Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Resumen

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) tienen un inmenso potencial para diversas aplicaciones biomédicas, como el diagnóstico, la administración de fármacos y la medicina regenerativa. Sin embargo, las metodologías actuales para aislar los vehículos eléctricos presentan desafíos significativos, como la complejidad, el consumo de tiempo y la necesidad de equipos voluminosos, lo que dificulta su traslación clínica. Para abordar estas limitaciones, nos propusimos desarrollar un sistema microfluídico innovador basado en tiol-eno de copolímero de olefina cíclica fuera de estequiometría (COC-OSTE) para el aislamiento eficiente de EV de muestras de gran volumen de manera continua. Al utilizar la separación basada en el tamaño y la flotabilidad, la tecnología utilizada en este estudio logró una distribución de tamaño significativamente más estrecha en comparación con los enfoques existentes a partir de muestras de orina y medios celulares, lo que permite apuntar a fracciones específicas de tamaño EV en aplicaciones futuras. Nuestro innovador diseño de dispositivo microfluídico COC-OSTE, que utiliza la tecnología de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico bifurcado, ofrece un enfoque de aislamiento EV sencillo y continuo para muestras de gran volumen. Además, el potencial para la fabricación en masa de este dispositivo microfluídico ofrece escalabilidad y consistencia, lo que hace factible integrar el aislamiento de EV en diagnósticos clínicos rutinarios y procesos industriales, donde la alta consistencia y rendimiento son requisitos esenciales.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas derivadas de células unidas a la membrana que comprenden dos tipos principales: exosomas (30-200 nm) y microvesículas (200-1000 nm)¹. Los exosomas se forman a través de la gemación hacia adentro de la membrana endosomal dentro de un cuerpo multivesicular (MVB), liberando vesículas intraluminales (ILV) en el espacio extracelular al fusionarse con la membrana plasmática¹. Por el contrario, las microvesículas se generan por gemación y fisión hacia afuera de la membrana celular². Los VE desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular mediante el transporte de proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y metabolitos, lo que refleja el estado fisiológico de la célula, incluido el crecimiento, la angiogénesis, la metástasis, la proliferación y la resistencia a la terapia³. Como resultado, se han convertido en biomarcadores y dianas terapéuticas prometedoras para enfermedades, incluido el cáncer, destacando su potencial en el diagnóstico y los sistemas de administración de fármacos⁴.

Para utilizar plenamente los VE en el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades, es crucial un aislamiento eficiente de varios biofluidos⁵. Los métodos comunes incluyen la ultracentrifugación (UC), la centrifugación en gradiente de densidad, la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la filtración y el inmunoaislamiento⁶. La UC es una técnica ampliamente utilizada, pero puede producir partículas de densidad similar que no son EV y pueden generar agregados EV⁷. SEC ha ganado popularidad debido a su capacidad para proporcionar muestras de mayor pureza al excluir partículas en función del tamaño en lugar de la densidad⁸. Sin embargo, la selección cuidadosa del tamaño de poro apropiado para la columna SEC y la optimización de las condiciones de cromatografía son esenciales para minimizar el coaislamiento de partículas no deseadas como quilomicrones y lipoproteínas de baja densidad⁸. A pesar de su eficacia, ambos métodos requieren mucho tiempo y son difíciles de automatizar, especialmente para muestras de mayor volumen, como medios celulares u orina, lo que limita su escalabilidad para aplicaciones industriales⁹.

En los últimos años, el fraccionamiento de campo de flujo de campo asimétrico (A4F) ha evolucionado como una poderosa técnica de separación para la separación de partículas de tamaño micro y nanométrico basadas en el tamaño y la flotabilidad¹⁰. El principio de funcionamiento de A4F se basa en un canal microfluídico dotado de una membrana porosa en su base, generando una fuerza ejercida hacia la membrana llamada flujo cruzado¹⁰. Cuando se combina con el movimiento browniano y el flujo de Poiseuille inherente al sistema, el flujo cruzado facilita la separación eficiente de partículas debido a la posición variable de las partículas dentro de la dinámica de flujo¹¹. A pesar de los beneficios, este método se limita a volúmenes de muestra dentro del rango de microlitros¹² y requiere un paso de enfoque adicional, extendiendo la duración del proceso¹⁰.

Durante la última década, la microfluídica ha ganado protagonismo como herramienta para la separación rápida, eficiente y clínicamente fiable de los EV¹³. Sin embargo, la mayoría de los métodos microfluídicos diseñados para la separación de VE están optimizados para muestras de EV de pequeño volumen y alta concentración o dependen de procedimientos de separación complejos¹⁴. Además, dentro del campo de la microfluídica, el polidimetilsiloxano (PDMS) es reconocido como el material de referencia debido a su transparencia óptica, biocompatibilidad y facilidad de uso¹⁵. Sin embargo, su conocida propensión a absorber pequeñas moléculas lipofílicas, incluidas las VE, puede ser problemática para su aplicación en el campo de las VE¹³.

El copolímero de olefina cíclica (COC) es un material de uso frecuente en microfluídica debido a su biocompatibilidad, pequeña absorción de moléculas y alta resistencia química¹⁵. Sin embargo, la fabricación de dispositivos COC a menudo implica procesos complejos o equipos especializados¹⁶. Alternativamente, el tiol-eno fuera de estequiometría (OSTE) es una alternativa prometedora al PDMS debido a la disminución de la absorción de moléculas pequeñas, la estabilidad química superior, la facilidad de fabricación y el proceso de fabricación escalable^17,18. Sin embargo, debido a las complejas conexiones a los tubos, los dispositivos pueden ser propensos a tener fugas¹⁹.

El objetivo de este estudio fue diseñar y fabricar un dispositivo microfluídico que combinara OSTE y COC y el principio A4F bifurcado para la separación de EV a partir de muestras de gran volumen, como orina o medios celulares.

Protocolo

La recogida de muestras fue aprobada por el Comité de Ética de la Investigación en Ciencias Médicas y de la Vida de la Universidad de Letonia (decisión N0-71-35/54)

NOTA: Los materiales utilizados en este estudio se incluyen en el archivo de la Tabla de Materiales .

1. Fabricación de moldes impresos tridimensionales (3D)

1. Diseñe un molde de doble negativo en forma de serpentina en software CAD con las siguientes dimensiones para el canal superior: altura de 0,5 mm, ancho de 1 mm y longitud de 210 mm. Para el canal inferior, utilice el mismo diseño con una anchura de 1,5 mm, una altura de 0,6 mm y una longitud de 210 mm. Las dimensiones como el ancho, la longitud, la altura y la ilustración isométrica del diseño del molde se muestran en la Figura 1. Guarde el diseño como archivo .stl.
2. Prepare el archivo en Z-Suite; No es necesario agregar soporte. Imprima los moldes utilizando una impresora 3D con pantalla de cristal líquido ultravioleta (UV LCD) con resina negra resistente.
3. Después de imprimir, retire con cuidado los moldes de la superficie de la impresora. Lavar los moldes en isopropanol (IPA) en sonicación durante 20 min.
4. Seque los moldes con secador con N₂.
5. Exponga los moldes a la exposición a inundaciones con un filtro ND33 durante 810 s, luego colóquelos en un horno a 60 °C durante 48 h.

2. Preparación de los moldes PDMS

1. Peso PDMS en una proporción de 10:1 p/p (para cada molde, utilice 16 g de base de elastómero y 1,6 g de agente de reticulación). Mezcle los componentes en un mezclador centrífugo planetario, mezclando durante 1 min a 500 RPM.
2. Vierta el PDMS mezclado en los moldes impresos en 3D y desgasifique en un desecador al vacío a -800 mbar durante 30 minutos o hasta que no se observen burbujas.
3. Coloque con cuidado un revestimiento de cloruro de polivinilo de 100 μm de espesor sobre el PDMS líquido.
   NOTA: Aplique el revestimiento lentamente de un lado a otro para evitar la formación de burbujas.
4. Inserte el molde con PDMS en una plantilla de molde in situ y apriete la plantilla con una llave dinamométrica ajustada a 0,3 Nm.
5. Coloque la plantilla en un horno a 60 °C durante 3 h para curar el PDMS.
6. Desmonta la plantilla con una llave hexagonal y retira el molde impreso en 3D de la plantilla.
7. Desmolda con cuidado los moldes de PDMS de los moldes maestros impresos en 3D, recorriendo los bordes del molde con un bisturí y luego retira el molde con unas pinzas.
   NOTA: Para facilitar la eliminación del moho, se puede utilizar IPA; sin embargo, los moldes deben calentarse a 60 °C durante 10 minutos después para evaporar el exceso de IPA.

3. Preparación del canal superior OSTE-COC

1. Peso OSTE en una relación p/p de 1,09:1 (para 5 dispositivos, se necesitan 1,56 g de la parte A y 1,44 g de la parte B). Mezcle los componentes en un mezclador centrífugo planetario: mezcle durante 5 minutos a 750 RPM, luego desgasifique durante 5 minutos a 750 RPM.
2. Transfiera el OSTE mezclado a un tubo de centrífuga y desgasifique a -800 mbar en un desecador al vacío durante 30 min.
3. Limpie los portaobjetos COC con 2 x 16 conectores mini Luer mediante sonicación en IPA durante 10 min. Seque cuidadosamente los portaobjetos con N₂.
4. Coloque los portaobjetos de COC limpios en el asher de plasma de modo que la superficie plana se coloque hacia arriba y trate la superficie con plasma de oxígeno de 800 SCCM durante 2 minutos a una potencia de 700 W con una presión de 0,133 mbar.
5. Coloque el portaobjetos de COC oxidado en el molde de PDMS para el canal superior de modo que la superficie tratada esté en contacto con la superficie estructurada de PDMS. Coloque el conjunto en una plantilla de molde en el lugar, apretando la plantilla con una llave dinamométrica ajustada a 0,3 Nm.
6. Conecte el sistema de presión a la línea de aire comprimido a 6 bar. Tome el tubo de centrífuga con OSTE desgasificado y móntelo según las instrucciones del sistema de presión utilizando un tubo de politetrafluoretileno (PTFE) con un diámetro interior (ID) de 0,8 mm.
7. Conecte el tubo de PTFE a la entrada del molde PDMS y, utilizando una presión de 1000 mbar mantenida por una bomba piezoeléctrica ubicada en el sistema de presión, llene el dispositivo. Coloque la plantilla con el lado de vidrio hacia arriba en el alineador de la máscara y exponga con una dosis de 850 mJ usando el filtro ND33.
8. Después de la exposición, desmonte la plantilla con una llave hexagonal y retire con cuidado la corredera COC con la capa OSTE estructurada del molde PDMS.
9. Ponga el OSTE estructurado en contacto con una membrana de 25 mm x 75 mm con poros de 50 nm y una densidad de poros del 11,8% para que los canales queden completamente cubiertos con la membrana.
   NOTA: Es particularmente importante mantener la membrana lo más recta posible durante el proceso de aplicación.
10. Coloque el conjunto en una placa calefactora ajustada a 60 °C con el lado de la membrana hacia arriba, coloque un portaobjetos de vidrio limpio en la parte superior de la membrana y aplique una presión de 1,6 kPa desde la parte superior para garantizar una unión uniforme. Calienta el conjunto durante la noche.
    NOTA: Después de este paso, es especialmente importante evaluar el rendimiento de la unión y la deformación del canal.

4. Preparación del canal inferior OSTE-COC y del conjunto del dispositivo

1. Mezcle OSTE en una relación de 1,09:1 p/p (para 5 dispositivos se necesitan 1,56 g de la parte A y 1,44 g de la parte B). Mezcle los componentes en un mezclador centrífugo planetario: mezcle durante 5 minutos a 750 RPM, luego desgasifique durante 5 minutos a 750 RPM.
2. Transfiera el OSTE mezclado a un tubo de halcón y desgasifique a -800 mbar en un desecador al vacío durante 30 min.
3. Limpie los portaobjetos de COC por sonicación en alcohol isopropílico durante 10 minutos. Seque cuidadosamente los portaobjetos con N₂.
4. Coloque los portaobjetos de COC limpios en el asher de plasma y trate la superficie con plasma de oxígeno de 800 SCCM durante 2 minutos a una potencia de 700 W con una presión de 0,133 mbar.
5. Coloque el portaobjetos de COC oxidado en el molde de PDMS para el canal inferior de modo que la superficie tratada esté en contacto con la superficie estructurada de PDMS. Coloque el conjunto en una plantilla de molde en el lugar, apretando la plantilla con una llave dinamométrica ajustada a 0,3 Nm.
6. Tome el tubo de halcón con OSTE desgasificado y móntelo según las instrucciones del sistema de presión utilizando un tubo de PTFE con un diámetro interior de 0,8 mm.
7. Conecte el tubo de PTFE a la entrada del molde PDMS y, con una presión de 1000 mbar, llene el dispositivo. Coloque la plantilla con el lado de vidrio hacia arriba en el alineador de la máscara y exponga con una dosis de 1100 mJ usando un filtro ND33.
8. Después de la exposición, desmonte la plantilla con una llave hexagonal y retire con cuidado la corredera COC con la capa OSTE estructurada del molde PDMS.
9. Combine la capa OSTE estructurada con el conjunto del canal superior de modo que el diseño de la capa superior e inferior esté alineado entre sí y que la capa inferior OSTE esté en contacto con la membrana.
10. Inserte el diseño en una plantilla de molde en el lugar y, con clips bulldog, aplique una presión de 1,6 kPa al dispositivo de manera uniforme. Coloque la plantilla en un horno a 60 ° C durante la noche.
    NOTA: La colocación desigual de los clips puede provocar una unión desigual.

5. Evaluación del dispositivo

1. Después de la unión, evalúe visualmente los dispositivos con un microscopio para detectar defectos visuales, por ejemplo, deformación del canal o unión fallida.
2. Pruebe los dispositivos sin defectos haciendo pasar 0,02 μm de agua desionizada filtrada a través de los canales con una presión de 30 mbar. Observe si hay fugas en el canal de flujo y en el puerto Luer y en el flujo de agua.
   NOTA: Si no se puede detectar ninguna fuga y el flujo del canal es ininterrumpido, los dispositivos se consideran utilizables para otros experimentos.

6. Configuración del dispositivo

1. Llene dos jeringas de 5 ml con 2 ml de 20 nm de 20 nm filtrado al 3% H₂O₂ y colóquelas en una bomba de jeringa (use las flechas de movimiento para la distancia necesaria, inserte las jeringas y fíjelas en su lugar con la barra superior).
   ¡CAUTELA! Siempre tenga cuidado al manipular H₂O₂. Use una bata de laboratorio, guantes de goma protectores y protección para los ojos.
2. Conecte un tubo de PTFE de 14 cm de largo y 800 μm de diámetro interior a las jeringas con las agujas de la jeringa y a las entradas del dispositivo con conectores Luer.
3. Conecte un tubo de poliéter éter cetona (PEEK) de 20 cm de largo y 200 μm de diámetro interior a las salidas.
4. Conecte el otro extremo del tubo de PEEK a un contenedor de residuos. La configuración se puede ver en la Figura 3.
5. Ponga en marcha la bomba de jeringa a la velocidad de flujo de 500 μL/min para cada entrada (en la pantalla del instrumento: Configuración > Sistema Configurar > jeringa (fabricante: jeringa médica, jeringa: 5 ml) > Botón de retroceso > Parámetros (Seleccionar: infundir, Repetir: 1, Volumen: 1,5 ml, Flujo: 500 μl/min) > Botón de retroceso > botón de retroceso ). Recoger el flujo continuo en un contenedor de residuos.
6. Llene dos jeringas nuevas de 5 ml con 2 ml de etanol filtrado al 70% a 20 nm.
7. Sustituya las jeringas anteriores por las jeringas llenas de etanol y ponga en marcha la bomba de jeringa utilizando los mismos parámetros descritos en el paso 6.5.
8. Use jeringas nuevas de 5 ml y llénelas con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) filtrada de 20 nm.
9. Reemplace las jeringas anteriores con las jeringas llenas de PBS y enjuague el dispositivo con 4 ml de PBS repitiendo los pasos 6.1. y 6.5.
   NOTA: Asegúrese de cambiar los parámetros de configuración del sistema a Volumen: 4 ml (en la pantalla del instrumento: Ajustes > Parámetros > (Seleccione: Volumen: 4 ml).
10. Desconecte el tubo del dispositivo y cierre cada entrada y salida con tapones Luer.
    NOTA: Deje PBS en el dispositivo y evite atrapar aire agregando PBS adicional en cada entrada y salida con una micropipeta antes de cerrar.
11. Deje el dispositivo durante la noche en un lugar oscuro a temperatura ambiente (RT).
12. Al día siguiente, enjuague el dispositivo lleno de PBS con 4 ml de PBS filtrado de 20 nm (como se describe en el paso 6.8).
13. Recoger el último 1 ml del flujo de ambas salidas en un tubo de baja unión a proteínas de 2 ml y almacenarlo a 4 °C como blanco para las partículas introducidas por el dispositivo.
14. Retire las jeringas llenas de PBS y reemplácelas con jeringas nuevas de 5 ml llenas de aire.
15. Purgue el dispositivo con 4 ml de aire hasta que todo el líquido haya salido del dispositivo y del tubo.

7. Prueba de dispositivos con perlas de látex estandarizadas

1. Prepare una muestra de perlas estandarizadas con perlas de poliestireno de 1,0 μm y perlas de carboxilato de 0,1 μm. A un tubo de 15 ml, agregue 500 μl de patrones de perlas de poliestireno de 1,0 μm, 1 μl de patrones de perlas de carboxilato de 0,1 μm y 9499 μl de PBS filtrado de 20 nm (la concentración final de la mezcla de perlas de 1,0 y 0,1 μm será de 5 × 108 perlas/mL y de 3,6 × 1010 perlas/mL respectivamente).
2. Agite la muestra de perlas durante 30 s y guárdela a +4 °C mientras no esté en uso.
3. Llene una jeringa nueva de 5 ml con 1,5 ml de la mezcla de perlas estandarizada y otra con 1,5 ml de PBS filtrado de 20 nm.
4. Retire las jeringas previamente colocadas y conecte la jeringa de mezcla de perlas al primer tubo de entrada y el otro al segundo de entrada.
5. Retire el contenedor de residuos y prepare al menos cinco tubos de microcentrífuga de 0,5 ml para cada tubo de salida.
6. Cambie los parámetros de arranque del sistema de la bomba de jeringa a Volumen: 1 ml; Caudal: 250 μL/min.
   NOTA: Dependiendo de las necesidades del usuario, se pueden configurar diferentes velocidades de flujo, como 250 μL / min, 200 μL / min, 150 μL / min, 100 μL / min y 50 μL / min. Se recomienda un estudio preliminar para elegir la velocidad más favorable para el resultado deseado.
7. Encienda la bomba de jeringa y recoja el flujo de salida: de 5 a 6 gotas en cada tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Si se utiliza el mismo dispositivo varias veces, enjuague el dispositivo como se describe en el paso 6.8 y cambie todos los conectores, enchufes y agujas. Lave los conectores, clavijas y agujas usados dejándolos en etanol filtrado al 70% a 20 nm durante al menos 30 minutos. Luego, mueva todas las piezas a un tubo que contenga agua desionizada filtrada de 20 nm, agite bien el tubo y transfiéralas a una placa de Petri que contenga 20 ml de agua desionizada filtrada de 20 nm. Deje la placa de Petri en la coctelera durante al menos 30 minutos a 100 rpm, luego deje que las cosas se sequen en una placa de Petri seca (durante al menos 12 h) antes de volver a utilizarla.

8. Pruebas de dispositivos con muestras de orina

1. Prepare el dispositivo como se describe en los pasos 6.1-6.15.
2. Recoja 100 ml de orina matutina por donante utilizando recipientes estériles de orina y entréguelos al laboratorio para su procesamiento dentro de las 2 horas posteriores a la recolección.
3. Separe cada muestra de orina en dos tubos de 50 ml y centrifugue a 2.000 x g durante 15 min a RT.
4. Recoja el sobrenadante y deseche el gránulo.
5. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 minutos a RT para eliminar las partículas grandes y los restos celulares.
6. Recoja el sobrenadante y deseche el gránulo.
7. Lave el dispositivo como se describe en 6.6.
8. Cambie las jeringas de 5 ml por una jeringa de 20 ml llena con la muestra de orina preparada para la entrada de la muestra y otra jeringa de 20 ml llena de 20 ml de DEPC-PBS filtrado de 20 mL para la entrada del tampón. Cambie la configuración de la bomba de jeringa a BDPlastipak; Jeringa: cc; Volumen: 20 mL; Flujo: 250 μL/min (caudal óptimo), de forma similar a la descrita en el paso 6.2. Encienda la bomba de jeringa y recoja el flujo de cada salida en tubos separados de 50 ml.
9. Concentrar cada flujo por separado utilizando tubos de concentración de corte de 100.000 pesos moleculares a 100 μL cada uno a 3.000 x g en 4 °C.
10. Transfiera los concentrados a tubos de microcentrífuga de 0,5 ml.
11. Agite las muestras concentradas durante 30 segundos, luego gire durante 10 segundos.
12. Alícuota las muestras transfiriendo 25 μL de muestra por tubo, etiquételas y congélelas a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.

9. Pruebas de dispositivos con medios acondicionados

1. Prepare el dispositivo como se describe en los pasos 6.1 a 6.15.
2. Cultivo de células en un ambiente humidificado con 5% de CO₂ a 37 °C hasta que el recuento total alcance los 100 millones según Bajo-Santos et ^al.20 Pase las células a un solo matraz de suspensión T175 en 100 mL de medio libre de suero suplementado con suplemento sustituto de suero B-27 al 2% y cultivo en un ambiente humidificado con 5% de CO₂ a 37 °C durante 48 h adicionales.
3. Recoja la suspensión celular y centrifugue a 300 x g durante 5 minutos a RT para deshacerse de las células.
4. Recoger y centrifugar de nuevo el sobrenadante a 3.000 x g durante 30 min a +4 °C para eliminar las partículas grandes y los restos celulares.
5. Recoger el sobrenadante y almacenarlo a +4°C hasta que se pueda realizar la separación, pero no más de 3 h.
6. Cambie las jeringas de 5 ml por jeringas de 20 ml llenas con el medio acondicionado preparado para la entrada de la muestra y llenas con 20 ml de PBS filtrado de 20 nm para la entrada del tampón.
7. Ajuste los ajustes en la estación de bombeo como se describe en el paso 7.8.
8. Encienda la bomba de jeringa y recoja el flujo de cada salida en un tubo separado de 50 ml.
9. Concentrar cada flujo por separado utilizando tubos de concentración de corte de 100.000 pesos moleculares a 150 μL cada uno a 3.000 x g a +4 °C.
10. Transfiera los concentrados a tubos de microcentrífuga de 0,5 ml.
11. Muestras concentradas de vórtice durante 30 s.
12. Centrifugar muestras concentradas durante 10 s.
13. Alicuota las muestras transfiriendo 25 μL de muestra por tubo, etiquételas y congélelas a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.

10. Aislamiento de vehículos eléctricos mediante ultracentrifugación

1. Centrifugar 20 ml de orina o medios celulares acondicionados a 100.000 x g durante 70 min a +4 °C utilizando una centrífuga con rotor de ángulo fijo.
2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 mL de PBS filtrado de 20 nm.
3. Centrífuga de nuevo, como se explica en 10.1.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 12 mL de PBS filtrado de 20 nm.
5. Centrifugar a 100.000 x g durante 70 min a +4 °C utilizando un rotor oscilante.
6. Deseche el sobrenadante.
   NOTA: Tenga cuidado al desechar el sobrenadante esta vez. Se recomienda hacerlo con pipeta.
7. Resuspender el pellet en 100 μL de PBS filtrado de 20 nm.
8. Alicuota la muestra y proceder a la sección 12 para la caracterización del VE. De lo contrario, conservar a -80 °C hasta su nuevo uso.

11. Aislamiento de VE mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

1. Concentrar 20 mL de orina o medios celulares acondicionados a 500 μL utilizando unidades de filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa a 3.000 x g a +4 °C durante 15 min.
2. Transfiera el concentrado a la columna SEC (rango de carga de 35 nm).
3. Vierta el PBS filtrado de 20 nm en la columna y recoja 15 fracciones de 0,5 ml.
4. Analice fracciones con un sistema de dispersión dinámica de luz (DLS) siguiendo las instrucciones del fabricante.
5. Agrupa las fracciones seleccionadas. Elija fracciones con un atenuador inferior a 11 y al menos el 30% del total de partículas sea superior a 40 nm.
6. Concentre las fracciones seleccionadas a 100 μL utilizando unidades de filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 3 kDa a 14.000 x g a +4 °C durante 15 min.
7. Aliquotar la muestra y pasar a la sección 12 para la caracterización de los vehículos eléctricos. De lo contrario, conservar a -80 °C hasta su nuevo uso.

12. Caracterización de vehículos eléctricos

1. Sacar la muestra a caracterizar del congelador y descongelarla lentamente (sobre un bloque de hielo o a +4 °C).
2. Realizar análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para determinar la distribución del tamaño de partícula y la cantidad¹³. Realizar un ensayo de inmunoadsorción enzimática de doble sándwich de proteína de membrana de células T 4 de alta afinidad (TIM-4) (dsELISA)¹⁴ para confirmar la presencia de EV en las muestras.

13. NTA

1. Agite la muestra de EV descongelada durante 30 s y centrifuga durante 10 s, luego transfiera de 1 μL a 999 μL de PBS filtrado de 20 nm en un tubo de microcentrífuga de 2 mL para diluirlo 1000 veces. Guarde 1 ml de PBS adicional utilizado para la dilución para comprobar que no contiene partículas. Guarde todo a +4 °C hasta la medición.
   NOTA: Filtre PBS a través de un filtro de 0,02 nm antes de usar.
2. Agite la muestra o la pieza en bruto EV durante 30 s e insértela en el módulo con una jeringa. Llene el módulo con aproximadamente 0,7 ml de muestra y colóquelo en el instrumento.
3. Mida la muestra con el instrumento analizador de nanopartículas siguiendo las instrucciones del fabricante.

14. dsELISA para marcadores EV

1. Prepare una solución de 1 μg/ml de proteína TIM4-Fc. Cubra los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos transfiriendo 100 μL de solución a cada pocillo necesario e incube durante la noche a +4 °C agitando a 200 RPM.
2. Al día siguiente, prepare la solución de lavado (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl₂).
3. Deseche todo el líquido de cada pocillo. Lave cada pocillo agregando 200 μL de solución de lavado, agitando a 200 RPM durante 5 min a RT y desechando. Repita este paso dos veces.
4. Preparar solución de bloqueo (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% albúmina sérica bovina. Agregue 200 μL de solución de bloqueo a cada pocillo e incube a RT durante 1 h mientras agita a 200 RPM.
5. Lave cada pocillo como se describe en el paso 14.3.
6. Preparar 220 μL de cada dilución de muestra en tampón de lavado (la concentración óptima de EV es de 2,7 × 10⁵ EV/μL). Añadir 100 μL de la muestra diluida por pocillo y realizar dos repeticiones. Incubar a RT durante 90 min mientras se agita a 200 RPM.
7. Lave cada pocillo como se describe en el paso 14.3.
8. Agregue 100 μL de los anticuerpos correspondientes a cada pocillo. Utilice marcadores de EV adecuados para confirmar los EV y los contaminantes⁴. Incubar a RT durante 2 h agitando a 200 RPM. NOTA: Si se utilizan anticuerpos secundarios, repita los pasos 14.7-14.8. Sin embargo, reducir el período de incubación de los anticuerpos secundarios a 1 h.
9. Lave cada pocillo como se describe en el paso 14.3.
10. Agregue 100 μL de sustrato de peroxidasa de rábano picante a cada pocillo, mezcle la placa durante 1 min e incube a RT durante 30 min.
11. Agregue 1 M H₂SO₄ a cada pocillo para detener la reacción.
12. Con un lector de microplacas, mida la absorbancia a 450 nm.

Resultados

Fabricamos un dispositivo microfluídico utilizando un molde de doble negativo impreso en 3D (Figura 1) mediante litografía blanda (Figura 2A) para la separación de EV de alto rendimiento basado en el principio A4F bifurcado (Figura 2B, C). La configuración requiere una bomba y una estación de flujo continuo, como se puede ver en la Figura 3, para el aislamiento de vehículos eléctricos de manera automatizada. En primer lugar, para evaluar la prueba de concepto de los dispositivos, se preparó una mezcla de perlas de poliestireno con diámetros de 100 nm y 1000 nm para representar vesículas y restos celulares finos, respectivamente¹⁰. Se llevaron a cabo experimentos con caudales variables para la mezcla de perlas, con y sin flujo bifurcado, para investigar el efecto de la velocidad lineal en la eficiencia de separación. En todos los experimentos, la recuperación de perlas pequeñas se mantuvo constante y por encima del 90 %¹⁰, lo que demuestra el potencial del dispositivo para recuperar vehículos eléctricos.

A continuación, evaluamos y comparamos el potencial del dispositivo COC-OSTE para aislar los VE de grandes volúmenes (>1 mL) de biofluidos complejos con un preprocesamiento mínimo. De este modo, se utilizó la orina de 10 donantes sanos (Figura 4) y los medios celulares de dos líneas celulares de próstata diferentes (Figura 5) como plantilla para aislar simultáneamente las VE siguiendo tres procedimientos diferentes: ultracentrifugación (UC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y el dispositivo OSTE-COC basado en microfluídica A4F. Después del aislamiento, se evaluó el número total de partículas y su distribución de tamaño mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). En promedio, el dispositivo OSTE-COC mostró una mejor recuperación total de partículas de biofluidos en comparación con la UC, pero la significación estadística solo se logró al combinar los números de partículas de ambos puertos (Figura 4A). Para comparar el rendimiento del dispositivo con otros sistemas, se debe tener en cuenta la salida de R & L junta. Como se muestra en la Figura 4, el rendimiento conjunto de la salida L y R en la recuperación de EV supera a UC y SEC. Por separado, el puerto L fue diseñado para capturar la pequeña fracción EV, mientras que el puerto R fue diseñado para recolectar la fracción EV más grande con otras moléculas de tamaño similar. Curiosamente, la recuperación utilizando el R-PORT del dispositivo OSTE-COC fue ligeramente mayor que la SEC y la UC solas (Figura 4A). La expresión de CD63 mostró un patrón similar (Figura 4C). Este hallazgo indica que el dispositivo OSTE-COC fue más efectivo en la recuperación total de EV. Se encontró una distribución de tamaño equivalente entre las diferentes metodologías, excepto para UC, que muestra una mayor distribución de tamaño de partícula (Figura 4B).

Se observaron resultados comparables en cultivos de medios celulares. En ambos escenarios, la recuperación total de partículas de ambos puertos del dispositivo mostró un rendimiento superior en comparación con las metodologías SEC o UC (como se muestra en la Figura 5A, B). En particular, los EV derivados de células PC3 demostraron una distribución de tamaño distinta, con una mayor homogeneidad en la distribución L-PORT cuando se contrastó con otros grupos experimentales (Figura 5C,D). Además, el análisis de la expresión de CD63 confirmó las mayores tasas de recuperación de EV logradas utilizando el dispositivo COC-OSTE (como se ilustra en la Figura 5E, F). En la Tabla 1 se presenta un resumen que compara las características de aislamiento de las diferentes metodologías examinadas en este estudio.

Figura 1: Dimensiones del molde de doble negativo en forma de serpentina 3DP y vista isométrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Dispositivo microfluídico COC-OSTE. (A) Esquema de los diferentes pasos principales de fabricación del dispositivo OSTE-COC. (B) Principio de funcionamiento del dispositivo. (C) Imagen del dispositivo terminado. Barra de escala: 15 mm. Esta figura ha sido modificada con permiso de Priedols et ^al.10 y Bajo-Santos et ^al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuración experimental del dispositivo. La bomba de jeringa está a la izquierda, el dispositivo OSTE-COC está en el medio y la estación de recuperación está a la derecha. Esta figura ha sido modificada con permiso de Priedols et ^al.10 y Bajo-Santos et ^al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Distribución del tamaño del EV urinario y recuperación de partículas de 10 donantes mediante ultracentrifugación (CU), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y el dispositivo COC-OSTE. (A) Cantidad de partículas recuperadas de cada método de aislamiento mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Los datos se representan como media +/- desviación estándar. Significación estadística denotada por * (p<0.05). (B) Los diagramas de caja muestran la distribución promedio del tamaño de partícula entre todas las muestras de orina evaluadas por NTA, con bigotes que indican los valores mínimo y máximo. Los valores de p se derivaron de las comparaciones con CU, indicando **** una alta significación estadística (p<0,0001). (C) La mediana y el rango de la cantidad promedio de CD63, evaluados mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática de doble sándwich (dsELISA), para cada método de aislamiento, se calcularon en todas las muestras. Puerto L: Puerto izquierdo; R-port: Puerto derecho. Esta figura ha sido modificada con permiso de Bajo-Santos et ^al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Caracterización de VE aisladas de células PC3 y LNCaP utilizando diferentes métodos. (A) Cantidad de partículas recuperada de medios PC3 mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) representada por la media +/- desviación estándar. (B) Cantidad de partículas recuperadas de medios celulares LNCaP utilizando NTA representada como media +/- desviación estándar. (C) La distribución mediana del tamaño de partícula de los EV de los cultivos PC3, junto con el rango, se determinó mediante NTA. (D) Distribución del tamaño medio de los VE aislados de cultivos LNCaP con rango. (E) Mediana y rango de expresión de CD63 para cada método de aislamiento para EV derivado de líneas celulares PC3, utilizando un ensayo de inmunoabsorción enzimática de doble sándwich (dsELISA). (F) Mediana y rango de expresión de EV CD63 derivada de LNCaP por dsELISA para cada método de aislamiento. UC: Ultracentrifugación; SEC: Cromatografía de exclusión por tamaño; Puerto L: Puerto izquierdo; R-port: Puerto derecho. Esta figura ha sido modificada con permiso de Bajo-Santos et ^al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	UC	SEC	COC-OSTE
Tiempo de procesamiento/muestra	++/+++	+++	+
Rendimiento	++	+	+++
Costo/muestra	+	+++	++
Pureza	+	+++	++
Automatización	++	+	+++
Rendimiento de los vehículos eléctricos	++	++	+++
Selección de tamaño	+	++	++

Tabla 1. Comparación de las características de aislamiento de los VE con los tres métodos: UC SEC y el dispositivo COC-OSTE. UC: Ultracentrifugación; SEC: Cromatografía de exclusión por tamaño. COC-OSTE: tiol-eno de copolímero de olefina cíclica fuera de estequiometría. +: bajo; ++: medio; +++: alto. * Depende del dispositivo.

Discusión

El dispositivo microfluídico presentado ofrece un método prometedor para el aislamiento y la extracción de vehículos eléctricos de fluidos biológicos, abordando algunas de las limitaciones críticas de los métodos estándar de oro existentes, como UC y SEC¹². Se sabe que la UC y la SEC requieren mucha mano de obra, consumen mucho tiempo y tienen un bajo rendimiento, lo que las hace menos adecuadas para aplicaciones de alto rendimiento en las que se necesitan grandes cantidades de vehículos eléctricos^21,22. Por el contrario, el dispositivo microfluídico descrito puede procesar continuamente un volumen sustancial de hasta 20 ml de fluido biológico con una intervención mínima del usuario, lo que lo convierte en un potencial cambio de juego para entornos industriales o clínicos. Una de las principales ventajas de este dispositivo microfluídico es su capacidad para estandarizar el aislamiento de los vehículos eléctricos y mejorar la reproducibilidad en comparación con los métodos tradicionales que implican pasos manuales. Al reducir la variabilidad de la fabricación de dispositivos de aislamiento de vehículos eléctricos a través de la fabricación en masa, el rendimiento del dispositivo puede controlarse mejor y ser consistente, lo cual es vital para aplicaciones como la terapéutica y el diagnóstico basados en vehículos eléctricos. Además, la compatibilidad del dispositivo con la fabricación de grandes volúmenes a través del moldeo por inyección de reacción de sustratos adecuados mejora aún más su potencial de escalabilidad y adopción más amplia.

Para garantizar la reproducibilidad y un rendimiento constante, es necesario un protocolo extenso y bien definido, tanto para producir el chip como para su uso en experimentos. El chip está diseñado pensando en la industrialización. Sin embargo, durante la fabricación del dispositivo en el entorno de laboratorio, se debe prestar atención a evitar la formación de burbujas, garantizar una unión precisa y robusta, y realizar pruebas exhaustivas a velocidades de flujo más altas que las esperadas en experimentos reales. Esta precaución es especialmente importante para los dispositivos COC-OSTE, ya que pueden ser propensos a fugas debido a una unión fallida, especialmente a caudales más altos. Además, dado que OSTE es un material fotosensible, la fabricación del dispositivo debe realizarse con luz amarilla para evitar la exposición innecesaria a los rayos UV. Dado que esta tecnología aún se encuentra en sus etapas iniciales, los investigadores deben experimentar con diferentes velocidades de flujo para identificar la configuración óptima para su aplicación específica, ya que aún no se han establecido protocolos estandarizados para este nuevo método, y la viscosidad del líquido puede afectar claramente la eficacia del aislamiento de EV según nuestros resultados. Siguiendo estas directrices y abordando los retos de la estandarización, el potencial de este dispositivo microfluídico para el aislamiento de vehículos eléctricos puede realizarse plenamente en diversas áreas de investigación y aplicaciones.

El método de aislamiento de vehículos eléctricos mediante el dispositivo microfluídico permite realizar amplias modificaciones y solucionar problemas para optimizar el rendimiento. Para mejorar la separación de partículas, los investigadores pueden explorar canales más largos, diferentes porosidades de membrana y densidades de poros, y dimensiones alteradas. Si hay muchas partículas grandes en la salida de partículas pequeñas, probar una velocidad de entrada de tampón más alta puede ser beneficioso, mientras que si hay muchas partículas pequeñas en la salida de partículas grandes, se recomienda experimentar con un canal más largo o una membrana con poros más grandes. Abordar la absorción de partículas puede implicar el ajuste de las velocidades de flujo, las modificaciones de la superficie y la composición de OSTE o cambiar el tiempo de exposición a los rayos UV. Para los dispositivos que experimentan inestabilidad y fugas, la disminución de las velocidades de flujo y la garantía de un pegado adecuado son pasos cruciales. Para minimizar el daño de los vehículos eléctricos, los investigadores pueden reducir las velocidades de flujo, lavar con PBS más a fondo después de la esterilización del dispositivo y considerar el uso de poros de membrana más pequeños o técnicas y materiales alternativos de diseño de moldes. A través de estos ajustes, el dispositivo microfluídico se puede ajustar, liberando su potencial para diversas aplicaciones en la investigación de vehículos eléctricos y campos relacionados. Además, para optimizar el rendimiento del dispositivo, se podría incorporar la caracterización de muestras aguas arriba, incluidas las mediciones de densidad y viscosidad, para ajustar los parámetros de flujo. Además, debe hacerse especial hincapié en la naturaleza de la muestra, dada la no esterilidad comprobada de los biofluidos²³. En consecuencia, la esterilización de las muestras antes de su administración en aplicaciones clínicas debe ser debidamente considerada.

A pesar de estos desafíos, el dispositivo microfluídico tiene un inmenso potencial en diversas áreas de investigación. Su capacidad para aislar continuamente los vehículos eléctricos de grandes volúmenes de muestras muy heterogéneas abre la puerta a la automatización, lo que facilita las aplicaciones de alto rendimiento y permite un análisis más profundo de los vehículos eléctricos de diversas fuentes. La integración de este módulo microfluídico en diferentes dispositivos, como cartuchos de biorreactor de celda de fibra hueca o citómetros de flujo de alta resolución, podría hacer que las aplicaciones de vehículos eléctricos sean más amigables para la industria e impulsar la innovación en campos como la administración de fármacos, el diagnóstico y los cosméticos^. En general, este dispositivo microfluídico representa un importante paso adelante en el campo de la investigación de los vehículos eléctricos, ya que ofrece un método eficiente y estandarizado para el aislamiento de vehículos eléctricos con aplicaciones prometedoras en una amplia gama de investigaciones y entornos industriales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,1 y micro; m carboxilato FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Concentración de existencias: 3,6 x 1013 perlas/mL (dependiendo del lote)
0,5 mL tubos de microcentrífuga	Starstedt	72.704
1 mL Jeringa de cono Luer de un solo uso sin aguja	RAYS	TUB1ML
1.0 µ m poliestireno FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Concentración de existencias: 1 x 1010 perlas/mL (dependiendo del lote)
10 mL Pipetas serológicas	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Filtros centrífugos Amicon Ultra	Merck Millipore	UFC910024
2.0 mL Tubos Protein LoBind	Jeringas Eppendorf	30108132
20 mL	BD PlastikPak
250 y micro; m ID Tubo de poliéter éter cetona	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa Unidades de filtro centrífugo MWCO	Merck Millipore,UFC200324
5 mL Jeringa médica sin aguja	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL tubos cónicos	Sarstedt	62.547.254
70 Ti rotor ultracentrífugo de ángulo fijo	Beckman Coulter
800 y micro; m ID tubo de politetrafluoroetileno	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
Microplaca de 96 pocillos, f-bottom, unión med.	Placa de ELISA	Greiner Bio-One	655001
B-27 Suplemento (50x), sin suero	Thermo Fisher Scientific	17504044
Albúmina sérica bovina	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas Plataforma	de portaobjetosMicrofluídica Chipshop	10000002
COC Topas plataforma de portaobjetos de microscopía 2 x 16 Mini Luer	Chipshop microfluídico	10000387
controlador de presión Elveflow OB1			Elvesys
	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Alineador de mascarillas Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	analizador de nanopartículas
Microscopio óptico Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg libre. Biorreactivos de Fisher. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC (diámetro de poro de 50 nm, densidad del 11,8%)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Bélgica
Placas de Petri, estériles	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/columna de 35 nm	Columna Izon	SP5	SEC
QSIL 216 Kit de elastómero de silicona	PP& S
Resina Tough Black	Zortrax
SW40 Ti rotor ultracentrífugo oscilante	Beckman Coulter	331301
Bomba de jeringa	DK Infusetek	ISPLab002
T175 matraz de suspensión	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc proteína	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)	SigmaAldrich	T0440-100ML Sustrato de	peroxidasa de rábano picante
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrífuga Optima L100XP	Beckman Coulter
Unidad de limpieza ultrasónica P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Espectrofotómetro	universal de microplacasBio-Tek instruments	71777-1
Vaso de recolección de orina, 150 ml, estéril	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Filtro de jeringa	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Sistema de	dispersión dinámica de luz (DLS) analítico&
Zortrax Inkspire	Zortrax