Una guía práctica para la evolución casi continua asistida por fagos y robótica

PRANCE es una combinación de dos poderosas técnicas de evolución dirigida. La primera es PACE¹, una técnica molecular que acopla rondas de diversificación y selección de genes al ciclo de vida rápido del bacteriófago M13, lo que permite que se produzcan rondas rápidas de evolución de forma continua en el cultivo de fagos líquidos. Esta selección está impulsada por el uso de un circuito genético codificado por plásmidos que acopla la función de la proteína en evolución a la expresión de pIII, la proteína de la capa de la cola de M13, que es necesaria para la propagación de fagos, esto se ilustra en la Figura 1. A nivel experimental, la dilución continua del cultivo líquido de fagos permite una selección continua. Por lo tanto, la rigurosidad de la selección puede modularse tanto a nivel del circuito génico como a nivel experimental mediante el control de la velocidad de dilución del cultivo de fagos. Por lo tanto, PACE se puede aplicar a cualquier desafío de ingeniería de biomoléculas para el que exista un sensor molecular que pueda detectar la actividad deseada en la bacteria E. coli para inducir la expresión de pIII. Las aplicaciones incluyen la evolución de la unión proteína-proteína ^2,3,4, la unión proteína-ADN⁵, la solubilidad proteica⁶ y numerosas funciones enzimáticas específicas⁷. En segundo lugar está la Evolución ^8,9 acelerada por la robótica, que utiliza un controlador de retroalimentación para eliminar dos modos de falla comunes de la evolución dirigida: la extinción, que ocurre cuando el entorno es demasiado estricto, y la falta de evolución, que ocurre cuando el entorno es demasiado indulgente. A diferencia del paso en serie de fagos que se realiza en PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)^7,10, la evolución "casi continua" acelerada por la robótica implica un pipeteo rápido que mantiene los cultivos en la fase media de registro, lo que permite a las poblaciones experimentar ciclos continuos de infección y propagación. Cuando estas dos tecnologías se utilizan juntas, se denominan PRANCE, por Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution⁸, que permite una evolución continua robusta, multiplexada y rápida. PRANCE se ha utilizado para evolucionar polimerasas, ARNt y amino-acil ARNt sintetasas y para realizar un control de retroalimentación durante esas evoluciones para mejorar su velocidad y confiabilidad⁸.

Hay varios detalles de la configuración de hardware y software de PRANCE que permiten el uso de bacteriófagos en un robot de manipulación de líquidos. En lugar de utilizar el software predeterminado proporcionado por el fabricante del robot, utilizamos un paquete de software de código abierto basado en python¹¹, que permite una ejecución rápida y concurrente y, por lo tanto, la capacidad de mantener los biorreactores semicontinuos en la fase intermedia de registro. El tiempo de intervención del investigador puede extenderse a varios días haciendo que varios componentes en cubierta se autoesterilizen de forma rutinaria, y esto se logra con el control automático de las bombas que pueden blanquear y enjuagar estos componentes. La contaminación cruzada de fagos se puede eliminar mediante el uso de un robot de manipulación de líquidos que no utilice puntas de ajuste forzado y un ajuste cuidadoso de la configuración de manipulación de líquidos.

1. Configuración del hardware

NOTA: Consulte la Figura 2 para obtener una descripción general de los componentes de hardware de un sistema PRANCE y la Figura 3 para ver fotos de estos componentes ensamblados físicamente.

1. Obtenga el hardware principal para el sistema PRANCE, incluido un instrumento de manejo de líquidos, un lector de placas y bombas auxiliares.
   NOTA: Todos los sistemas PRANCE hasta la fecha se han implementado en instrumentos de manejo de líquidos medianos a grandes equipados con brazos de pipeteo de 8 canales direccionables individualmente, un brazo de pipeteo de un solo pistón de 96 puntas, una pinza robótica para placas móviles, una estación de lavado integrada para la esterilización de puntas y un lector de placas integrado capaz de realizar mediciones de absorbancia y luminiscencia.
2. Configure las estrategias de calentamiento en función del modelo y las características del robot de manipulación de líquidos. Utilice un portaplacas calefactadas o un robot climatizador mediado por calefactor.
3. Establezca una estación de lavado de puntas para permitir la reutilización de las puntas.
   NOTA: Hasta la fecha, los sistemas PRANCE han utilizado estaciones de lavado estándar, aunque, en principio, este componente podría construirse fácilmente a partir de componentes de bajo costo.
4. Establecer una fuente de cultivo bacteriano mantenida en fase logarítmica mediante la instalación de un biorreactor en tiempo real que funcione a 37 °C como quimiostato/turbidostato. Alternativamente, detener un cultivo bacteriano en fase logarítmica de al menos 1 L de volumen precultivado a 37 °C en fase logarítmica (DO₆₀₀ entre 0,25 y 0,45) a 4 °C en un refrigerador cercano. Asegúrese de que el cultivo, ya sea frío o tibio, se agite regularmente utilizando una placa agitadora o una placa de agitación para evitar la sedimentación.
5. Configure las bombas preferidas para la integración robótica con el software y los controladores necesarios. Implemente el software para permitir que las bombas suministren cantidades definidas de líquido del orden de 10-100 ml.
   NOTA: Consulte la Tabla de materiales para las bombas utilizadas en esta implementación y el sitio web del fabricante para conocer el software utilizado para operar estas bombas y la documentación sobre cómo configurarlas. Dicho software para las bombas utilizadas en la configuración de PRANCE ilustrada en este manuscrito se proporciona de código abierto en el siguiente repositorio de GitHub https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE requiere al menos un colector de tres bombas capaz de bombear tres canales separados (entregar bacterias al reservorio bacteriano, entregar lejía al reservorio bacteriano y drenar el reservorio bacteriano a los desechos), con la velocidad de cada uno calibrada y controlada de forma independiente. En el pasado, la gente ha utilizado bombas de pecera y matrices de bombas hidropónicas, aunque, en principio, se puede utilizar cualquier bomba peristáltica controlable por pitón. Las funciones esenciales incluyen la capacidad de utilizar una pinza robótica para transferir placas dentro o fuera del lector, iniciar una medición del lector de placas y acceder a las mediciones.
6. Imprima en 3D los componentes de la cubierta personalizados necesarios para el sistema PRANCE, incluidos, como mínimo, el reservorio/colector de distribución bacteriana ("waffle"), como se encuentra en el Archivo Suplementario 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Asegure estos contenedores en la plataforma y calibre sus posiciones utilizando el software estándar del robot de manipulación de líquidos. Conecte el depósito al conjunto de bombas.
   NOTA: Consulte la documentación del fabricante del robot para obtener detalles sobre cómo realizar la calibración, ya que dependerá del robot. Las impresoras 3D a base de resina son las más apropiadas; un ejemplo del tipo de impresora utilizado se da en la Tabla de Materiales; Se utilizó la resina transparente estándar con la configuración predeterminada de la impresora.
7. Equipe el sistema con un desagüe compatible con las recomendaciones locales de bioseguridad.
8. Coloque el material de laboratorio en la plataforma del robot de manejo de líquidos como se ejemplifica en la Figura 4.
9. Siga los procedimientos de seguridad estándar, incluido el uso de equipo de protección personal de laboratorio estándar (es decir, bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).

2. Preparación del software

1. Instale el software de código abierto utilizado para controlar los robots de manipulación de líquidos con python¹¹, disponible en el repositorio de código abierto PyHamilton. https://github.com/dgretton/pyhamilton
2. Modifique y calibre el archivo de diseño de la plataforma para el software del robot de manejo de líquidos para reflejar con precisión las posiciones del material de laboratorio en la plataforma del robot, como se muestra en la Figura 4.
   NOTA: La configuración utilizada aquí utiliza el software proporcionado por el fabricante del robot de manipulación de líquidos, de acuerdo con la documentación proporcionada.
3. Ejecute el programa del método del robot PRANCE en modo de simulación.
   1. Abra la línea de comandos con los siguientes comandos (en el sistema operativo Windows), como se muestra en la figura 5.
      Tecla de Windows + R
      Ingrese: cmd
   2. Cambie el directorio principal por el directorio del programa del método robot. Introduzca un comando como el que se muestra a continuación con la ruta correcta, como se muestra en la figura 5.
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   3. Llame al programa de método robot con Python con el indicador de modo de simulación, como se muestra en la Figura 5.
      py robot_method.py --simulate
   4. Seleccione el botón PLAY en la parte superior izquierda de la ventana Robot Run Control que se abrirá cuando se ejecute el programa (Figura 5).
      NOTA: Asegúrese de que el método PRANCE pueda ejecutarse sin errores en la simulación antes de continuar. Se hace obvio si el script es capaz de operar en modo de simulación sin errores, ya que completará múltiples bucles del programa principal sin que se llame al manejo de errores del sistema, lo que termina el bucle del programa principal.
4. Ejecute el programa del método del robot PRANCE con el modo de simulación desactivado.
   1. Abra la línea de comandos en el directorio correspondiente (figura 5).
      Tecla de Windows + R
      Ingrese: cmd
      CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE
   2. Llame al programa del método robot con Python sin banderas:
      Py robot_method.py
   3. Seleccione el botón PLAY en la parte superior izquierda de la ventana Robot Run Control que se abrirá cuando se ejecute el programa.
   4. Confirme que PyHamilton puede controlar el instrumento y hacer que se inicialice.
5. Establezca la sincronización de datos en tiempo real.
   NOTA: Hasta la fecha, los sistemas PRANCE han utilizado computadoras en red que permiten a los usuarios monitorear los archivos de registro y los gráficos de medición del lector de placas en tiempo real a través de un software de intercambio remoto de archivos o a través de un escritorio remoto.
6. Desactiva las actualizaciones automáticas.

3. Preparación previa a la carrera

1. Asegúrese de que las fuentes de cultivo bacteriano en fase logarítmica estén disponibles para todos los cultivos necesarios para el ciclo planificado y de que se agiten activamente para evitar la sedimentación. Use un quimiostato/turbidostat activo o un cultivo refrigerado precultivado que detenga el crecimiento.
2. Actualice el archivo de manifiesto del controlador con los detalles del volumen (rango 0-500 μL) de qué cultivo bacteriano se va a bombear en cada pocillo de la laguna de 96 pocillos por ciclo de programa. Esto permite un control preciso de la tasa efectiva de dilución de la laguna. Esto se puede ver en la Figura 6.
   1. Calcule la tasa de dilución de la laguna utilizando la hoja de cálculo DilutionCalculator.xlsx (proporcionada como Archivo Suplementario 2), como se ve en la Figura 7.
3. Actualice el archivo robot_method.py con la altura de laguna prevista. Para seguir este protocolo, utilice 14 (en unidades milimétricas ) como valor predeterminado para la variable fixed_lagoon_height en el programa. Esto corresponde a un volumen de laguna de 550 μL en el sistema, pero puede diferir dependiendo de la placa de 96 pozos de profundidad utilizada en particular.
4. Coloque las puntas de pipeta filtradas limpias en la plataforma del robot en sus posiciones designadas y pegue las gradillas de puntas a los soportes de puntas para garantizar la estabilidad durante el funcionamiento.
5. Coloque placas limpias de 96 pocillos de profundidad en la plataforma del robot en sus posiciones designadas.
6. Coloque placas lectoras limpias de 96 pocillos en la plataforma del robot en sus posiciones designadas.
7. Asegúrese de que la bandeja del lector de placas no esté ocupada por una placa preexistente.
8. Asegúrese de que las bombas estén conectadas a la computadora y estén asignadas a la dirección correcta.
9. Limpie las líneas de bombeo activando las bombas para bombear lejía y luego agua.
10. Conecte las líneas de bombeo a las fuentes y salidas adecuadas, prestando mucha atención para asegurarse de que las líneas correctas estén conectadas a los cultivos bacterianos relevantes.
11. Rellene los tanques/cubos que contienen lejía/agua para el depósito bacteriano y el lavado de la punta de la pipeta.
12. Asegúrese de que todos los componentes de la cubierta, en particular los elementos móviles, estén estabilizados en sus posiciones designadas.
13. Active los calentadores según la implementación local a la temperatura objetivo (es decir, 37 °C; Figura 8).
14. Ejecute el archivo del protocolo de esterilización UV durante 10 minutos para operar la lámpara de esterilización UV incorporada en los robots de manipulación de líquidos suministrados por el fabricante (Figura 9).
    1. Seleccione el botón PLAY en la parte superior izquierda de la ventana Robot Run Control que se abrirá cuando se ejecute el programa.
    2. Ejecute el archivo con la opción parametrizada durante 600 s.
15. Asegúrese de que el software Robot Run Control esté cerrado.
    NOTA: El programa del método del robot se bloqueará si hay alguna instancia existente del software Run Control en ejecución.

4. Integración de hardware y software

1. Llevar a cabo una "carrera de agua", en la que el programa del método del robot PRANCE se ejecuta durante la noche con agua sustituyendo a todos los cultivos y reactivos húmedos.
   NOTA: Esta prueba se puede realizar a temperatura ambiente.
   1. Complete la preparación previa a la corrida como se detalla anteriormente con la configuración de controller_manifest y robot_method para una tasa de dilución efectiva de la laguna de 1 volumen/h , como se muestra en la Figura 5 y la Figura 6.
   2. Conecte la línea de "entrada de bacterias" a un recipiente con agua para reemplazar las bacterias en fase logarítmica para el flujo de agua.
      NOTA: Se puede agregar colorante alimentario a las fuentes de agua para rastrear el movimiento del líquido a través del experimento.
   3. Abra la línea de comandos en el directorio correspondiente.
   4. Llame al programa del método robot con Python con el nuevo indicador de ejecución (py robot_method.py --new) e ingrese los argumentos solicitados, incluido el nombre del archivo de registro (TestRun), el número de pozos de laguna (16), la duración del ciclo (30), el número de ciclos por medición de la placa del lector (4) y el volumen del inductor (el volumen del inductor es 0 μL para esta prueba, durante una evolución en la que se induce mutagénesis con arabinosa, este valor puede ser de 10 μL), como se muestra en la Figura 5.
   5. Seleccione el botón PLAY en la parte superior izquierda de la ventana Robot Run Control que se abrirá cuando se ejecute el programa una vez que se hayan proporcionado los argumentos.
      NOTA: El método PRANCE se puede iniciar utilizando una placa de laguna vacía, y el volumen de líquido de las lagunas se equilibrará con el volumen final durante los primeros seis ciclos.
2. Llevar a cabo una "carrera solo de bacterias", en la que el protocolo PRANCE se ejecuta durante la noche solo con cultivo bacteriano a la temperatura objetivo pero sin bacteriófagos.
   1. Complete la preparación previa a la corrida como se detalla anteriormente con la configuración de controller_manifest y robot_method para una tasa de dilución efectiva de la laguna de 1 volumen/h, como se muestra en la Figura 5 y la Figura 6. Asegúrese de que los calefactores estén encendidos a una temperatura objetivo de 37 °C.
   2. Conecte la línea de "bacterias en" a la fuente seleccionada de bacterias en fase logarítmica.
   3. Abra la línea de comandos en el directorio correspondiente.
   4. Llame al programa del método robot con Python con el nuevo indicador de ejecución (py robot_method.py --new) e introduzca los argumentos solicitados, como se detalló anteriormente en la sección 4.1.4.
   5. Seleccione el botón PLAY en la parte superior izquierda de la ventana Robot Run Control que se abrirá cuando se ejecute el programa una vez que se hayan proporcionado los argumentos.
3. Realice una "prueba de infección" en la que se desafíe a los fagos portadores de una proteína evolucionada a propagarse en bacterias que requieran esa proteína.
   NOTA: Decidir de antemano qué lagunas serán inoculadas con fagos y cuáles no, y así servir como lagunas de control sin fagos para detectar la contaminación cruzada.
   1. Complete la preparación previa a la ejecución como se detalla anteriormente con el controller_manifest y el robot_method configurados para una tasa de dilución efectiva de 1 volumen/h, como se muestra en la Figura 5 y la Figura 6. Asegúrese de que los calefactores estén encendidos a una temperatura objetivo de 37 °C.
   2. Conecte la línea de "bacterias en" a la fuente seleccionada de bacterias en fase logarítmica.
   3. Abra la línea de comandos en el directorio correspondiente.
   4. Llame al programa del método robot con Python con el nuevo indicador de ejecución (py robot_method.py --new) e introduzca los argumentos solicitados como se detalló anteriormente en la sección 4.1.4.
   5. Seleccione el botón PLAY en la parte superior izquierda de la ventana Robot Run Control que se abrirá cuando se ejecute el programa una vez que se hayan proporcionado los argumentos.
   6. Antes de agregar bacteriófagos, ejecute el método durante 2-3 h para equilibrar el volumen y el OD de bacterias en las placas de la laguna.
   7. Inocular las lagunas con fagos con 10⁶ ufp/ml de bacteriófago al final de un ciclo de ejecución cuando el programa está en reposo (por ejemplo, 5,5 μl de alícuota de fagos a 10⁸ ufp/ml, según lo determinado por ensayo de placa o qPCR), en una laguna de 550 μl.
   8. Ejecute el programa durante la noche y luego verifique el título de fagos en los pozos de la laguna mediante ensayo de placa o qPCR.

Resultados de las pruebas de infección
Esta prueba revelará problemas con el cultivo bacteriano, la clonación y el título de fagos, la estabilidad de la temperatura del equipo, la configuración de manejo de líquidos y la integración del lector de placas. Una prueba de infección por fagos exitosa revelará una infección clara y rápida por fagos en las lagunas inoculadas con fagos, y ninguna señal en las lagunas sin fagos. La figura 10 muestra algunos resultados representativos de una prueba de infección por fagos. Los resultados experimentales también pueden compararse con las Figuras 1d y 1c de este artículo PRANCE8, dependiendo de si se está implementando una configuración de "PRANCE caliente" (alimentado por un turbilostato bacteriano vivo) o "PRANCE frío" (alimentado por cultivo refrigerado en fase logarítmica media). Esta prueba puede revelar varios problemas comunes. Los problemas con la preparación del cultivo bacteriano a menudo pueden resultar en una infección débil o ausente. Las bacterias solo pueden ser infectadas de forma óptima por el fago M13 cuando se encuentran en fase logarítmica media y a 37 °C. A otras temperaturas y etapas de crecimiento, exhiben una expresión de pilus más débil y, por lo tanto, son menos susceptibles a la infección por fagos12. La inoculación con fagos de bajo título, o fagos con mutaciones en la columna vertebral puede dar lugar a un retraso o ausencia de señal. Los problemas con los ajustes de ganancia del lector de placas para fluorescencia o luminiscencia se revelarán mediante esta prueba.

Figura 1: Esquema del circuito genético que funciona durante la prueba de infección del aparato PRANCE. Cuando la ARN polimerasa T7, codificada en el genoma del fago, infecta al huésped Escherichia coli , se transcribe y se une al AP en el promotor T7, lo que conduce a la transcripción de la proteína del fago pIII y la proteína luxAB, lo que, a su vez, facilita la propagación del fago y la producción de luminiscencia. Abreviaturas: PRANCE = Evolución Casi Continua Asistida por Fagos y Robótica; AP = plásmido accesorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Esquema de los componentes físicos del sistema PRANCE. Un refrigerador almacena cultivos agitados, que luego se trasladan a la plataforma del robot mediante una serie de bombas, al depósito bacteriano, "el gofre". El robot de manipulación de líquidos se utiliza para trasladar los cultivos bacterianos desde "el gofre" utilizando el cabezal de pipeteo hasta los pozos de retención para calentarlos hasta la temperatura de incubación, y luego a las lagunas donde se produce la incubación principal. Tanto los pozos de retención como las lagunas son placas estándar de pozos profundos de 2 mL. El robot toma muestras en placas lectoras de un solo uso, que a su vez se trasladan a un lector de placas para su medición. Abreviatura: PRANCE = Evolución Casi Continua Asistida por Fagos y Robótica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El aparato robótico PRANCE. (A) Configuración de PRANCE. (I) Filtro HEPA y calentador externo. II) Refrigerador de cultivo. (III) Recinto principal del robot. (IV) Lector de placas. (V) Bombas y tanques. (B) Recinto del robot. VI) Bombas de cultivo principales. (VII) Tanques de agua, residuos y lejía. (VIII) Bombas lavadoras. (C) Recinto del robot. (IX) Brazo de pipeteo y pinza del robot. (X) Puntas de pipeta. (XI) Componente impreso en 3D para permitir la distribución de cultivos en el robot ("el gofre"). (XII) Placas para la toma de muestras en el lector de placas. (XIII) Cubos para el lavado de puntas. (XIV) "Lagunas": recipientes de cultivo donde se lleva a cabo el cultivo evolutivo. Abreviaturas: PRANCE = Evolución Casi Continua Asistida por Fagos y Robótica; HEPA = aire particulado de alta eficiencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Disposición de la cubierta. (A) Representación en 3D de la disposición de la cubierta en el software de control del robot. (B) Fotografía de los componentes de la cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Captura de pantalla de la línea de comandos con parámetros de ejemplo (arriba) y software de control de ejecución (abajo). El botón de reproducción se encuentra en la parte superior izquierda y se puede hacer clic con un mouse o accionar con una pantalla táctil según la implementación local. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: El archivo de manifiesto del controlador tal como está configurado para las ejecuciones de prueba. Las lagunas que contienen el cultivo #0 estarían en las columnas 1 y 3 de la placa de 96 pozos de profundidad. Las columnas restantes estarían vacías. Las filas A, B, D y E de la placa de 96 pocillos profundos están marcadas en la columna derecha para la infección por fagos (1), las otras filas (0) son controles sin fagos. Esta instancia del manifiesto controlador daría como resultado que el programa diluyera la laguna con 210 μL de cultivo en cada ciclo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Cálculo de la tasa efectiva de dilución de la laguna utilizando la hoja de cálculo DilutionCalculator. Consulte el Archivo complementario 2 para ver la hoja de cálculo de DilutionCalculator. Como se ve en esta figura, una laguna de 550 μL que se diluye con 210 μL de cultivo fresco cada ciclo de 30 minutos, con muestras de 150 μL para la medición de la placa lectora que se toman cada cuatro ciclos, corresponderá a una tasa de dilución efectiva de 1,0 volúmenes de laguna/h (después de cada 1 h, permanecerá el 50% del líquido original de la laguna al comienzo de la hora) Haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.

Figura 8: Sistema de calefacción del robot. El calentador se activa enchufando la fuente de alimentación como lo indica el círculo rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Configuración del protocolo de descontaminación UV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Medición de una prueba de infección realizada en el sistema PRANCE. Se toman muestras durante la ejecución y se realizan mediciones de luminiscencia y absorbancia. Para cada laguna, las mediciones de luminiscencia se dividen por la medición de absorbancia correspondiente y se trazan en función del tiempo. Las lagunas que han sido infectadas con fagos están coloreadas en verde, mientras que las lagunas de control no infectadas están coloreadas en negro. Abreviatura: PRANCE = Evolución Casi Continua Asistida por Fagos y Robótica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Archivo STL para imprimir en 3D los componentes de la cubierta personalizados necesarios para el sistema PRANCE, incluidos, como mínimo, el reservorio bacteriano/colector de distribución ("waffle"). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Hoja de cálculo de DilutionCalculator. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos que revelar.