no hay intersecciones con ninguna de las estructuras AMF, se registra como 1 en el área negativa. Observe 10 campos de visión para cada segmento de raíz, para un total de 100 observaciones se obtienen por portaobjetos, lo que resulta en 300 a 500 observaciones por muestra de planta.

4. Cálculo de la tasa de colonización

  1. Sobre la base del número registrado de intersecciones con hifas (H), arbúsculos (A) y vesículas (V) y no micorrícicos (N) en las 10 raíces de cada portaobjetos (como se muestra en la Tabla 1), calcule las tasas de colonización de la siguiente manera:

    Tasa de colonización de hifos = (AH / A T) × 100%
    Tasa de colonización arbuscular = (AA / A T) × 100%
    Tasa de colonización vesicular = (A,V / A,T) × 100%
    Tasa total de colonización = [(AT - AN) / AT] × 100%

    Dónde:
    AH: Número de intersecciones con hifas
    AA: Número de intersecciones con arbúsculos
    AV: Número de intersecciones con vesículas
    AT: Número total de intersecciones
    AN: Número de intersecciones con raíces no micorrícicas

    Estos cálculos proporcionan las tasas de colonización de cada estructura (hifas, arbúsculos y vesículas) y la tasa de colonización general, que es la suma de las tasas de colonización de todas las estructuras.
TratamientoDiapositivaNúmero de intersecciones
NegativoHifasArbúsculosVesículasTotal
Ejemplo 1Diapositiva 1AN1AH1AA1AV1AT1
Diapositiva 2AN2AH2AA2AV2AT2
Diapositiva 3AN3AH3AA3AV3AT3
TotalANAHAAUnaVUnaT

Tabla 1: Tabla estadística de tasas de colonización de hongos micorrízicos arbusculares. Abreviaturas: AH = Número de intersecciones con hifas; AA = Número de intersecciones con arbúsculos; AV = Número de intersecciones con vesículas; AT = Número total de intersecciones; AN = Número de intersecciones con raíces no micorrizadas.

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Resultados

Los resultados de la tinción de las raíces de las plantas invasoras utilizando este método se muestran en la Figura 1. Las estructuras (hifas, arbúsculos, esporas y vesículas) de la HMA se tiñen de rojo, las células de la corteza de la raíz se tiñen de rojo claro después de la decoloración y el cilindro central se tiñe de rojo. Este resultado de tinción es suficiente para distinguir las estructuras fúngicas, ya que la HMA existe principalmente en la corteza de la planta. A partir del resulta...

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Discusión

Las interacciones entre las plantas invasoras y los HMA son complejas y diversas. El estudio de estas interacciones es crucial para comprender el éxito de las plantas invasoras y sus efectos ecológicos. Pueden influir en la capacidad invasora de las plantas, la estructura y función de los ecosistemas del suelo y la competitividad de las plantas nativas. La tasa de colonización sirve como un indicador importante para estudiar la relación entre las plantas invasoras y los HMA. Proporciona ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFD1400100, 2021YFC2600400 y 2022YFC2601100), y por la Fundación Nacional de Ciencias de China (42207162).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
70% de alcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdR433197
solución de ácido acéticoShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA116166
Ácido fucsinaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA104917
solución de formaldehído, FormalinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdF111941
GlicerolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdG116203
Ácido clorhídrico, HClShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdH399657
Ácido lácticoShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdL432769
Microscopio de sistema manual BX43Olympus (China) co., Ltd
Potasio hidróxido, KOHShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdP112284

Referencias

  1. Genre, A., Lanfranco, L., Perotto, S. Unique and common traits in mycorrhizal symbioses. Nat Rev Microbiol. 18 (11), 649-660 (2020).
  2. Shi, J., Wang, X., Wang, E. Mycorrhizal symbiosis in plant growth and stress adaptation: from genes to ecosystems. Annu Rev Plant Biol. 74, 569-607 (2023).
  3. Evelin, H., Devi, T. S., Gupta, S., Kapoor, R. Mitigation of salinity stress in plants by arbuscular mycorrhizal symbiosis: current understanding and new challenges. Front Plant Sci. 10, 470(2019).
  4. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal symbiosis. , Academic press. (2010).
  5. Bender, S. F., Conen, F., Heijden, M. vd Mycorrhizal effects on nutrient cycling, nutrient leaching and N2O production in experimental grassland. Soil Biol Biochem. 80, 283-292 (2015).
  6. Shen, K., et al. AM fungi alleviate phosphorus limitation and enhance nutrient competitiveness of invasive plants via mycorrhizal networks in Karst Areas. Front Ecol Evol. 8, 125(2020).
  7. Zhang, F. J., et al. Arbuscular mycorrhizal fungi facilitate growth and competitive ability of an exotic species Flaveria bidentis. Soil Biol Biochem. 115, 275-284 (2017).
  8. Zhang, F., et al. AM fungi facilitate the competitive growth of two invasive plant species, Ambrosia artemisiifolia and Bidens pilosa. Mycorrhiza. 28 (8), 703-715 (2018).
  9. Spatafora, J. W., et al. A phylum-level phylogenetic classification of zygomycete fungi based on genome-scale data. Mycologia. 108 (5), 1028-1046 (2016).
  10. Tedersoo, L., et al. High-level classification of the fungi and a tool for evolutionary ecological analyses. Fungal Diversity. 90 (1), 135-159 (2018).
  11. Meinhardt, K. A., Gehring, C. A. Disrupting mycorrhizal mutualisms: a potential mechanism by which exotic tamarisk outcompetes native cottonwoods. Ecol Appl. 22 (2), 532-549 (2012).
  12. Dong, L. J., Ma, L. N., He, W. M. Arbuscular mycorrhizal fungi help explain invasion success of Solidago canadensis. Appl Soil Ecol. 157, 103763(2021).
  13. Ramana, J. V., Tylianakis, J. M., Ridgway, H. J., Dickie, I. A. Root diameter, host specificity and arbuscular mycorrhizal fungal community composition among native and exotic plant species. New Phytol. 239 (1), 301-310 (2023).
  14. Mertz, S. M., Heithaus, J. J., Bush, R. L. Mass production of axenic spores of the endomycorrhizal fungus Gigaspora margarita. Trans British Mycol Soc. 72 (1), 167-169 (1979).
  15. Renker, C., Heinrichs, J., Kaldorf, M., Buscot, F. Combining nested PCR and restriction digest of the internal transcribed spacer region to characterize arbuscular mycorrhizal fungi on roots from the field. Mycorrhiza. 13 (4), 191-198 (2003).
  16. Bunn, R. A., Ramsey, P. W., Lekberg, Y. Do native and invasive plants differ in their interactions with arbuscular mycorrhizal fungi? A meta-analysis. J Ecol. 103 (6), 1547-1556 (2015).
  17. Majewska, M. L., Rola, K., Zubek, S. The growth and phosphorus acquisition of invasive plants Rudbeckia laciniata and Solidago gigantea are enhanced by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 27 (2), 83-94 (2017).
  18. Huang, D., Sang, W. G., Zhu, L., Song, Y. Y., Wang, J. P. Effects of nitrogen and carbon addition and arbuscular mycorrhiza on alien invasive plant Ambrosia artemisiifolia. Chinese J Appl Ecol. 21 (12), 3056-3062 (2010).
  19. Zhang, Q., et al. Positive feedback between mycorrhizal fungi and plants influences plant invasion success and resistance to invasion. PLoS ONE. 5 (8), e12380(2010).
  20. Yang, Q., Li, B., Siemann, E. Positive and negative biotic interactions and invasive Triadica sebifera tolerance to salinity: a cross-continent comparative study. Oikos. 124 (2), 216-224 (2015).
  21. Li, L. Q., et al. Arbuscular mycorrhizal fungi enhance invasive plant, Ageratina adenophora growth and competition with native plants. Chinese J Ecol. 35 (1), 79-86 (2016).
  22. QI, S. S., et al. Effects of arbuscular mycorrhizal fungi on the growth and the competition of an invasive plant Wedelia trilobata. Microbiol China. 47 (11), 3801-3810 (2020).
  23. Phillips, J. M., Hayman, D. S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans British Mycol Soc. 55 (1), 158-161 (1970).
  24. Koske, R. E., Gemma, J. N. A modified procedure for staining roots to detect VA mycorrhizas. Mycol Res. 92 (4), 486-488 (1989).
  25. Kormanik, P. P., Bryan, W. C., Schultz, R. C. Procedures and equipment for staining large numbers of plant root samples for endomycorrhizal assay. Can J Microbiol. 26 (4), 536-538 (1980).
  26. McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective measure of colonization of roots by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol. 115 (3), 495-501 (1990).
  27. Souza, T. Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , Springer International Publishing. Switzerland. (2015).
  28. Chandwani, S., Maiti, S., Amaresan, N. Microbial Symbionts. , Academic Press. (2023).
  29. Piercey, M. M., Graham, S. W., Currah, R. S. Patterns of genetic variation in Phialocephala fortinii across a broad latitudinal transect in Canada. Mycol Res. 108 (Pt 8), 955-964 (2004).
  30. Jumpponen, A. R. I., Trappe, J. M. Dark septate endophytes: a review of facultative biotrophic root-colonizing fungi. New Phytol. 140 (2), 295-310 (1998).
  31. Du, E., et al. Rhizoglomus intraradices and associated Brevibacterium frigoritolerans enhance the competitive growth of Flaveria bidentis. Plant Soil. 453, 281-295 (2020).
  32. Wang, S. Y., et al. Practical methods for arbuscular mycorrhizal fungal spore density, hyphal density and colonization rate of AMF. Bio-protocol. 101, e2104253(2022).
  33. Sheng, P., Liu, R., Li, M. Methodological comparison of observation and colonization measurement of arbuscular mycorrhizal fungi. MYCOSYSTEMA. 30 (4), 519-525 (2011).
  34. Grace, C., Stribley, D. P. A safer procedure for routine staining of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. Mycol Res. 95 (10), 1160-1162 (1991).
  35. Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piche, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).
  36. Vierheilig, H., Schweiger, P., Brundrett, M. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiol Plant. 125 (4), 393-404 (2005).
  37. Dalpé, Y., Séguin, S. M. Microwave-assisted technology for the clearing and staining of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Mycorrhiza. 23, 333-340 (2013).
  38. Biermann, B., Linderman, R. G. Quantifying vesicular-arbuscular mycorrhizae: a proposed method towards standardization. New Phytol. 87 (1), 63-67 (1981).
  39. Bethlenfalvay, G. J., Pacovsky, R. S., Brown, M. S. Measurement of mycorrhizal infection in soybeans. Soil Sci Soc Am J. 45 (5), 871-875 (1981).

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