Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas

Summary

Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.

Abstract

El cristalino ocular es un tejido transparente y flexible que altera su forma para enfocar la luz desde diferentes distancias en la retina. Aparte de una membrana basal que rodea el órgano, llamada cápsula, el cristalino es completamente celular y consiste en una monocapa de células epiteliales en el hemisferio anterior y una masa masiva de células de fibra del cristalino. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan en la zona germinativa en el ecuador del cristalino, y las células epiteliales ecuatoriales migran, se alargan y se diferencian en células de fibra recién formadas. Las células epiteliales ecuatoriales alteran sustancialmente la morfología de células empaquetadas al azar en forma de adoquín a células alineadas en forma de hexágono que forman filas meridionales. Las células de fibra del cristalino recién formadas conservan la forma de célula hexagonal y se alargan hacia los polos anterior y posterior, formando una nueva capa de células que se superponen a las generaciones anteriores de fibras. Poco se sabe sobre los mecanismos que conducen a la notable morfogénesis de las células epiteliales del cristalino a las células fibra. Para comprender mejor la estructura, el desarrollo y la función de las lentes, se han desarrollado nuevos protocolos de obtención de imágenes para obtener imágenes de estructuras periféricas utilizando monturas completas de lentes oculares. Aquí, se muestran métodos para cuantificar el grosor de la cápsula, el área de las células epiteliales, el área y la forma del núcleo de la célula, el orden y el empaquetamiento de las células de la fila meridional y el ancho de las células de las fibras. Estas mediciones son esenciales para dilucidar los cambios celulares que ocurren durante el crecimiento del cristalino a lo largo de la vida y comprender los cambios que ocurren con la edad o la patología.

Introduction

El cristalino ocular es un tejido flexible y transparente situado en la región anterior del ojo que funciona para enfocar la luz en la retina. La capacidad de funcionamiento de la lente se puede atribuir, en parte, a su intrincada arquitectura y organización 1,2,3,4,5,6. Alrededor del tejido del cristalino se encuentra la cápsula, una membrana basal esencial para mantener la estructura del cristalino y las propiedades biomecánicas ^7,8,9. El cristalino en sí es completamente celular, y consta de dos tipos de células: epiteliales y fibrosas. La capa epitelial está formada por una monocapa de células cuboidales que recubren el hemisferio anterior del cristalino¹⁰. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan y migran a lo largo de la cápsula del cristalino hacia el ecuador del cristalino. Las células epiteliales anteriores están en reposo y en sección transversal, y cerca del ecuador del cristalino, las células epiteliales proliferan y comienzan a experimentar el proceso de diferenciación en nuevas células de fibra^11,12. Las células epiteliales ecuatoriales se transforman de células empaquetadas al azar en filas meridionales organizadas con células en forma de hexágono. La forma de las células hexagonales se mantiene en el lado basal de estas células diferenciadoras, mientras que el lado apical se contrae y se ancla en el punto de apoyo del cristalino o modiolo 4,13,14,15. A medida que las células epiteliales ecuatoriales comienzan a alargarse en células fibrosas recién formadas, las puntas apicales de las células migran a lo largo de la superficie apical de las células epiteliales anteriores hacia el polo anterior, mientras que las puntas basales se mueven a lo largo de la cápsula del cristalino hacia el polo posterior. Las nuevas generaciones de células de fibra se superponen a las generaciones anteriores de células, creando capas esféricas de fibras. Durante el proceso de elongación y maduración celular, las células de fibra alteran sustancialmente su morfología 11,12,16. Estas células de fibra forman la mayor parte de la masa del cristalino 11,12,16,17,18.

Los mecanismos moleculares que contribuyen al establecimiento de las intrincadas microestructuras del cristalino, la morfología celular y la organización celular única no se conocen del todo. Además, la contribución de la cápsula del cristalino y la estructura celular a la función general del cristalino (transparencia, cambio de forma del cristal) no está clara. Sin embargo, estas relaciones están siendo dilucidadas utilizando una nueva metodología de imagen y evaluaciones cuantitativas de las características estructurales y celulares del cristalino 2,4,19,20,21,22. Se han desarrollado nuevos protocolos para obtener imágenes de lentes completas que permiten la visualización de alta resolución espacial de la cápsula del cristalino, las células epiteliales y las células de fibra periférica. Esto incluye la metodología para cuantificar el grosor de la cápsula, el tamaño de la célula, el tamaño y la circularidad del núcleo celular, el orden de las hileras meridionales, el empaquetamiento de las células de fibra y el ancho de las células de fibra. Estos métodos de visualización y cuantificación de imágenes permiten un examen morfométrico en profundidad y tienen ventajas sobre otros métodos de visualización (imágenes de montajes planos o secciones de tejido) al preservar la estructura general del tejido en 3D. Estos métodos han permitido probar nuevas hipótesis y permitirán un avance continuo en la comprensión del desarrollo y la función del patrón de las células del cristalino.

Para los siguientes experimentos, utilizamos ratones de tipo salvaje y Rosa26-tdTomato tándem dímero-Tomate (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) en el fondo C57BL/6J entre las edades de 6 y 10 semanas, de ambos sexos. Los ratones tdTomato permiten la visualización de las membranas plasmáticas celulares en lentes vivas a través de la expresión de la proteína tdTomato fusionada con los aminoácidos N-terminal 8 de una proteína MARCKS mutada que se dirige a la membrana plasmática a través de la miritilación N-terminal y los sitios internos de cisteína-palmitoilación²³. También utilizamos ratones NMIIA^{E1841K/E1841K 24} obtenidos originalmente del Dr. Robert Adelstein (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). Como se describió anteriormente²⁰, los ratones NMIIA^{E1841K/E1841K} en el fondo FvBN/129SvEv/C57Bl6 que tienen pérdida de la proteína de filamento intermedio con perlas CP49 (mantiene la morfología de la célula de fibra madura y la biomecánica del cristalino completo), se retrocruzan con ratones de tipo salvaje C57BL6/J. Examinamos a las crías para detectar la presencia del alelo CP49 de tipo salvaje.

Las imágenes confocales se realizaron en un microscopio de fluorescencia confocal de barrido láser con un aumento de 20x (NA = 0,8, distancia de trabajo = 0,55 mm, zoom 1x), 40x (NA = 1,3 objetivo de aceite, distancia de trabajo = 0,2 mm, zoom de 1x) o 63x (NA = objetivo de aceite de 1,4, distancia de trabajo = 0,19 mm, zoom de 1x). Todas las imágenes se adquirieron utilizando un tamaño estenopeico, que es un determinante del espesor de la sección óptica, a 1 unidad de Airy (los espesores ópticos resultantes se indican en las leyendas de las figuras). Las imágenes fueron procesadas en Zen Software. Las imágenes se exportaron a .tif formato y luego se importaron al software FIJI ImageJ (imageJ.net).

Protocol

Los ratones se alojan en las instalaciones de animales de la Universidad de Delaware, mantenidas en un entorno libre de patógenos. Todos los procedimientos con animales, incluida la eutanasia por inhalación de CO₂ , se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Delaware.

1. Preparación e imagen de la montura de la lente completa

1. Fijación de lentes para imágenes de montura completa
   1. Después de la eutanasia, enuclear los ojos y diseccionar las lentes como se describió anteriormente²⁵. Después de la disección, transfiera las lentes inmediatamente a solución salina tamponada con fosfato 1x fresca (PBS; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO_{4-7H 2}O; pH 7,4) a temperatura ambiente.
      NOTA: La morfología celular puede verse alterada si las lentes se almacenan en PBS durante un período prolongado de tiempo, por lo tanto, se recomienda fijarlas inmediatamente dentro de ~ 10 minutos de la disección.
   2. Para obtener imágenes de montaje completo de la región anterior de la lente, fije las lentes enteras sumergiéndolas en 0,5 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% recién hecho en 1x PBS en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lave las lentes 3 veces (5 minutos por lavado) con 1x PBS. Continúe con el paso 1.2 o almacene en 1x PBS a 4 °C. Las lentes fijas se pueden almacenar hasta por 5 días.
   3. Para obtener imágenes de montura completa de la región ecuatorial de la lente, fije las lentes enteras sumergiéndolas en 0,5 ml de PFA al 4 % recién hecho en 1x PBS en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Después de 1 h, lave las lentes 3 veces (5 minutos por lavado) con 1 PBS. Continúe con el paso 1.3 o almacene en 1x PBS a 4 °C. Las lentes fijas se pueden almacenar hasta por 5 días.
2. Montura completa de la región anterior de la lente (fija o viva)
   1. Para obtener imágenes de montura completa de lentes fijas, continúe con el paso 1.2.3.
   2. Para obtener imágenes de montura completa de lentes vivos, transfiera los lentes a un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenga 1 ml de medio 199 (sin rojo de fenol) que contenga 1 % de antibiótico/antimicótico. Incubar las lentes a 37 °C y 5% de CO₂ hasta la obtención de imágenes. Antes de la obtención de imágenes, incube las lentes en una solución que contenga aglutinina de germen de trigo marcada con fluorescencia (WGA-640, 1:500) y Hoechst 33342 (1:500) en medio 199 durante al menos 10 minutos. Continúe con el paso 1.5.
   3. Para teñir la cápsula del cristalino, la F-actina y los núcleos de los cristalinos fijos, coloque los cristalinos en una solución de 500 μl que contenga WGA-640 (1:500), rodamina-faloidina (1:50) y Hoechst 33342 (1:500) en tampón de permeabilización/bloqueo (1x PBS que contenga 0,3% de Tritón, 0,3% de albúmina sérica bovina (fracción V) y 3% de suero de cabra) en un tubo de microcentrífuga. Tiñe las lentes a 4 °C durante la noche.
   4. Después de la incubación durante la noche, lave las lentes 3 veces (5 minutos por lavado) con 1 ml de 1x PBS. Proceda a la obtención de imágenes de las lentes.
   5. Para estabilizar el cristalino fijo para la obtención de imágenes confocal, cree hendiduras de inmovilización del cristalino en agarosa en una antena parabólica de imagen como se ha descrito anteriormente²¹ (Figura 1).
      1. Caliente y mezcle suavemente la agarosa al 2% en PBS usando un microondas hasta que la solución esté licuada. Pipetear 250 μL de agarosa licuada al 2% en un plato con fondo de vidrio (Figura 1A) y aplanar la agarosa a lo largo del plato con un cubreobjetos de plástico flexible (Figura 1B). Una vez que la agarosa se enfríe y se solidifique por completo, retire el cubreobjetos con pinzas de punta fina (Figura 1C) y use un punzón de biopsia de 3 mm para crear un orificio en agarosa en el centro del plato (Figura 1D).
      2. Retire el exceso de agarosa con una toallita delicada (Figura 1E). Mantener el moho de agarosa hidratado con 1x PBS y mantener a 4 °C hasta su uso. Los moldes de agarosa se han almacenado con éxito hasta por 1 semana.
   6. Con una pinza para embriones, transfiera suavemente la lente viva o fija a la hendidura de la agarosa (Figura 1F), que contiene ~ 2 ml de 1x PBS (lente fija) o Medium 199 (lente viva) sin rojo de fenol, y luego coloque la placa en una platina de microscopio invertida. Para confirmar que el cristalino está situado con la región anterior orientada hacia el objetivo, visualice la tinción de núcleos. Si no se observan núcleos, la región posterior puede estar orientada hacia el objetivo.
   7. Para invertir la lente, use pinzas curvas y gire suavemente la lente ~ 180 ° para que la región anterior mire hacia el objetivo. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal.
   8. Para la visualización de cápsulas de lentes, adquiera imágenes de pila z utilizando un objetivo de 40x con un tamaño de paso de 0,3 μm. Adquiera la primera imagen antes de la superficie de la cápsula del cristalino (indicada por la tinción WGA) y la última imagen después de la superficie apical de las células epiteliales. Para visualizar las células epiteliales, adquiera imágenes de pila z utilizando un objetivo de 63x con un tamaño de paso de 0,3 μm para la visualización de las células epiteliales del cristalino.
      NOTA: Estos parámetros del microscopio permiten una adecuada reconstrucción tridimensional (3D) de las imágenes, lo cual es esencial para la cuantificación de imágenes del grosor de la cápsula o del área de las células epiteliales. También es posible obtener imágenes de suturas en lentes vivas tdTomato mediante imágenes más allá de la monocapa de células epiteliales, como se describió anteriormente⁴.
3. Tinción de células epiteliales ecuatoriales y fibrosas del cristalino
   1. Coloque las lentes fijas en una solución de 0,5 ml de rodamina-faloidina (1:300), WGA-640 (1:250) y Hoechst 33342 (1:500) en una solución de permeabilización/bloqueo (3% de BSA, 3% de suero de cabra y 0,3% de Triton) dentro de un tubo de microcentrífuga. Mantener a 4 °C durante la noche.
   2. Después de la incubación durante la noche, lave las lentes 3 veces en 1 ml 1x PBS (5 minutos por lavado).
   3. Cree cuñas de agarosa de inmovilización del cristalino como se describió anteriormente ^4,10.
      1. Brevemente, cree gajos de agarosa en platos con fondo de vidrio (FD35-100, WPI) vertiendo ~ 5-6 ml de agarosa fundida al 2% en 1x PBS en platos (Figura 2A). Una vez que la agarosa se solidifique (Figura 2B), cree una hendidura triangular con una cuchilla afilada (Figura 2C). Retire la rodaja de agarosa y coloque 1 ml de 1x PBS en el plato de agarosa (Figura 2D).
      2. Aspire cualquier residuo de agarosa que pueda quedar al cortar la agarosa. Se pueden crear varias cuñas por plato para adaptarse a varios tamaños diferentes de lentes (no se muestran). Para almacenar el molde de agarosa, coloque 1 ml de 1x PBS en el molde de agarosa y manténgalo a 4 ° C. Las cuñas se pueden conservar hasta por 1 semana.
   4. Con pinzas curvas, coloque la lente dentro de una cuña de agarosa que contenga 1 ml de PBS 1x y ajústela de modo que la región ecuatorial de la lente quede hacia abajo sobre el vidrio del microscopio por encima del objetivo confocal (Figura 2E-F). Para confirmar que la región ecuatorial está enfocada, visualice los núcleos y asegúrese de que los núcleos estén alineados en filas en el ecuador. Las células epiteliales ecuatoriales también se pueden identificar, ya que están empaquetadas y formadas de forma irregular. Además, las células de la fila meridional están alineadas con precisión y tienen forma hexagonal, lo que se indica mediante la tinción de F-actina en las membranas celulares.
   5. Si los núcleos en el campo de visión están empaquetados aleatoriamente, el lado anterior de la lente está orientado hacia el objetivo. Si no se pueden observar los núcleos, lo más probable es que la parte posterior del cristalino esté orientada hacia el objetivo. Si la lente no está asentada en su ecuador, reoriente la lente y use la pinza curva para girar la lente hasta que se observen los núcleos alineados con precisión en el ecuador de la lente.
   6. Obtener imágenes de las células epiteliales ecuatoriales y de fibra del cristalino utilizando un microscopio confocal de barrido láser (objetivo 20x, NA = 0,8, tamaño del paso 0,5 μm y/o objetivo de aceite 40x, NA = 1,3, tamaño del paso 0,4 μm). Gire las imágenes antes de la recolección de la pila z, en la que las células epiteliales ecuatoriales están en la parte superior, seguidas de la fila meridional y las células de fibra justo debajo.

2. Metodología de análisis de imágenes

1. Medición del grosor de la cápsula de la lente
   1. Utilizando imágenes de pila z obtenidas con un objetivo de 40x (tamaño de paso de 0,3 μm) de lentes tdTomato en vivo marcadas con WGA o lentes fijas marcadas con WGA y rho-faloidina, obtenga una proyección óptica 2D en la vista XZ de la reconstrucción 3D y guárdela en formato .tif. Procese imágenes con el software Zen.
   2. Abra imágenes de corte XZ (.tif) en el software FIJI ImageJ.
   3. Para medir el grosor de la cápsula de la lente, utilice la función de línea recta (representada en la Figura 3A, B). Establezca el ancho de línea en 50 píxeles seleccionando Editar > Opciones > Ancho de línea. Se determinó empíricamente que este ancho de línea proporcionaba una alta relación señal-ruido con los ajustes del microscopio. El ancho de línea óptimo puede diferir en otros microscopios/configuraciones de microscopio o cuando se usan lentes de otras especies. A continuación, dibuja una línea desde la superficie superior de la cápsula hasta debajo de la región basal de las células epiteliales.
   4. Guarde la línea como región de interés pulsando Ctrl + T.
   5. Separe los canales en pestañas para la imagen, el color y los canales divididos.
   6. Mida la intensidad a lo largo de la línea para el canal de la cápsula presionando Ctrl + K.
   7. En una hoja de cálculo, grafique los valores de intensidad en función de la distancia y determine los picos de intensidad para la cápsula y la F-actina, que representan la superficie de la cápsula y la región basal de las células epiteliales, respectivamente. En el eje x está la distancia de la línea.
   8. A continuación, calcule el grosor de la cápsula determinando la distancia entre los picos de intensidad fluorescente de la cápsula y los epitelios (Figura 3C, D).
2. Análisis del área celular
   1. Utilizando imágenes de pila z obtenidas con una lente de objetivo de 63x (NA = 1,4; tamaño de paso de 0,3 μm) en lentes tdTomato en vivo o lentes fijas marcadas con faloidina, analice un corte de vista XY de una imagen confocal de pila z correspondiente a donde se enfoca la región media (lateral) de las células epiteliales. Tenga en cuenta que las membranas laterales son visibles usando el tinte de membrana tdTomato o visualizando la faloidina que está presente en las membranas celulares laterales.
      NOTA: Debido a la curvatura de la lente (como se ve en una vista XZ; Figura 4A-C), no todas las células epiteliales estarán enfocadas en la imagen. La región media del epitelio corresponde a la región donde se enfocan tanto las membranas laterales celulares (Figura 4D-E) como los núcleos (Figura 4G-I).
   2. Exporte la imagen como un .tif y ábrala en FIJI ImageJ.
   3. Para establecer la escala en FIJI ImageJ para el análisis, utilice la herramienta de línea para crear una línea que tenga la longitud de una barra de escala a partir de la imagen confocal.
   4. Registre la longitud en píxeles de la línea y la longitud de la barra de escala. Vaya a Analizar en el menú de la barra de herramientas y seleccione Establecer escala. Introduzca el número de píxeles que es la longitud de la línea en Distancia en píxeles y en Distancia conocida introduzca la longitud conocida de la barra de escala.
   5. Utilizando la tinción tdTomato o rodamina-faloidina como indicación de los límites de las celdas, delinee manualmente una población de células que estén enfocadas dentro de la imagen con la herramienta poligonal. Solo trace las células donde las membranas laterales sean visibles (Figura 4E) y evite trazar células parcialmente visibles (es decir, en el borde de las imágenes). Guarde el ROI presionando Ctrl + T. Vaya a Editar en el menú de la barra de herramientas y seleccione Borrar exterior. Ahora mida el área total de la celda (ROI) presionando Ctrl + M en FIJI ImageJ.
   6. Calcule el área de celda promedio dividiendo el área de ROI por el número total de celdas. Una forma sencilla de determinar el número de células es contando el número de núcleos. Vaya al canal de núcleos (azul). En el menú ROI, seleccione el esquema de ROI guardado de las celdas (Figura 4G). Para borrar fuera del ROI, vaya a Editar y, a continuación, haga clic en Borrar fuera (Figura 4H). Con la herramienta Multipunto, cuente los núcleos haciendo clic en núcleos individuales.
3. Análisis del área nuclear celular y de la forma
   1. Para el análisis del área y la forma de los núcleos, analice una sección óptica de vista de plano XY a partir de una imagen confocal de pila z correspondiente a donde se enfoca la región media (lateral) de las células epiteliales de tdTomato. Analice un corte de pila z a partir de una imagen confocal donde el área nuclear es la más grande (Figura 5A); Esto representa la parte media de los núcleos.
      NOTA: Tenga en cuenta que debido a la curvatura de la lente, no todos los núcleos estarán enfocados, como se puede ver en la vista XZ (Figura 4G y Figura 5A).
   2. Seleccione una subpoblación de núcleos que estén en el foco y guarde un ROI.
   3. Utilice la función Borrar exterior . Dentro del ROI, utilizando la herramienta de selección a mano alzada (cuarto botón de menú desde la izquierda), trace cuidadosamente los bordes de los núcleos (Figura 5B). Guarde cada traza nuclear en la ventana ROI presionando Ctrl + T. Solo delinee los núcleos donde se puedan ver los núcleos completos y los núcleos no se toquen entre sí.
   4. Una vez que todos los núcleos estén delineados, mida el área nuclear y la forma de las células individuales (es decir, la circularidad) presionando Ctrl + M.
   5. Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo y calcule el área nuclear media y la circularidad (Figura 5C).
4. Empaquetamiento epitelial de hileras meridionales
   1. Para medir el trastorno de la hilera meridional, adquiera imágenes con un objetivo de 20x (tamaño de paso de 0,5 μm).
   2. Identifique el punto de apoyo/modiolo de la lente en las imágenes. El punto de apoyo es la región donde las puntas apicales de las células epiteliales alargadas se contraen para formar un punto de anclaje durante la diferenciación y elongación inicial de las células de fibra en el ecuador. Identifique el punto de apoyo en función de la intensidad brillante de la actina F (indicada por la punta de flecha en la vista XZ en la Figura 6A; indicada por una línea discontinua roja en la Figura 6B) y el cambio en la organización celular en una sola sección óptica en la vista XY.
      NOTA: Además, la tinción de F-actina de las regiones basal y apical de las células epiteliales es aparente por encima del punto de apoyo, mientras que solo la región basal de las células alargadas es aparente por debajo del punto de apoyo (Figura 6A). Las células epiteliales por encima de la línea de apoyo están empaquetadas irregularmente y tienden a formar rosetas, mientras que las células de fibra por debajo del punto de apoyo están dispuestas en filas paralelas, indicadas por la tinción de actina F brillante en la membrana (Figura 6B).
   3. Una vez identificado el punto de apoyo en ratones de 2 meses de edad, seleccione la sección óptica única ~4,5-5 μm periférica al punto de apoyo (hacia la cápsula del cristalino) en el plano XY. Esta distancia se selecciona en función de la observación de que todos los núcleos de las células de la fila meridional en ratones de 2 meses de edad están enfocados cuando están a ~5 μm periféricos al punto de apoyo. Guarde la sección óptica única (.tif). Abra la imagen en FIJI.
      NOTA: Este análisis solo se ha realizado en ratones de 2 meses de edad y, por lo tanto, no se puede concluir si esta distancia cambia con la edad.
   4. Antes de realizar el análisis de imágenes, establezca la escala en μm en ImageJ mediante el paso 2.2.2.
   5. Delinee manualmente todas las regiones de la fila meridional utilizando la herramienta de línea a mano alzada (región de interés/ROI) identificando la alineación nuclear, como se muestra en la Figura 7A. Guarde el ROI presionando Ctrl + T. Vaya a Editar en el menú de la barra de herramientas y seleccione Borrar exterior. Mida el área total de celda (ROI) presionando Ctrl + M en FIJI ImageJ.
   6. Identifique cualquier región de desorden indicada por la tinción de actina F delineando con la herramienta de línea a mano alzada en FIJI ImageJ. Los criterios para las regiones desordenadas incluyen la ramificación de las filas, el empaquetamiento irregular y la desalineación de las filas (Figura 7B), como se mostró anteriormente²⁰.
   7. Mida el área desordenada delineada/parcheada presionando Ctrl + M en FIJI ImageJ. Suma el área total desordenada en una hoja de cálculo.
   8. Divida el área total desordenada por el área de ROI, luego multiplíquelo por 100 para obtener un porcentaje de área desordenada. Si no se observa ningún trastorno, coloque un valor de 0% para el área desordenada.
5. Número de fila meridional de células vecinas
   1. Para medir el número de células vecinas, utilice imágenes teñidas con actina F adquiridas con un objetivo de aceite de 40x (tamaño de paso de 0,4 μm).
   2. Identifique una sección óptica (plano XY) en la región basal de las células de la fila meridional hacia adentro de la cápsula del cristalino donde la actina F está enriquecida alrededor de todo el perímetro de las células de la fila meridional, todas las células de la fila meridional están enfocadas y están en el mismo plano.
   3. Cuente el número de celdas adyacentes que tiene cada celda de la fila meridional (Figura 8). Mida el porcentaje promedio de celdas con seis celdas adyacentes en una hoja de cálculo.
      NOTA: Determine el número de celdas adyacentes con un objetivo de 20x. Sin embargo, es significativamente más fácil observar la forma del hexágono con un objetivo de 40x.
6. Análisis de imágenes de células de fibra ecuatorial
   1. Tome imágenes confocales de pila z de lentes teñidas con rodamina faloidina con un objetivo de 20x (tamaño de paso de 0,5 μm).
   2. Identifique el punto de apoyo como se indica en el paso 2.4.2. Una vez identificado el punto de apoyo, seleccione una sola sección óptica. Para fines de estandarización y para comparar entre lentes, cuantifique los anchos de celda de fibra ~ 10 μm hacia adentro desde el punto de apoyo en el plano XY (Figura 9A).
   3. Exporte imágenes sin procesar a FIJI ImageJ. En FIJI ImageJ, dibuje una línea (generalmente ~300-400 μm de largo) a través de varias celdas de fibra adyacentes para medir la distancia entre los picos teñidos con actina F (análisis de escaneo lineal; Figura 9A; línea rosa).
   4. Obtenga la intensidad fluorescente sobre la distancia de escaneo lineal en FIJI presionando Ctrl + K. A continuación, exporte los datos a la hoja de cálculo para calcular la distancia entre picos (ejemplo que se muestra en la Figura 9A-B). Esto corresponde a los anchos de celda de fibra.

Results

Cápsula anterior del cristalino, área de células epiteliales y área nuclear
Para analizar el grosor de la cápsula de la lente, tiñimos las cápsulas de la lente, ya sea en lentes vivas o fijas, con WGA. Identificamos las células epiteliales del cristalino marcando las membranas con tdTomato en lentes vivas (Figura 2A), o mediante tinción de rodamina-faloidina para F-actina en las membranas celulares de lentes fijas (Figura 2B). En una proyección ortogonal (XZ), la tinción para WGA y tdTomato/rodamina-faloidina nos permite realizar un análisis de línea de exploración de pico a pico de la intensidad de la fluorescencia. El pico mayor en el canal WGA indica la superficie capsular, mientras que el pico mayor en el canal tdTomate/rodamina-faloidina indica la región basal de las células epiteliales. Calculando la distancia entre estos picos, podemos obtener el espesor capsular. El análisis de barrido lineal muestra que las cápsulas de una lente viva de ratones de 9 semanas de edad tenían un grosor de 11,2 μm, y las cápsulas de una lente fija de ratones de 9 semanas tenían un grosor de 12,5 μm. Estos espesores de cápsula observados son representativos de hallazgos previos ^2,4.

Las imágenes de montura completa de lentes de ratón transgénicas marcadas con tdTomato (o lentes teñidas con rodamina-faloidina; no se muestran) permiten la visualización en vivo de la morfología de las células epiteliales. La proyección ortogonal (XZ) proporciona una vista lateral de la célula epitelial del cristalino, mientras que la vista plana (XY) en las regiones laterales permite la visualización de la forma poligonal epitelial. En las lentes sanas, no observamos ningún espacio entre las células. Podemos calcular el área promedio de la celda rastreando una población de células en una imagen y dividiendo el área por el número de celdas dentro del ROI. El número de células se determina contando el número de núcleos teñidos con Hoechst en un ROI determinado. El análisis demuestra un área celular promedio de 260^μm2, lo que está en consonancia con estudios previos ^2,4.

La tinción de Hoechst de los núcleos también permite examinar la morfometría nuclear de las células epiteliales del cristalino en las células epiteliales. Las proyecciones ortogonales (XZ) permiten una vista lateral de los núcleos. La vista plana (XY) muestra las formas circulares/elipsoides de los núcleos. El rastreo de núcleos permite calcular el área nuclear de las células individuales y otros parámetros de forma, como la circularidad. El análisis demuestra un área nuclear media de 64^μm2 con una circularidad media de 0,8. Los valores de circularidad cercanos a 1 indican un círculo perfecto, mientras que los valores cercanos a 0 indican una morfología más alargada.

Empaquetamiento de células epiteliales ecuatoriales, empaquetamiento hexagonal de células de fibra y anchos de células de fibra
La vista plana (XY) de la región ecuatorial del cristalino muestra células epiteliales del cristalino en forma de hexágono y empaquetadas regularmente que convergen en el punto de apoyo. El punto de apoyo es donde las puntas apicales de las células epiteliales en elongación se contraen para formar un punto de anclaje durante la diferenciación y elongación inicial de las células de fibra en el ecuador 4,13,14,15 (Figura 6B, indicada por una línea discontinua roja). El punto de apoyo se puede localizar en función del aumento de la tinción de F-actina formando una línea continua que separa las células epiteliales ecuatoriales y las células de fibra (Figura 6B, línea discontinua roja). La tinción de F-actina en las membranas celulares también demuestra cambios en la forma de la célula, en la que las células debajo del punto de apoyo están alineadas con precisión y dispuestas en filas paralelas (Figura 6). Los núcleos celulares también están alineados debajo del punto de apoyo.

Para visualizar las células epiteliales de la fila meridional del cristalino y las células de fibra, se selecciona una imagen de 4,5-5 μm periférica al punto de apoyo (hacia la cápsula del cristalino) en el plano XY, donde se ve la región basal de las células de la fila meridional, como se describió anteriormente²⁰. Para medir el desorden de la hilera meridional, se describe una región de interés (ROI) (Figura 7A; recuadro amarillo). El área del ROI en la imagen de lente de tipo salvaje es de 15.833 μm². Como no hay un desorden observable, el porcentaje de área de desorden es 0. El papel crítico que desempeña la miosina IIA no muscular (NMIIA) en el empaquetamiento hexagonal celular utilizando ratones con una mutación NMIIA-E1841K se ha descrito previamente²⁰. La Figura 7A muestra una imagen ecuatorial representativa de la lente NMIIA^{E1841K/E1841K} para demostrar el trastorno de las células de la fila meridional. El ROI de la hilera meridional fue de 20.757μm2. A continuación, se trazó el área total de parches desordenados. El área total de desorden fue de 3.185 μm². Se determinó que el porcentaje de desorden calculado fue del 15,3% (área desordenada x 100/ROI total; Figura 7B). Este porcentaje de área desordenada se encuentra dentro del rango de un estudio previo²⁰.

A continuación, se demostró un examen del empaquetamiento hexagonal en celdas de hileras meridionales de tipo salvaje²⁰. Debido a que la F-actina está enriquecida alrededor de todo el perímetro de las células de la fila meridional y en los seis vértices de las regiones basales de las membranas celulares en lentes de tipo salvaje (es decir, NMIIA^+/+), se utilizó la tinción con F-actina para evaluar las formas celulares y la organización del empaquetamiento. En la imagen representativa 1, se marcaron las celdas y se contó el número de celdas adyacentes alrededor de cada celda. En la imagen 1, las diez celdas tienen seis celdas adyacentes, lo que sugiere que estas celdas están dispuestas en una organización de empaque de panal (Figura 8). Por el contrario, ocho de cada 10 células (80% de las células) tienen seis células adyacentes en la imagen 2 que indican que las células están empaquetadas irregularmente (Figura 8).

Finalmente, para medir el ancho de la célula de fibra, se examinaron las células de fibra periféricas ubicadas a ~10 μm hacia adentro del punto de apoyo en lentes fijas de tipo salvaje marcadas con rodamina-faloidina (Figura 9A)^2,4. Cabe destacar que también es posible medir el ancho de las células de fibra utilizando ratones tdTomato vivos, sin embargo, la señal de las lentes que son heterocigóticas para tdTomato tiende a ser débil en las regiones ecuatoriales. Por lo tanto, se recomienda el uso de ratones homocigotos para tdTomato, ya que se ha encontrado que tienen una fluorescencia más fuerte (no se muestra). La distancia entre los límites de las células teñidas con actina F mediante análisis de barrido lineal se midió como se describió anteriormente para indicar el ancho de la célula de fibra ^2,4 (Figura 9B). Este análisis reveló que la distancia media entre picos en las lentes de tipo salvaje es de 11,45 ± 2,11 μm (N = 117 células de fibra de 4 imágenes diferentes de lentes de ratón, Figura 9B).

Figura 1: Pasos para crear una hendidura de agarosa para inmovilizar el cristalino durante la toma de imágenes. (A) Usando un plato con fondo de vidrio, pipetear agarosa licuada al 2%. (B) Aplanar con un cubreobjetos flexible y (C) cuando se enfríe, retirar con pinzas de punta fina. (D) Para la hendidura, cree un orificio con un punzón de biopsia de 3 mm. (E) Aspire agaros residuales, enjuague con PBS, limpie la superficie con un pañuelo sin pelusa. (F) Monte con cuidado toda la lente dentro de la hendidura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pasos para crear una hendidura de agarosa para obtener imágenes de células epiteliales ecuatoriales y de fibra del cristalino. (A) Vierta agarosa fundida al 2% en la placa de cultivo de tejidos. (B) Enfríe la agarosa a temperatura ambiente hasta que se solidifique por completo. (C) Con una cuchilla afilada, cree una hendidura triangular. (D) Coloque 1 ml de 1x PBS en la placa de cultivo de tejidos. (E) Coloque la lente diseccionada en la cuña con (F) la lente apoyada en su ecuador encajada entre las paredes de agarosa (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Determinación del espesor de la cápsula de la lente. Secciones ópticas sagitales (vista del plano X, Z) a partir de reconstrucciones de pilas z confocales de (A) cápsulas de lentes vivas y (B) fijas. La intensidad fluorescente de la exploración lineal de las lentes vivas (C) y fijas (D) muestra un único pico WGA (verde) que corresponde a la superficie superior de la cápsula y a la región basal de las células epiteliales (rojo) adyacente a la cápsula. La distancia entre los dos picos se mide para cuantificar el grosor de la cápsula. Imágenes adquiridas con un objetivo de aceite de 40x con un orificio de 1 unidad aireada que da como resultado secciones ópticas de 1,0 μm y 1,2 μm en los canales tdTomato/Rhodamine-Phalloidin y WGA, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cuantificación del área de las células epiteliales. (A) Vista del plano X, Z de las células epiteliales del cristalino marcadas con (B) tdTomato para las membranas celulares y (C) Hoechst para los núcleos. (D) Vista del plano X, Y de la región media de las células epiteliales del cristalino. (E) La señal tdTomato se utiliza como guía para definir una región de interés correspondiente a un grupo de células que están enfocadas. (F) Se determina el área de la región definida. (G) La tinción de Hoechst para núcleos se utiliza para determinar el número de células dentro de la región definida. (H) El número de núcleos se cuenta utilizando (I) la herramienta multipunto de FIJI ImageJ. Para calcular el área media de la celda, divida el área total de la región de interés definida por el número total de celdas. Imágenes adquiridas con un objetivo de aceite de 63x con un orificio de 1 unidad aireada que da como resultado secciones ópticas de 0,7 μm y 1,0 μm en los canales Hoechst y tdTomato, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Determinación del área y la forma del núcleo. (A) Vista del plano XY de la región media de los núcleos. (B) Se definió una región de interés donde los núcleos están enfocados. Se esbozan los núcleos dentro del ROI. (C) Se tabularon el área y la circularidad de los núcleos de las células individuales y se calcularon promedios de área y circularidad. Imágenes adquiridas con un objetivo de aceite de 63x con un orificio de 1 unidad aireada que da como resultado una sección óptica de 0,7 μm en el canal de Hoechst. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Identificación del punto de apoyo de la lente. La actina F y los núcleos se pueden utilizar para identificar el punto de apoyo y las hileras meridionales. (A) La vista XZ muestra la tinción de faloidina enriquecida para la F-actina que corresponde al punto de apoyo. (B) Sección de vista de plano XY óptico único con el punto de apoyo de la lente enfocado. La tinción de Hoechst para núcleos muestra que los núcleos por encima del punto de apoyo están empaquetados irregularmente, mientras que los núcleos por debajo del punto de apoyo están alineados con precisión (arriba a la derecha). La tinción con faloidina para F-actina muestra que las células por encima del punto de apoyo tienen una forma irregular, mientras que las células por debajo del punto de apoyo están empaquetadas en filas paralelas (abajo a la izquierda). La línea discontinua roja muestra la ubicación del punto de apoyo. Imágenes adquiridas con un objetivo de 20x con un agujero de alfiler de 1 unidad aireada que da como resultado secciones ópticas de 1,5 μm, 2,0 μm y 2,2 μm en los canales Hoechst, Rhodamine-Pfaloidin y WGA-640, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Determinación del desorden de la hilera meridional. (A) Sección óptica de vista plana XY única del tipo salvaje y celdas de fila meridional NMIIA^{E1841K / E1841K} a ~ 5 μm del punto de apoyo (hacia la cápsula de la lente). Todas las celdas de la fila meridional están delineadas en azul según la alineación nuclear. La tinción con actina F (rojo) en el cristalino de tipo salvaje muestra que las células de la fila meridional están alineadas con precisión sin signos de desorden (0%). Se esboza una región ordenada representativa en tipo salvaje (naranja). En lentes con células desordenadas, delineamos las regiones desordenadas (amarillo). (B) Gran aumento de la región ordenada del tipo salvaje (cuadro naranja en A). (C) Gran aumento de áreas desordenadas que muestran diferentes tipos de desorden, incluyendo (I) ramificación de filas, (II) forma irregular de la celda y pérdida de empaque en forma de panal, y (III) desalineación de filas. Las imágenes de la lente NMIIA^{E1841K/E1841K} muestran un trastorno del 15,3% de las células de la fila meridional. Imágenes adquiridas con un objetivo de 20x con un agujero de alfiler de 1 unidad aireada que da como resultado secciones ópticas de 1,5 μm y 2,0 μm en los canales de Hoechst y Rhodamina-Faloidina, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Análisis del empaquetamiento de la celda de la fila meridional de la lente. (A) Secciones XY ópticas individuales de células de la fila meridional teñidas con rodamina-faloidina para F-actina. Las imágenes de bajo aumento (panel superior) muestran las celdas que se están evaluando (numeradas en rosa). La región delineada en amarillo se amplía (panel inferior). Los números romanos amarillos son los recuentos de celdas adyacentes. La imagen 1 muestra celdas que tienen forma de hexágono, cada una con 6 celdas adyacentes. La imagen 2 tiene irregularidades con las celdas número 1 y 5 que tienen 5 y 7 celdas adyacentes, respectivamente. (B) Los datos se registran y tabulan con el porcentaje de celdas hexagonales calculado. Imágenes adquiridas con un objetivo de 40x con un orificio de 1 unidad aireada que da como resultado una sección óptica de 1,0 μm en el canal de rodamina-faloidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Análisis de los anchos de las celdas de fibra. (A) Sección de vista XY óptica única de las celdas de fibra de la lente a ~ 10 μm del punto de apoyo. Las células se tiñeron con rodamina-faloidina para la visualización de la actina F en las membranas celulares. Se dibuja una línea (rosa; guión) sobre una serie de células de fibra. (B) Escaneo lineal representativo de las intensidades de actina F en función de la distancia. La distancia entre picos representa el ancho de la celda de fibra. Imágenes adquiridas con un objetivo de 40x con un orificio de 1 unidad aireada que da como resultado una sección óptica de 1,0 μm en los canales de rodamina-faloidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los protocolos descritos permiten la visualización de alta resolución espacial de las estructuras y células periféricas del cristalino en las regiones anterior y ecuatorial del cristalino. En este estudio, se mostraron métodos para la visualización de estructuras periféricas de lentes utilizando lentes intactas (vivas o fijas) donde se conserva la arquitectura general de la lente 3D. Además, se proporcionaron métodos simples para el análisis cuantitativo morfométrico utilizando el software FIJI ImageJ disponible públicamente. Los métodos de visualización y cuantificación de toda la montura se han utilizado en estudios previos. Estos métodos nos permitieron comprender la respuesta de la cápsula anterior y de las células al cambio de forma del cristalino o al envejecimiento ^2,4. Estos métodos también se han utilizado para examinar la expansión de las células de fibra ecuatorial debido al cambio de forma del cristalino o al envejecimiento ^2,4 y para determinar el papel del NMIIA en el establecimiento de formas hexagonales precisas y la organización de las células de fibra periférica²⁰.

Las imágenes de montaje completo permiten obtener imágenes de alta resolución espacial de la estructura de la lente. En la región anterior del cristalino, las imágenes de montaje completo son ventajosas en comparación con las imágenes de montaje plano, ya que evitan daños que pueden alterar la integridad de la estructura de la cápsula y/o la morfología celular epitelial. Además, se conserva la interfaz entre las células epiteliales y las fibras. Este método proporciona ventajas sobre la visualización de secciones de lentes, ya que las imágenes faciales ofrecen una mayor resolución espacial y permiten el análisis del área de las células epiteliales y el área/forma nuclear de la región seleccionada (es decir, la mitad lateral, como se muestra aquí) u otras regiones de las células. Además, los métodos de obtención de imágenes permiten cuantificar las características morfológicas en puntos específicos a lo largo de las regiones ecuatoriales de la lente, lo que permite la visualización de las formas hexagonales, el empaquetamiento de las células de la fila meridional, el punto de apoyo y los anchos de las células de fibra, que no se podrían lograr fácilmente a través de las secciones de la lente teñidas con imágenes debido a la falta de resolución espacial y la distorsión del tejido que puede ocurrir durante el corte.

Los protocolos descritos también permiten la obtención de imágenes de lentes vivos para realizar un seguimiento de estructuras y células específicas de lentes a lo largo del tiempo. El protocolo de imagen con lente viva fue fundamental en un estudio previo, en el que se realizó un análisis de medidas repetidas del grosor de la cápsula y el área de las células epiteliales de una subpoblación de células del mismo cristalino antes y después de la compresión del cristalino para inducir el aplanamiento del cristalino⁴. Se determinó que la compresión del cristalino indujo una disminución en el grosor de la cápsula y un aumento en el área de células epiteliales. Debido a la variación sustancial en el grosor de la cápsula y el área de las células epiteliales entre las lentes individuales y la magnitud de los efectos sobre estos parámetros causados por la compresión de la lente, sería difícil detectar diferencias si se utilizara un diseño de medición independiente (es decir, comparando lentes individuales no comprimidas versus lentes comprimidas individuales). Utilizando los métodos de imágenes en vivo, se han llevado a cabo imágenes de montaje completo en lentes de ratón vivas que expresan endógenamente LifeACT-GFP²⁶ para visualizar la F-actina en las células epiteliales²², lo que permite el seguimiento de la reorganización de la F-actina en las células epiteliales vivas.

Si bien los protocolos descritos se desarrollaron para obtener imágenes de lentes de ratón y pueden adaptarse para visualizar las estructuras del cristalino en otras especies, los protocolos de tinción para visualizar las estructuras periféricas anteriores y ecuatoriales del cristalino en otras lentes de roedores (rata, conejillo de indias), así como en otras lentes de mamíferos (vaca, macaco y humano; datos no mostrados). La visualización de estructuras en lentes más grandes requiere una fijación más prolongada (4% de PFA, en hielo, 4 h), bloqueo (1 h) y tinción (durante la noche, 4 °C). Cabe destacar que las imágenes en diferentes especies solo se realizaron con lentes fijas. La obtención de imágenes en vivo de lentes de otras especies puede ser un desafío, ya que el protocolo de imágenes en vivo utiliza lentes de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorogénicas. Por lo tanto, estas imágenes pueden excluir las lentes de imágenes de otras especies en las que las modificaciones genéticas no son comunes. Sin embargo, hemos sido capaces de llevar a cabo la visualización en vivo de las membranas de las células epiteliales del cristalino o de la F-actina mediante la pretinción de lentes de ratón con la sonda lipofílica, FM4-64 o una sonda de unión a la F-actina, SiR-Jasplakinolide (SiR-actina), respectivamente (no mostrado). Es posible utilizar estas sondas para obtener imágenes de lentes reales de otras especies. Sin embargo, se debe tener cuidado al usar tales sondas para evitar efectos fuera del objetivo; por ejemplo, SiR-Jasplakinolide puede conducir a una alteración de la dinámica de la F-actina²⁷. Otra limitación de los métodos de tinción, ya sea en lentes vivas o fijas, es que dichas sondas tienen una penetración limitada. Por lo tanto, las imágenes se limitan a las regiones periféricas. Es posible obtener imágenes de regiones internas (es decir, células de fibra profunda) utilizando lentes de ratones transgénicos tdTomato⁴, que nuevamente se basan en la expresión transgénica de proteínas fluorogénicas. La expresión también debe ser lo suficientemente alta como para que las señales brillantes se encuentren en las células de fibra profunda.

Sin embargo, los protocolos descritos han permitido una cuantificación morfológica efectiva de las características del cristalino periférico ^2,4,20. Las metodologías de cuantificación son efectivas y utilizan el software FIJI ImageJ de código abierto y disponible públicamente. Si bien se utilizaron herramientas de rastreo manual para identificar regiones de interés, es posible automatizar la identificación de regiones de interés. La automatización puede ser tan simple como aplicar umbrales fluorescentes para mejorar el contraste para la identificación basada en FIJI ImageJ de estructuras particulares (es decir, límites de núcleos), o algoritmos de aprendizaje automático más complejos para detectar diferencias en la forma de las células (es decir, formas irregulares de células epiteliales o de fibra). Los análisis más complejos pueden requerir complementos especializados o software de imágenes. Los complementos o software especializados también pueden permitir la obtención de medidas morfológicas volumétricas en 3D a partir de pilas z adquiridas. En general, si bien los métodos de cuantificación descritos son de fácil acceso, rentables y adecuados para muchas medidas de resultado útiles ^2,4,20, la plataforma de protocolo de imágenes, en combinación con un sofisticado análisis de software, podría proporcionar una gran cantidad de mediciones morfológicas adicionales para estudios futuros.

El cristalino es un tejido biológico intrincado con funciones especializadas que dependen de la ubicación y las geometrías dependientes de la profundidad de las células y sus estructuras asociadas. El uso de los protocolos de imagen y los métodos de cuantificación que se muestran aquí permitirá una mayor comprensión de cómo se establecen las estructuras de la lente y la compleja organización de la lente. Además, los protocolos de imagen y los métodos de cuantificación ayudarán a delinear las relaciones entre la estructura y las funciones de la lente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Punzón de biopsia de 3 mm	Acuderm Inc NC9084780
Agarosa	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimicótico/Antibiótico	Cytiva	SV30079.01
Albúmina sérica bovina (fracción V)	Prometheus	25-529
Toallitas delicadas	Kimwipe
Plato con fondo de vidrio ( Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Microscopio confocal de escaneo láser 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish MatTek	Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehydehyde	Ciencias de la Microscopía Electrónica	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Medio libre de rojo de fenol 199	Gibco	11043023
Rhodamina-Phalloidin	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R