Habilitación de estudios de expresión de transgenes de alto rendimiento mediante el manejo automatizado de líquidos para protoplastos de hoja de maíz etiolados

Summary

Este protocolo describe la creación de un diseño de transfección al azar utilizando un manipulador de líquidos automatizado, un protocolo de aislamiento de protoplastos para hojas de maíz etioladas y un procedimiento de transfección de 96 pocillos utilizando un manipulador de líquidos.

Abstract

El campo de la biotecnología vegetal ha sido testigo de notables avances en los últimos años, revolucionando la capacidad de manipular y diseñar plantas para diversos fines. Sin embargo, a medida que la investigación en este campo aumenta en diversidad y se vuelve cada vez más sofisticada, es más evidente la necesidad de soluciones de detección transitoria tempranas, eficientes, confiables y de alto rendimiento para reducir las estrategias que proceden a una transformación estable. Un método que ha resurgido en los últimos años es la utilización del protoplasto vegetal, para el cual se dispone de métodos de aislamiento y transfección en numerosas especies, tejidos y etapas de desarrollo. En este trabajo se describe un protocolo automatizado simple para la preparación aleatoria de plásmido dentro de una placa de 96 pocillos, un método para el aislamiento de protoplasto foliar de maíz etiolado y un procedimiento de transfección automatizado. La adopción de soluciones automatizadas en biotecnología vegetal, ejemplificada por estos novedosos protocolos de manejo de líquidos para la transfección de protoplastos vegetales, representa un avance significativo con respecto a los métodos manuales. Al aprovechar la automatización, los investigadores pueden superar fácilmente las limitaciones de los métodos tradicionales, mejorar la eficiencia y acelerar el progreso científico.

Introduction

La transfección de protoplastos vegetales, es decir, la introducción de material genético extraño en células vegetales desprovistas de paredes celulares, es una técnica fundamental y, en el último medio siglo, abarca numerosas especies en apoyo de la investigación en biotecnología vegetal. Sin embargo, la utilización de estos métodos puede ser dolorosa y de alcance limitado, incluso con millones de protoplastos producidos por aislamiento. Los métodos tradicionales de transfección de protoplastos vegetales suelen ser laboriosos, lentos, propensos a la variabilidad y técnicamente exigentes, lo que da lugar a sistemas de nicho con baja reproducibilidad¹. Sin embargo, el potencial introducido por las soluciones automatizadas en los últimos años ilumina la posibilidad de dar nueva vida a esta técnica de 60 años de antigüedad ^2,3. Con el potencial de automatizar pasos cruciales pero repetitivos, como la preparación del material, la incubación de polietilenglicol (PEG) y la posterior dispensación de reactivos de transfección, los investigadores pueden reducir significativamente los requisitos de manipulación física y otras fuentes potenciales^{de error humano}. Además, el control preciso y la uniformidad que ofrecen los sistemas automatizados de manipulación de líquidos garantizan resultados de transfección consistentes y reproducibles.

Si bien el aislamiento de protoplastos es un proceso meticuloso que implica picado, digestión, incubación, filtración y centrifugación, la parte de transfección de estos protocolos está hecha a medida para los manipuladores de líquidos automatizados. El procedimiento para la mayoría de los protocolos de transfección de protoplastos está mediado por PEG, y la mezcla del protoplasto aislado en presencia de PEG y ADN plasmídico purificado durante un período específico a una concentración precisa (dependiendo de la especie y el tejido) permite que estas células absorban el ADN plasmídico⁵. A esta transfección le siguen una serie de pasos de lavado, que culminan en una incubación nocturna⁶. Después del período de incubación, si todo se diseñó y entregó correctamente, el experimento da como resultado la expresión del componente de interés y/o el potencial de evaluar diferentes componentes reguladores⁷. Todos los pasos de aspiración, dispensación y agitación/mezcla asociados con este procedimiento normalmente se manejarían con una pipeta manual. La ejecución manual de un protocolo de este tipo, una reacción individual a la vez, es laboriosa e introduce variaciones innecesarias entre las muestras, al tiempo que limita la capacidad que se puede evaluar en un momento dado. Los protocolos automatizados para la manipulación de células de mamíferos o insectos y la síntesis química en la industria farmacéutica han estado en práctica durante varios años ^4,8,9. La utilización de protoplast y los protocolos que involucran el manejo automatizado de líquidos de materiales vegetales están en aumento 10,11,12,13.

La adopción de protocolos automatizados de manejo de líquidos para la transfección de protoplastos de plantas es muy prometedora para las aplicaciones de investigación. Los investigadores pueden explorar bibliotecas genéticas más grandes, detectar funciones genéticas específicas a un ritmo acelerado e investigar interacciones genéticas complejas relacionadas con el estrés de las plantas^{de manera más} integral. La escalabilidad de los enfoques automatizados que utilizan pods de 96 pocillos combinados con el cribado de fluorescencia permite la experimentación de alto rendimiento y permite a los científicos generar rápidamente datos y conocimientos que pueden impulsar los avances en la biotecnología vegetal¹¹. Sin embargo, con este aumento en el rendimiento, que conduce a la generación de cientos, si no miles, de puntos de datos, debe haber un control de calidad adicional que tenga en cuenta cualquier fuente de error que pueda confundir^{los resultados}. Un elemento que se ha identificado como un factor contribuyente en numerosas disciplinas científicas es el efecto de borde. Algunas estrategias de mitigación sugerirán la mejor placa para usar o llenar el espacio entre pozos o los pozos más externos con agua para combatir este fenómeno^16,17. Sin embargo, estas estrategias agregan tiempo, y si un desechable específico no está disponible, la única opción es conformarse con menos o posponerlo. Por otra parte, buscar estrategias que tengan en cuenta este efecto a través de un esquema de bloqueo no sacrifica el rendimiento ni retrasa la ejecución.

Este protocolo de protoplasto de hoja de maíz etiolado y sus dos métodos automatizados ilustrados en la Figura 1 buscan abordar la variabilidad inherente a los experimentos con protoplastos mediante la automatización de múltiples porciones del método canónico de protoplasto, la asignación de material plásmido al recipiente utilizado para la transfección y la transfección misma. Estos métodos se demuestran para la plataforma de protoplasto de hoja de maíz etiolado, ya que es una plataforma de protoplasto bien caracterizada, simple y eficiente. Todos los pasos detallados son inmediatamente accesibles para los protocolos de transfección de protoplastos, que utilizan soluciones tampón similares o iguales. Sin embargo, se debe prestar especial atención a las características únicas del tejido y las especies de protoplastos antes de adoptar estas técnicas. Estas mejoras a través de la automatización simplifican la preparación del material para experimentos individuales y mejoran significativamente el rendimiento, desde la transfección secuencial una por una hasta las 96 transfecciones manejadas simultáneamente. Este trabajo también mostrará la justificación de la utilización de bloques incompletos aleatorios para dar cuenta del sesgo posicional de la placa.

Protocol

1. Creación de placas de transfección

1. Creación de diseños de cubiertas: Para crear un método de aleatorización de placas de ADN, abra el software del manipulador de líquidos. Haga clic en el botón Nuevo método de la barra de menú para crear un nuevo método. Agregue la línea de configuración de instrumentos entre las líneas de inicio y fin presionando el botón de configuración de instrumentos en el panel izquierdo.
   NOTA: Las capturas de pantalla relevantes que siguen a este protocolo automatizado se pueden encontrar en la Figura complementaria 1, la Figura complementaria 2 y la Figura complementaria 3.
2. Haga clic en la línea Configuración del instrumento , busque el material de laboratorio correcto en el menú de categorías de material de laboratorio y arrástrelo al diseño de la plataforma como se muestra en la Figura complementaria 1.
   NOTA: Si el material de laboratorio no está definido previamente, entonces deberá programarse en el manipulador de líquidos de acuerdo con las especificaciones del fabricante, pero dichas instrucciones están fuera del alcance de este protocolo.
3. Transferir desde la configuración del archivo: Presione el botón Transferir desde el archivo en las paletas de pasos y coloque la línea Transferir desde el archivo debajo de la línea de configuración del instrumento. Asegúrese de que la selección y el reemplazo de la punta sean los que se muestran en la Figura complementaria 3.
4. Compruebe que el archivo tenga una fila de encabezado y asegúrese de que la información de la columna sea correcta.
5. Presione el área de origen para activarlo y haga clic en la placa de origen en el diseño de la plataforma, defina la placa de destino e ingrese la cantidad de ADN que se pipeteará.
6. Presione el botón Personalizar para definir la técnica de pipeteo en detalle, como los toques de punta en la pared.
7. Especifique la cantidad de ADN plasmídico que se va a transferir. Este protocolo utiliza 20 μL de ADN plasmídico de 1 μg/μL por transfección (pocillo).
   NOTA: la cantidad de ADN plasmídico que se transfiere a la placa de transfección antes de la transfección del protoplasto dependerá de la plataforma de protoplasto que se utilice.
8. Cree una transferencia desde un archivo .csv documento.
   1. Este documento se compone de dos columnas. Prepare la primera columna, es decir, la columna De, que indica la ubicación del ADN plasmídico stock dentro del bastidor de tubos, es decir, para la muestra 1; esto sería bien A01. Como esta transferencia se produce tres veces (tres repeticiones), tres filas deben denotar A01 en la columna Desde.
   2. Prepare la segunda columna, es decir, la columna Hasta, que se utiliza para especificar el pozo de destino de construcción de plásmido de la placa de 96 pocillos. Por ejemplo, la muestra 1 (A01) podría ser B02, D04 y H07. Guárdelo como un archivo .csv para que sea compatible con el software del manipulador de líquidos.
9. Antes de ejecutar el protocolo, verifique que las posiciones de la plataforma estén cargadas, que el material de laboratorio esté correctamente definido, que el documento de aleatorización incluya ubicaciones de pozos para todas las muestras de ADN en el soporte de tubos y que haya suficiente muestra de plásmido en los tubos para ejecutar el protocolo.
10. Expanda el menú Propiedades de archivo del paso Transferir desde archivo, seleccione el archivo .csv creado y ejecute el protocolo.
11. Cubra las placas de transfección con un sello de papel de aluminio cuando el protocolo se haya completado con éxito. Guarde las placas de transfección a -20 °C hasta que estén listas para usar. El protoplasto aislado de hoja de maíz etiolado se agregará a esta placa de transfección en el paso 3.3.

2. Aislamiento de protoplastos de hoja de maíz etiolado

1. Para iniciar el aislamiento del protoplasto foliar etiolado de maíz, se obtuvo un fondo genético compatible con protoplastos como el NP222 que se utilizó aquí¹⁸. Prepare solo 3 tampones, a saber, MMg, W5 y WI, enumerados en la Tabla 1 antes del inicio del experimento y manténgalos a 4 °C. Prepare la solución de digestión y el PEG el día del experimento para obtener mejores resultados.
2. Esteriliza 25 semillas en la superficie sumergiéndolas primero en una solución de lejía comercial al 25% y agitándolas en un agitador de plataforma giratoria durante aproximadamente 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.
3. Después de la agitación, enjuague bien las semillas con agua estéril (DI). Repita el paso de enjuague 5 veces. Beba las semillas en agua estéril durante la noche a temperatura ambiente.
4. Siembre la semilla en tierra húmeda y esterilizada en autoclave al día siguiente. Agregue gránulos de arcilla seca para absorber el exceso de humedad del suelo y evitar la contaminación por hongos.
5. Cultive las plántulas de maíz en una cámara de crecimiento ligera de 16 h a 28 °C (humedad relativa (HR) del 30%) durante aproximadamente 3 días hasta que el coleóptilo esté a 1-2 cm del suelo y luego transfiéralas a una cámara oscura con la misma temperatura y HR durante 5 a 7 días adicionales.
6. Coseche el primer tejido de hoja verdadero cortándolo justo por encima del primer collar.
7. Esterilizar brevemente el tejido de la hoja con lejía comercial al 25% y 250 μL de solución Tween 20 al 20% durante 1 min. Enjuague bien el material de la hoja 5 veces con agua desionizada.
8. Seque (suavemente) el tejido de la hoja de maíz con pañuelos sin pelusa y, con una cuchilla afilada, retire ~ 1,5 cm de la punta y la base de la hoja de cada hoja.
9. Corte el tejido de la hoja restante en tiras transversales estrechas (0,5 mm - 1 mm) y colóquelas en una placa de Petri de 100 x 25 mm.
10. Filtre-esterilice 25 mL de la solución de digestión a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm directamente en la placa de Petri que contiene el tejido cortado.
11. Infiltre al vacío el tejido de la hoja con la solución de digestión aplicando vacío durante 30 min a temperatura ambiente en un desecador de vacío a una presión aproximada de -75 mbar.
    NOTA: La presión de vacío doméstico para numerosos laboratorios académicos y privados debería ser suficiente para este paso.
12. Colóquelo en un agitador de plataforma giratoria y agite a 25 °C en la oscuridad a 60 RPM durante 2,5 a 3 h. Cuando queden 10 minutos para el final del período de digestión, aumente la velocidad a 90 RPM.
13. Vierta la solución de digestión y cualquier material vegetal no digerido a través de un embudo encima de un filtro de tamiz de 40 μm en un tubo de 50 mL.
14. Centrifugar la solución dentro del tubo de 50 mL a 150 x g durante 4 min para granular el protoplasto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 - 15 mL de solución tampón MMg.
15. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. Vuelva a suspender en 5 - 10 mL de tampón MMg fresco.
16. Con un hemocitómetro, mida cuidadosamente la densidad del protoplasto aislado. Vuelva a suspender a una densidad aproximada de 5 x 10⁵ protoplastos por mL.
17. Deje que el aislado descanse sobre hielo durante ~ 30 minutos antes de la transfección. Durante este tiempo, prepare la solución de PEG. Disuelva completamente el PEG en una solución utilizando un baño de agua a 37 °C y déjelo allí hasta la transfección.

3. Transfección automatizada de protoplastos

NOTA: Los pasos 3.6 a 3.15 son administrados completamente por el manipulador de líquidos automatizado, excepto las dos pausas de usuario en los pasos 3.10 y 3.13, que requieren centrifugación manual. Las capturas de pantalla relevantes que siguen a este protocolo automatizado se pueden encontrar en el suplemento, Figura complementaria 1, Figura complementaria 3, Figura complementaria 4 y Figura complementaria 5.

1. Prepare el diseño de la cubierta del manipulador de líquidos para la transfección de acuerdo con el método de transfección de protoplastos descrito en los siguientes pasos. Reúna los siguientes materiales: Placa de destino (en este caso, sería una negra de 96 pocillos con una microplaca inferior transparente para la medición de fluorescencia), una caja de puntas de automatización de diámetro ancho de 25 a 250 μL para el paso de aspiración PEG, cinco cajas de puntas de automatización de pipetas de 25 a 250 μL para los pasos de manejo de líquidos restantes, tres cubetas de plástico como depósitos de reactivos, una placa vacía de 96 pocillos para la recolección de residuos, soluciones de lavado tampón de transfección restantes, W5 y WI.
2. Inmediatamente antes de que comience el procedimiento de transfección, esterilice la solución de PEG a través de una unidad de filtro de vacío desechable estéril de 0,22 μm en un tubo nuevo de 50 ml.
3. A partir del protoplasto resuspendido en tampón MMg, añada 100 μL (aproximadamente 50.000 protoplastos) a cada pocillo de la placa de transfección previamente preparada y descongelada. Para ello, vierta la solución tampón que contiene protoplastos en un canal estéril de 10 ml y utilice una pipeta multicanal. Continúe agitando suavemente el canal para evitar que el protoplasto se asiente fuera de la solución durante este paso de transferencia manual.
4. Vierta la solución de PEG en el canal apropiado y coloque la placa de transfección, que ahora contiene protoplasto y ADN plasmídico que contiene la placa de transfección, preparada mediante el paso 1, en la ubicación especificada de acuerdo con el diseño de la plataforma.
5. Para crear un método de transfección de protoplasto, abra el software del manipulador de líquidos y realice los pasos que se describen a continuación.
   1. Mover material de laboratorio entre plataformas: Reemplace la caja de punta vacía en la plataforma de carga de puntas por una nueva utilizando el comando Mover material de laboratorio. Seleccione los decks Desde y Hasta en la vista Configuración .
   2. Para volúmenes superiores a 200 μL: No sustituya las puntas entre las transferencias. Sugerencias de carga para el primer paso de transferencia y descarga después del último paso de transferencia, lo que requiere que las opciones de carga/descarga se especifiquen correctamente para cada paso de transferencia como se muestra en la Figura complementaria 3.
6. Creación de diseño de cubierta: Al igual que el método de creación de placas de transfección, para crear un método de transfección automatizado de ADN, abra el software de manipulador de líquidos. Haga clic en el botón Nuevo método de la barra de menú para crear un nuevo método. Agregue la línea de configuración de instrumentos entre las líneas de inicio y fin presionando el botón Configuración de instrumento en el panel izquierdo. Cree un diseño de mazo de acuerdo con el diseño de mazo que se muestra en la Figura complementaria 1.
7. Mezcla de células/ADN: Agregue un paso para mezclar el protoplasto y el ADN antes de la adición de PEG usando el botón de acción del dispositivo y configurando el dispositivo (posicionador automático de material de laboratorio de agitación o ALP), la velocidad de agitación (1500 rpm) y el tiempo de agitación (10 s).
8. Adición y mezcla de PEG: Para iniciar la transfección, agregue un paso de transferencia para agregar 110 μL de PEG del depósito de PEG utilizando una pipeta de 96 cápsulas. Asegúrese de que las posiciones correctas de origen y destino estén programadas de acuerdo con el diseño de la plataforma especificada. Programe el paso de transferencia para aspirar PEG a 1 mm del fondo del depósito y deposite el PEG a 3 mm de la base de la placa de 96 pocillos que contiene la mezcla de protoplasto/ADN. Agregue otro paso de agitación después de la adición de PEG copiando y pegando los pasos previamente programados.
9. Incubación PEG: Agregue un paso de pausa seleccionando el botón Pausa , seleccione el agitador e ingrese el tiempo de incubación predeterminado, que comienza con la adición de PEG.
   NOTA: El temporizador para la pausa continuará a menos que haya interrupciones o interrupciones en la cortina de luz que resulten en un mensaje de error. Asegúrese de que si es necesario manipular el mazo, estos mensajes se borren antes de alejarse.
10. Adición/mezcla de tampón W5: Agregue tres líneas de transferencia de 200 μL para transferir un total de 600 μL de tampón W5 a la placa de transfección para apagar la reacción de incubación PEG. Después de la adición del tampón W5, agite y haga una pausa para el usuario para permitir la centrifugación de la placa de transfección.
11. Pausa del usuario 1: Centrifugar la placa de transfección de protoplast a 100 x g durante 4 min. Vuelva a colocar la placa de transfección, ahora con protoplasto granulado, a la posición adecuada de la plataforma. Agregue la pausa del usuario haciendo clic en el botón Pausa , excepto que ahora con la opción Pausar todo el sistema y mostrar el mensaje seleccionada.
    NOTA: La ventana emergente del mensaje de pausa debe borrarse antes de que el controlador de líquidos continúe con el resto del protocolo.
12. Eliminación del sobrenadante: Añadir dos líneas de Transfer para eliminar 400 μL de sobrenadante y transferir a la placa de residuos. Para evitar la aspiración de células durante la extracción del sobrenadante, establezca la distancia desde la parte inferior en 6 mm.
13. Adición/mezcla de WI Agregue 3 líneas de Transfer para transferir 580 μL de tampón WI a la placa de transfección. Agregue otro paso de agitación después de la adición de WI copiando y pegando los pasos programados anteriormente. Continúe con la siguiente pausa del usuario.
14. Pausa del usuario 2: Centrifugar la placa de transfección de protoplasto a 100 x g durante 4 min. Vuelva a colocar la placa de transfección, ahora con protoplasto granulado, a la posición adecuada de la plataforma.
15. Eliminación del sobrenadante: Agregue cuatro líneas de Transfer para eliminar 680 μL de sobrenadante y transfiéralo a la placa de desecho. Para evitar la aspiración de células durante la extracción del sobrenadante, establezca la distancia desde la parte inferior en 6 mm.
16. Transferencia de protoplastos a la microplaca: La transferencia final de este protocolo se compone de dos pasos de transferencia de 150 μL. Antes de cada paso individual, aspire repetidamente los protoplastos a 50 μL/s a 2 mm de la parte inferior de la placa de transfección y dispense a 3 mm. A continuación, utilizando las mismas puntas de pipeta, transfiéralas a la microplaca de destino.
    NOTA: Aspirar y dispensar el volumen de tampón por encima del gránulo antes de transferirlo a la microplaca alterará cualquier protoplasto restante granulado en la parte inferior de la placa de transfección para garantizar que no haya pérdida de muestra. Dado que la aleatorización se realizó durante la creación de la placa de transfección, esto concluye el protocolo automatizado.
17. Incubar la microplaca a temperatura ambiente en la oscuridad durante 24 a 48 h antes de la primera medición de fluorescencia.

Results

Obtener datos observacionales que respalden que los efectos de borde pueden estar afectando a las mediciones de respuesta; Se llevó a cabo un estudio piloto para confirmar esas sospechas. Para este estudio, los métodos anteriores se aplicaron a tres placas replicadas de 96 pocillos con un solo nivel de tratamiento; todos los protoplastos se transfectaron utilizando pSYN11250¹⁹, un plásmido que expresa constitutivamente ZsGreen, con el objetivo de demostrar que existen diferencias sistemáticas en el nivel de respuesta para las unidades en el borde de la placa en comparación con la segunda fila y las regiones centrales de la placa. Los 36 pozos en el borde exterior de la placa se definen como bloque 1, los 28 pozos en la segunda fila desde el borde como bloque 2 y los 32 pozos centrales como bloque 3 - ver Figura 2A panel inferior derecho. Esta disposición puede acomodar 28 niveles de tratamiento como un diseño de bloque completo aleatorio (RCBD) o 32 niveles de tratamiento como un diseño de bloque incompleto aleatorio (RIBD). En la Figura 2A, para cada réplica (rep), los puntos de datos sin procesar para cada pozo se normalizaron por la media de esa placa respectiva. En las tres réplicas del experimento, las respuestas en el borde de la placa son, en promedio, de 1 a 1,5 veces más grandes que el mínimo. La Figura 2B muestra las medias de los bloques como un porcentaje de la media total de la placa para cada réplica. En la Tabla 2 se muestran las tablas de ANOVA de un factor a partir del ajuste de un modelo lineal con bloque como efecto fijo. Por razones relacionadas con la aleatorización restringida involucrada en los diseños de bloques, la inferencia basada en la prueba de hipótesis para el factor de bloqueo se considera aproximada en el mejor de los casos e inválida en el peor. Sin embargo, ajustar un modelo con un factor de bloqueo fijo es útil para evaluar si un esquema de bloqueo es beneficioso. Mn_Sq (bloque) representa la desviación cuadrática promedio de las medias del bloque con respecto a la media general. Mn_Sq (Error) representa la desviación cuadrática promedio de las observaciones individuales sobre sus respectivas medias grupales, en este caso, la media general ya que no hay ningún factor de tratamiento en el modelo. Cuando Mn Sq (bloque) es mayor que Mn Sq (error), es decir, la relación F es mayor que uno, el tamaño del error cuadrático medio se ha reducido efectivamente en relación con un diseño completamente aleatorizado (CRD), lo que aumenta el poder estadístico para comparar los tratamientos de interés y disminuye el ancho de los intervalos de confianza que estiman los contrastes de tratamiento. La Figura 2B muestra relaciones F que superan con creces uno, y la respuesta medida tiende a disminuir a medida que se mueve hacia el centro en las tres placas replicadas. En las tres réplicas, se observan intervalos de confianza del 95% en el nivel 0,05 para al menos un bloque que no cubre la media de la placa observada. Por lo tanto, se puede concluir que el esquema de bloqueo aumenta sustancialmente la precisión de estas estimaciones. Más allá de tener menos precisión, el hecho de no tener en cuenta la variabilidad de las molestias espaciales puede dar lugar a resultados espurios debido a la posibilidad de confundir los efectos del tratamiento con el efecto de borde.

Aunque existe una larga historia de protocolos de aislamiento y transfección de protoplastos de maíz etiolado que se remonta a principios de la década de 1990, este protocolo introduce algunas modificaciones adicionales al procedimiento tradicional para facilitar un aislamiento reproducible y masivo de protoplastos para fines de transfección de protoplastos de alto rendimiento²⁰. Los pasos de esterilización de la superficie de la semilla y el tejido foliar antes de la digestión reducen la contaminación fúngica sin necesidad de medios asépticos. El uso de tierra también ayudará a mantener bajos los costos en relación con el uso de medios de crecimiento especiales o la compra de recipientes desechables estériles de un solo uso. El protocolo en numerosas etapas se puede escalar para adaptarse a varios niveles de rendimiento. Aproximadamente 2 g de tejido de la primera hoja dan como resultado entre 5 x 10⁶ - 10 x 10⁶ protoplastos. Dado que se requieren 5 x 10⁶ protoplastos por transfección de placa de 96 pocillos, el protocolo de aislamiento, tal como está escrito, puede acomodar 2 corridas del protocolo de transfección. Este protocolo también utiliza MMg como solución de lavado en lugar de la solución W5 canónica. Esto se derivó originalmente de las publicaciones sobre el protoplasto de la raíz de Arabidopsis como medio para reducir el número de soluciones tampón utilizadas para cualquier paso dado del procedimiento de transfección de protoplasto²¹. Sin embargo, también se empleó para el protoplasto de hoja de maíz etiolado en 2022²². Una mejora adicional en el aislamiento y la transfección de cualquier protocolo de protoplasto sería la simplificación y reducción de las soluciones tampón. En su estado actual, este protocolo cambia entre el búfer de digestión canónico, el tampón W5, el búfer MMg y el búfer WI. La simplificación de las soluciones sería muy beneficiosa para mejorar la reproducibilidad de los experimentos con protoplastos y reducir la variabilidad de persona a persona o de lote a lote entre experimentos. Cabe destacar que la última novedad del protocolo es la falta de eliminación completa de las soluciones tampón tras la transfección de PEG. La razón por la que la automatización es posible es porque el protoplasto, el maíz etiolado que se muestra aquí y otros que hemos probado, es que parecen tolerar la dilución como un medio para apagar la reacción en lugar de la eliminación completa de las diferentes soluciones tampón¹¹. La producción de reporteros, como lo indica nuestro control de transfección de GFP utilizado aquí, indica que el protoplast puede tolerar hasta un 5% de PEG sin impacto negativo en la intensidad de fluorescencia (Figura suplementaria 6). Ese valor es más del doble de lo que sería la concentración anticipada de PEG al finalizar el protocolo descrito aquí.

Figura 1: Esquema ilustrativo del procedimiento de aislamiento y transfección de protoplastos. Los pasos en los que se ha introducido la automatización se indican mediante las líneas rojas discontinuas y los cuadros azules que las acompañan. Los números rodeados por un círculo rojo corresponden a los tres métodos descritos. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efecto de borde y el impacto de mitigar los diseños replicados. (A) Mapas topográficos que muestran el cambio de pliegue de la intensidad de fluorescencia para placas de 96 pocillos transfectadas con pSYN11250 en relación con la media de la placa para 3 experimentos de réplica independiente (Rep). El promedio de esos experimentos también se muestra con el esquema de bloqueo, indicado por las líneas punteadas de diferentes colores colocadas en la parte superior. (B) Gráficos de tiras que muestran las medias de bloques como un porcentaje de la media total de la placa para las placas replicadas 1, 2 y 3 de izquierda a derecha. Los círculos semitransparentes representan los puntos de datos sin procesar después de dividirlos por la media de la placa. Las barras de error son intervalos de confianza del 95% en el nivel 0,05, con el guión central que denota la media. Los colores marrón, dorado y gris indican el borde, la segunda fila y la parte interior del plato, respectivamente. La línea roja discontinua al 100% representa la media general de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Búfer	Reactivo
Digestión	1.5% Celulosa Rs
	0.3% Macroenzima
	0,6 m manitol
	MES de 10 mM (ph 5.7)
	1 mM CaCl2
	0.1% (p/v) BSA
	0,5 nM β-Mercaptoetanol o 0,5 mM TDT
Mmg	0,6 m manitol
	15 mM MgCl2
	4 mM MES, pH 5,7
W5	154 mM de NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM KCl
	2 mM MES, pH 5,7
WI	0,6 m manitol
	4 mM MES, pH 5,7
	4 mM KCl
CLAVIJA	30% PEG (c/v)
	0,6 m manitol
	100 mM CaCl2

Tabla 1: Soluciones tampón para el aislamiento y la transfección de protoplasto de maíz etiolado.

Representante	Fuente	Df	Suma Sq	Mn Sq	Valor F	Pr (>F)
Replicar 1	Bloquear	2	0.26	0.13	10.64	<0,001
	Residual	93	1.135	0.012
Replicar 2	Bloquear	2	0.507	0.25	21.41	<0,001
	Residual	93	1.102	0.012
Replicar 3	Bloquear	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	Residual	93	1.861	0.02

Tabla 2: Tabla de ANOVA de un factor para las tres réplicas del experimento de transfección pSYN11250 de 96 pocillos. Para cada placa replicada: la columna Fuente denota la fuente de variación, Df denota grados de libertad, Suma Sq denota suma de cuadrados, Mn Sq denota cuadrados medios (Suma Sq/Df), el valor F denota la relación entre Mn_Sq (bloque) y Mn_Sq (error) y Pr(>F) denota el valor p de la prueba F global.

Figura complementaria 1: Capturas de pantalla del panel de control del software. Categorías de selección que se refieren a la creación de un nuevo método, así como los diseños de mazos para los protocolos de aleatorización y transfección. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Pasos clave en la configuración del protocolo de creación de placas de transfección. Capturas de pantalla tomadas durante la creación del protocolo de creación de placas de transfección. El número y el título de cada panel corresponden a los pasos del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Capturas de pantalla para la manipulación de material de laboratorio y carga de puntas para la creación del protocolo de transfección. Estos representan pasos que ocurren numerosas veces a lo largo del protocolo, por lo que para evitar menciones repetidas, aquí se muestran pasos representativos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Mezcla de célula y ADN a través de la pausa del usuario 1. Capturas de pantalla tomadas durante la creación del protocolo de transfección. El número y el título de cada panel corresponden a los pasos dentro del cuerpo del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Eliminación del sobrenadante después de la pausa del usuario 1 mediante la transferencia de muestras a la microplaca. Capturas de pantalla tomadas durante la creación del protocolo de transfección. El número y el título de cada panel corresponden a los pasos dentro del cuerpo del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 6: Protoplasto de hoja de maíz etiolado transfectado ZsGreen tratado con diferentes concentraciones de PEG en el curso del tiempo del tampón WI. Gráfico de barras que muestra la intensidad relativa de fluorescencia del protoplasto después del tratamiento con PEG a las 24, 48 y 72 h con medición mediante un lector de microplacas. Barra de error = SD, n = 4. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este manuscrito describe un protocolo para automatizar la creación de placas de transfección y el aislamiento de protoplastos de hojas de maíz etiolado con una transfección automatizada. Para completar con éxito la parte del protocolo de creación de placas de transfección, se requiere un robot automatizado de manejo de líquidos que esté equipado con una cápsula de 8 canales. Para el protocolo de transfección, se recomienda una cápsula de 96 pocillos para una transfección completa y uniforme de la placa de 96 pocillos. El método de transfección se puede completar utilizando una cápsula de 8 canales, pero se debe prestar especial atención a la cantidad de tiempo que toman los pasos de aspiración y dispensación, así como al tiempo que se puede atribuir al cambio de puntas entre columnas. Está bien documentado que las diferencias en la duración de la incubación de PEG tienen un impacto significativo en la eficiencia y la expresión de la transfección y, por lo tanto, se debe considerar una atención especial a estos factores contribuyentes para evitar disparidades en el manejo de la muestra¹³. Antes de iniciar el protocolo de manipulador de líquidos, es importante tener en cuenta los pasos del protocolo y si ciertas actividades se pueden completar simultáneamente. Este protocolo utiliza un dispositivo que carga las puntas en la cápsula de 96 pocillos desde 1 posición en la cubierta. El manipulador de líquidos para este protocolo incluye una función en la que el robot intercambia las cajas de puntas durante los períodos de incubación o durante los pasos de pausa del usuario para evitar agregar tiempo adicional al protocolo. Al tomar la decisión de comprar un manipulador de líquidos, piense en la funcionalidad y las posibles comodidades para ahorrar tiempo.

Si bien este protocolo se desarrolló para utilizar dispositivos Beckman Coulter NXp y Biomek FX, este protocolo se puede adaptar a cualquier dispositivo de manejo de líquidos comparable. Todos los manipuladores de líquidos tienen algún medio para indicar cómo transferir volúmenes de un lugar a otro y cuánto. Para este protocolo, estos dispositivos utilizaban un comando de línea Transferir desde archivo. Si el material de laboratorio está definido correctamente, un usuario puede transferir desde o hacia cualquier recipiente. En circunstancias excepcionales, por ejemplo, si los bastidores de tubos o los adaptadores no están disponibles comercialmente, se puede utilizar la impresión 3D de dichos conectores. Para los protocolos típicos de transfección de protoplastos, 20 μg de ADN a una concentración de 1 μg/μL de transfección es un volumen estándar de material para numerosas plataformas de protoplastos¹³_. Durante la creación de la placa de transfección, como precaución adicional, utilice puntas de filtro de 0,2 a 20 μL para minimizar cualquier riesgo de contaminación debido al plásmido en aerosol durante la transferencia. La eliminación del componente humano de la preparación reduce la variación a lo largo del tiempo y mejora la reproducibilidad de estos experimentos de alto rendimiento. Además, los platos se pueden preparar con mucha anticipación. Esta preparación aliviará el estrés del científico de transfección el día del experimento. Sin embargo, es importante evitar almacenar estas placas de ADN plasmídico a 4 °C durante largos períodos de tiempo, ya que las muestras pueden evaporarse. Las muestras deben almacenarse en un congelador de -20 °C y luego se pueden descongelar en el refrigerador de 4 °C antes de la transfección. Una vez que se programa este protocolo de creación de placas de transfección, debe ser fácilmente repetible suministrando un nuevo .csv de transferencia desde archivo y ocupando las mismas ubicaciones de la plataforma para las muestras, el material de laboratorio y los reactivos.

Para el procedimiento de transfección automatizado (paso 3), se prepara un excedente de solución de PEG para garantizar una aspiración igual del líquido viscoso desde el canal, normalmente un exceso de 40 mL para tener en cuenta el volumen muerto. El uso exacto de la cantidad necesaria para la transfección puede dar lugar a que el aire entre en las pipetas y a que se aspiren volúmenes desiguales de PEG a través del cabezal de 96 canales. Si bien esta solución también se puede preparar con anticipación, se recomienda prepararla el día de la transfección. La esterilización de la solución de PEG se puede realizar con un filtro de jeringa, pero debido a la viscosidad puede ser difícil. El uso de una unidad de filtro de vacío es más rápido y puede aliviar cualquier frustración o dolor asociado con esta actividad. Al igual que la solución PEG, también se proporciona un exceso de las otras soluciones tampón de transfección (W5, WI) para garantizar un pipeteo uniforme en todo el cabezal de 96 canales. Las soluciones tampón (W5 y WI) se pueden preparar con anticipación a granel para usarlas en futuras ejecuciones del manipulador de líquidos. Si bien los reactivos no son costosos, hay una buena cantidad de sacrificio de solución tampón. Con el aumento del número de carreras por día, puede ser mejor usar alternativas al depósito que reduzcan el exceso desechado al final de la carrera. Durante la ejecución del protocolo del manipulador de líquidos, W5 y WI se pueden agregar a sus respectivos canales antes del inicio del protocolo, durante la incubación de 15 minutos o durante los pasos de pausa del usuario en el protocolo. Tenga cuidado al agregar tampones durante el período de incubación debido a las características de seguridad como una cortina de luz. Asegúrese de borrar los mensajes de advertencia del software para evitar cualquier interrupción involuntaria del protocolo.

Este protocolo refleja una mejora fiable, repetible y ampliamente aplicable respecto a los protocolos automatizados previamente documentados para el manejo de protoplast^12,13. Este método es adaptable al repertorio aparentemente interminable de protocolos de protoplastos, ya que muchos dependen de la misma serie de pasos de manipulación del tampón. La mitigación del efecto de borde a través del RICBD durante la creación automatizada de la placa de transfección reduce simultáneamente la cantidad de esfuerzo y variabilidad al tiempo que aplica una corrección estadísticamente significativa del efecto de borde. Una transfección de protoplasto en vaina de 96 pocillos elimina la posibilidad de cualquier variación asociada con el tiempo de incubación de PEG, llevando a cabo la reacción dentro de los 96 pocillos simultáneamente. Si bien el protocolo estaba destinado a lograr la automatización completa de los pasos de transfección, las pausas del usuario requerirán la intervención física del científico de transfección. En los últimos años, ha habido muchos avances en centrífugas tolerantes a los desequilibrios y compatibles con la automatización. Con este equipo, sería posible automatizar todo el método sin la participación del usuario. Alternativamente, otros protocolos han evitado la centrifugación permitiendo que el protoplasto se deposite en el fondo del pocillo después de la transfección^12,13. Sin embargo, esto agregará tiempo adicional al procedimiento de transfección y un exceso de tiempo de incubación en el tampón W5 antes de la incubación nocturna en WI.

En numerosos lugares del método de transfección, describe el manejo de volúmenes superiores a 200 μL donde el manejo de líquidos debe realizarse mediante transferencias múltiples. Dependiendo de la antigüedad y el modelo del manipulador de líquidos, este paso podría y debería realizarse como un solo volumen. Para los manipuladores de líquidos más antiguos, como el modelo descrito aquí, lo máximo que se puede aspirar con una cabeza de 96 pocillos es de 200 μL. Una mejora obvia del método, tanto en eficiencia como en precisión, sería reducir el número de transferencias para minimizar cualquier riesgo potencial de derrame, goteo o contaminación. Otras consideraciones para la mejora de los protocolos de manejo de líquidos se esbozan en las revisiones de estas tecnologías y su utilización en el campo de la biotecnología²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoetanol	Sigma	M6250
Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico (MES) monohidrato	Sigma	69892
Tubos de centrífuga de 50 ml con tapa plana estéril	Fisher	22-010-064
96 Pocillo Óptico Btm Plt PolymerBase Negro con Tapa Cultivo de Células Estéril PS .4mL Pozo	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Puntas robóticas, no estériles, de diámetro ancho	Fisher	14-222-096
Puntas robóticas Axygen Filtro de 30 uL, estéril, con bastidor	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Desecadores al vacío de estilo redondo	Fisher	08-648-10
Bemis 2 PULG. x 250 pies rollo de parafilm de laboratorio	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Hemocitómetro	Fisher	50-131-1352
Lejía Germicida Clorox, Cinta de	Fisher	NC1871274
Corning	Fisher	07-200-684
Corning Bloques de ensayo de 96 pocillos, 2 mL, estándar de 96 pocillos	Fisher	07-200-701
DL-Ditiotreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Manitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Jeringa de Plástico	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Colador de Células Estériles 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Placas de Petri con Tapa Transparente, Apilables, 100 mm x 25 mm, Caja de 325	Fisher	FB0875711
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma	M2670
Unidad de filtro accionada por jeringa Millex estéril de 33 mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Unidad de filtro accionada por jeringa estéril de 33 mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Unidades de filtro de vacío desechables estériles estériles 50 ml PES	Fisher	SCGP00525
Poli(etilenglicol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Tapón & Mezcla de plántulas	Wyatt Quarles	GP92747
Hojas de afeitar de un solo filo de servicio regular respaldo de acero .009RD	Fisher	12-640
investigación International Corp Celulase RS	Fisher	50-213-232
Productos de investigación International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Cloruro de sodio	Sigma	S7653
Inserto de bandeja - 36 celdas - 6x6 anidados	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1, 100-120 V, 50/60 Hz, enchufe EE. UU	VWR	97058-164