Análisis cualitativo y cuantitativo de la producción de sideróforos a partir de Pseudomonas aeruginosa

Resumen

Este protocolo proporciona análisis cualitativos y cuantitativos de sideróforos totales, pioverdina y pioquelina de Pseudomonas aeruginosa.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es conocida por su producción de una amplia gama de factores de virulencia para establecer infecciones en el huésped. Uno de estos mecanismos es la eliminación de hierro a través de la producción de sideróforos. P. aeruginosa produce dos sideróforos diferentes: pioquelina, que tiene menor afinidad quelante del hierro, y pioverdina, que tiene una mayor afinidad quelante del hierro. Este informe demuestra que la pioverdina se puede cuantificar directamente a partir de sobrenadantes bacterianos, mientras que la pioquelina debe extraerse de los sobrenadantes antes de la cuantificación.

El método principal para analizar cualitativamente la producción de sideróforos es el ensayo en placa de agar sulfonato de cromo azurol (CAS). En este ensayo, la liberación del colorante CAS del complejo Fe³⁺-Colorante conduce a un cambio de color de azul a naranja, lo que indica la producción de sideróforos. Para la cuantificación de los sideróforos totales, los sobrenadantes bacterianos se mezclaron en proporciones iguales con colorante CAS en una placa de microtitulación, seguido de un análisis espectrofotométrico a 630 nm. La pioverdina se cuantificó directamente a partir del sobrenadante bacteriano mezclándolo en proporciones iguales con 50 mM de Tris-HCl, seguido de un análisis espectrofotométrico. Un pico a 380 nm confirmó la presencia de pioverdina. En cuanto a la pioquelina, no fue posible la cuantificación directa del sobrenadante bacteriano, por lo que primero hubo que extraerla. El análisis espectrofotométrico posterior reveló la presencia de pioquelina, con un pico a 313 nm.

Introducción

Los organismos requieren hierro para realizar diversas funciones vitales, como el transporte de electrones^{y la} replicación del ADN. Se sabe que Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista gramnegativo, posee una variedad de factores de virulencia para establecer la infección en el huésped, entre los cuales uno de los mecanismos es la formación de sideróforos². Durante las condiciones de agotamiento del hierro, P. aeruginosa libera moléculas especializadas llamadas sideróforos, que apagan el hierro del entorno circundante. Los sideróforos quelan el hierro extracelularmente, y el complejo férrico-sideróforo resultante se transporta activamente de vuelta a la célula³.

Se sabe que P. aeruginosa produce dos sideróforos, pioverdina y piochelina. Se sabe que la pioverdina tiene una mayor afinidad quelante del hierro (1:1), mientras que se sabe que la pioquelina tiene una menor afinidad quelante del hierro (2:1)⁴. La pioquelina también se denomina sideróforo secundario porque tiene una menor afinidad quelante^{de hierro 5}. La producción y regulación de sideróforos se controlan activamente mediante sistemas de detección de quórum (QS) en P. aeruginosa⁶.

Además del enfriamiento del hierro, los sideróforos también están involucrados en la regulación de los factores de virulencia y juegan un papel activo en la formación de biopelículas⁷. Los sideróforos desempeñan funciones cruciales adicionales, incluida la participación en la señalización celular, la defensa contra el estrés oxidativo y la facilitación de las interacciones entre las comunidades microbianas⁸. Los sideróforos generalmente se clasifican en función de los grupos funcionales específicos a través de los cuales quelan el hierro. Los tres ligandos bidentados primarios en esta clasificación son catecolato, hidroxamato y α-hidroxicarboxilato³. Las pioverdinas son características distintivas de especies fluorescentes de Pseudomonas como P. aeruginosa y P. fluorescens⁵. Consisten en un cromóforo fluorescente verde mixto acoplado a un oligopéptido que contiene 6-12 aminoácidos. Varias péptidos sintetasas no ribosómicas (NRPs) están implicadas en su síntesis⁹. Cuatro genes implicados en la producción y regulación de la pioverdina son pvdL, pvdI, pvdJ y pvdD¹⁰. La pioverdina también es responsable de la infección y la virulencia en los mamíferos¹¹. Se observa que P. aeruginosa produce pioquelina en condiciones moderadas de limitación de hierro, mientras que la pioverdina se produce durante ambientes severos de limitación de hierro¹². Dos operones implicados en la producción de pioquelina son pchDCBA y pchEFGHI¹³. Se observa que en presencia de piocianina, la pioquelina (catecolato) induce daño oxidativo e inflamación y genera radicales hidroxilo, que son dañinos para los tejidos del huésped¹¹.

El ensayo de sulfonato de cromo azurol (CAS) es ampliamente adoptado debido a su amplitud, alta sensibilidad y mayor conveniencia en comparación con los ensayos microbiológicos, que, aunque sensibles, pueden ser demasiado específicos¹⁴. El ensayo CAS se puede realizar en superficies de agar o en una solución. Se basa en el cambio de color que se produce cuando el ion férrico pasa de su complejo azul intenso a naranja. El ensayo colorimétrico CAS cuantifica el agotamiento del hierro de un complejo ternario Fe-CAS-surfactante. Este complejo en particular, que consiste en metal, colorante orgánico y tensioactivo, tiene un color azul y exhibe un pico de absorción a 630 nm.

Este informe presenta un método para la detección cualitativa de la producción de sideróforos, donde se puede detectar la producción de sideróforos en una placa de agar. También se proporciona un método para la estimación cuantitativa de la producción total de sideróforos en una placa de microtitulación y la detección y análisis cuantitativo de dos sideróforos, pioverdina y piochelina, de P. aeruginosa.

Protocolo

Todos los aislados bacterianos de P. aeruginosa se obtuvieron de laboratorios de microbiología médica de Vadodara y Jaipur, India. Todos los aislados clínicos seleccionados se manipularon en el Gabinete de Bioseguridad (BSL2) y se tuvo sumo cuidado al manipular los aislados bacterianos durante los experimentos. Los detalles comerciales de todos los reactivos/soluciones se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del colorante de sulfonato de cromo azurol (CAS) y medios de agar

1. Prepare el colorante CAS (100 ml) con la siguiente composición:
   1. Disolver 60 mg de CAS en 50 ml de agua destilada (Solución 1).
   2. Disolver 2,7 mg de FeCl₃·6H₂O en 10 mL de HCl 10 mM (Solución 2).
   3. Disolver 73 mg de bromuro de cetrimonio (HDTMA) en 40 ml de agua destilada (Solución 3).
   4. Mezcle cuidadosamente la Solución 1, la Solución 2 y la Solución 3. Guárdalo en una botella de vidrio.
2. Prepare el agar CAS siguiendo los pasos a continuación:
   1. Agregue 100 ml de solución salina MM9 a 750 ml de agua destilada.
   2. Disolver 32,24 g de ácido libre de piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES).
   3. Añadir 15 g de agar agar. Esterilizarlo en autoclave y dejar que se enfríe.
   4. Añadir a la mezcla 30 ml de solución estéril de ácido Casamino y 10 ml de solución estéril de glucosa al 20%.
   5. Agregue 100 ml de tinte CAS, mezcle y viértalo en condiciones asépticas.
      NOTA: La preparación de los medios MM9, la solución de ácido Casamino y la 8-hidroxiquinolina se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. El tampón PIPES es sensible al pH. No se disolverá hasta que se alcance un pH de 5,6. Asegúrese de que el pH se controle constantemente porque cuando PIPES comience a disolverse en agua, disminuirá aún más el pH. Extracto de ácido Casamino con el mismo volumen de 8-hidroxiquinolina al 3% disuelto en cloroformo. Deje la solución inmiscible a 4 °C durante unos 20 minutos y recoja con cuidado la fase superior de la solución sin alterar la fase inferior.

2. Análisis cualitativo de la producción de sideróforos

1. Ajuste el diámetro exterior_{de 600} nm a 0,2 durante 24 h de cultivo de P. aeruginosa.
2. Usando un asa de alambre estéril, raye el cultivo bacteriano en una placa de agar CAS.
3. Incubar a 30 °C durante 24 h.
   NOTA: Se puede utilizar agua de peptona o solución salina normal al 0,8% para diluir el cultivo bacteriano. Si no se observa crecimiento bacteriano a las 24 h, incubar las placas CAS durante 48 a 72 h.

3. Estimación cuantitativa de sideróforos totales

1. Vuelva a inocular cultivos de P. aeruginosa cultivados durante 24 h en medios acuosos de peptona después de ajustar el OD₆₀₀ nm a 0,25, e incube a 30 °C durante 48 h.
2. Después de 48 h, centrifugar el cultivo bacteriano a 4650 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Después de la centrifugación, agregue 100 μL de sobrenadante libre de células a una placa de microtitulación de 96 pocillos y agréguele 100 μL de colorante CAS.
4. Cubra la placa con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 20 min.
5. Después de la incubación, tome lecturas espectrofotométricas a 630 nm.
6. Calcular los resultados obtenidos para la cuantificación de los sideróforos totales como Unidad Porcentual de Sideróforos (PSU).
   NOTA: La fuente de alimentación se puede calcular como: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   donde, A_r = absorbancia de la referencia a 630 nm, A_s = absorbancia del sobrenadante libre de células de la muestra. Como referencia, se debe agregar colorante CAS a los medios de agua de peptona no inoculados. Llene toda la cristalería, como tubos de ensayo, frascos, etc., con HCl 6 M durante 2 h y enjuáguela dos veces con agua destilada para eliminar cualquier rastro de hierro en ella.

4. Estimación cuantitativa de la pioverdina

1. Vuelva a inocular cultivos de P. aeruginosa cultivados durante 24 h en medios acuosos de peptona después de ajustar la DO₆₀₀ nm a 0,25 e incube a 30 °C durante 48 h.
2. Después de 48 h, mida el diámetro exterior de₆₀₀ nm del crecimiento bacteriano antes de continuar.
3. Centrifugar el cultivo bacteriano a 4650 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
4. Después de la centrifugación, agregue 100 μL de sobrenadante libre de células a una placa de microtitulación de 96 pocillos y agregue 100 μL de 50 mM de Tris-HCl (pH 8.0).
5. Tome lecturas espectrofotométricas a₄₀₅ nm de diámetro exterior.

5. Extracción de piochelin y espectrofotometría

1. Vuelva a inocular cultivos de P. aeruginosa cultivados durante 24 h en medio King's B (Archivo suplementario 1) después de ajustar el DO₆₀₀ nm a 0,25 e incube a 30 °C durante 24 h.
2. Después de 24 h, tomar 100 mL de cultivo y centrifugar a 4650 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Después de la centrifugación, agregue 5 ml de ácido cítrico 1 M al sobrenadante. Extraer dos veces con 50 mL de acetato de etilo.
4. Filtrar la fase orgánica con sulfato de magnesio a través de un filtro de jeringa. Almacenar la fase orgánica filtrada a -20 °C.
5. Tome lecturas espectrofotométricas a 320 nm.
   NOTA: Como la pioquelina es un compuesto altamente inestable a temperatura ambiente, realice el proceso de extracción en hielo. Utilice una jeringa estéril de 50 ml para separar el filtro. Coloque algodón en la punta de la jeringa y agregue 1 g de sulfato de magnesio sobre él. Fije un filtro de jeringa estéril en la punta de la jeringa y recoja el filtrado en un tubo estéril.

Resultados

Antes de la cuantificación de los sideróforos a partir de aislados clínicos, se llevó a cabo un cribado cualitativo de la producción de sideróforos para garantizar la producción de sideróforos. La detección cualitativa de sideróforos a partir de aislados clínicos se observó mediante el rayado de bacterias en placas de agar CAS. Se seleccionaron tres aislamientos clínicos, a saber, MR1, TL7, J3, junto con PAO1 (la cepa de referencia), para el estudio. Los tres aislados clínicos y PAO1 most...

Discusión

Este protocolo permite a los investigadores cuantificar los sideróforos totales y dos sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina y pioquelina, a partir del sobrenadante libre de células bacterianas. En el ensayo de placas de agar CAS, el colorante CAS y los iones Fe³⁺ forman un complejo. Cuando las bacterias producen sideróforos, apagan los iones Fe³⁺ del complejo CAS-Fe³⁺, lo que provoca un cambio de color alrededor del crecimiento bacteriano. Este cambio da co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar Agar, Tipo I	HIMEDIA	GRM666
8-hidroxiquinolina	Loba Chemie	4151
Ácido Casamino	SRL Productos químicos	68806
Bromuro de cetiltrimetilo amonio (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Cloroformo	Merck	1070242521
Sulonato de azurol de cromo	HIMEDIA	RM336-10G
Ácido cítrico	Merck	100241
Dextrosa monohidrato	Merck	108342
Diclorometano	Merck	107020
Cloruro férrico hexahidratado	HIMEDIA	GRM6353
Matraces de vidrio	Borosil	5100021
Tubos de ensayo de vidrio	Borosil	9820U05
Ácido clorhídrico	SDFCL	20125
King's medio B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Sales medias mínimas	HIMEDIA	G013-500G
Sulfato de magnesio	Qualigens	10034
MultiskanGO Espectrofotómetro UV	Thermo Scientific	51119200
Peptona Tipo I, Bacteriológico	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES ácido libre	MP Biomedicals	190257
Dihidrógeno fosfato de potasio	Merck	1048731000
Proteose peptona	HIMEDIA	RM005-500G
Espectrofotómetro UV-Vis	Shimadzu Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Cloruro de sodio	Qualigens	15915

de