Artículo de método

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

DOI:

10.3791/66023

⸱

10 de noviembre de 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la microscopía electrónica criogénica (cryoEM), las macromoléculas purificadas se aplican a una rejilla que lleva una lámina de carbono agujereada; A continuación, las moléculas se secan para eliminar el exceso de líquido y se congelan rápidamente en una capa de hielo vítreo de aproximadamente 20-100 nm de espesor, suspendida en agujeros de lámina de aproximadamente 1 μm de ancho. La muestra resultante se obtiene mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica y, después del procesamiento de la imagen con un software adecuado, se pueden determinar estructuras de resolución casi atómica. A pesar de la adopción generalizada de la crioEM, la preparación de muestras sigue siendo un grave cuello de botella en los flujos de trabajo de la crioEM, ya que los usuarios a menudo se enfrentan a problemas relacionados con el mal comportamiento de las muestras en el hielo vítreo suspendido. Recientemente, se han desarrollado métodos para modificar las rejillas crioEM con una sola capa continua de grafeno, que actúa como una superficie de soporte que a menudo aumenta la densidad de partículas en el área de la imagen y puede reducir las interacciones entre las partículas y la interfaz aire-agua. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para la aplicación de grafeno a las rejillas crioEM y para evaluar rápidamente la hidrofilicidad relativa de las rejillas resultantes. Además, describimos un método basado en EM para confirmar la presencia de grafeno mediante la visualización de su patrón de difracción característico. Finalmente, demostramos la utilidad de estos soportes de grafeno mediante la reconstrucción rápida de un mapa de densidad de resolución de 2,7 Å de un complejo Cas9 utilizando una muestra pura a una concentración relativamente baja.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para visualizarmacromoléculas biológicas. Impulsado por los avances en la detección directa de electrones 2,3,4, la adquisición de datos5 y los algoritmos de procesamiento de imágenes 6,7,8,9,10, cryoEM es ahora capaz de producir estructuras 3D de resolución casi atómica de un número cada vez mayor de macromoléculas11. Además, al aprovechar la naturaleza de una sola molécula del enfoque, los usuarios pueden determinar múltiples estructuras a partir de una sola muestra 12,13,14,15, lo que destaca la promesa de utilizar los datos generados para comprender conjuntos estructurales heterogéneos 16,17. A pesar de estos avances, persisten los cuellos de botella en la preparación de la rejilla de muestras criogénicas.

Para la caracterización estructural por crioEM, las muestras biológicas deben estar bien dispersas en solución acuosa y luego deben ser congeladas rápidamente a través de un proceso llamado vitrificación18,19. El objetivo es capturar partículas en una capa uniformemente delgada de hielo vitrificado suspendida a través de agujeros espaciados regularmente que generalmente se cortan en una capa de carbono amorfo. Esta lámina de carbono amorfa estampada está soportada por una rejilla TEM que soporta una malla de barras de soporte de cobre u oro. En los flujos de trabajo estándar, las rejillas se vuelven hidrófilas mediante un tratamiento de plasma de descarga incandescente antes de la aplicación de la muestra. El exceso de líquido se seca con papel de filtro, lo que permite que la solución proteica forme una fina película líquida a través de los orificios que se puede vitrificar fácilmente durante la congelación por inmersión. Los desafíos comunes incluyen la localización de partículas en la interfaz aire-agua (AWI) y la posterior desnaturalización20,21,22 o la adopción de orientaciones preferidas 23,24,25, la adherencia de las partículas a la lámina de carbono en lugar de migrar hacia los agujeros, y la agrupación y agregación de las partículas dentro de los agujeros 26. El espesor no uniforme del hielo es otra preocupación; El hielo grueso puede dar lugar a niveles más altos de ruido de fondo en las micrografías debido al aumento de la dispersión de electrones, mientras que el hielo extremadamente delgado puede excluir partículas más grandes27.

Para abordar estos desafíos, se ha utilizado una variedad de películas de soporte delgadas para recubrir las superficies de la rejilla, lo que permite que las partículas descansen sobre estos soportes e, idealmente, eviten las interacciones con la interfaz aire-agua. Los soportes de grafeno han demostrado ser muy prometedores, en parte debido a su alta resistencia mecánica junto con su mínima sección transversal de dispersión, que reduce la señal de fondo añadida por la capade soporte 28. Además de su mínima contribución al ruido de fondo, el grafeno también exhibe una notable conductividad eléctrica y térmica29. Se ha demostrado que las rejillas recubiertas de grafeno y óxido de grafeno producen una mayor densidad de partículas, una distribución más uniforme de las partículas30 y una localización reducida en el AWI22. Además, el grafeno proporciona una superficie de soporte que se puede modificar aún más para: 1) ajustar las propiedades fisicoquímicas de la superficie de la rejilla a través de la funcionalización 31,32,33; o 2) acoplar agentes enlazantes que faciliten la purificación por afinidad de proteínas de interés 34,35,36.

En este artículo, hemos modificado un procedimiento existente para recubrir rejillas crioEM con una sola capa uniforme de grafeno30. Las modificaciones tienen como objetivo minimizar el manejo de la red en todo el protocolo, con el objetivo de aumentar el rendimiento y la reproducibilidad. Además, discutimos nuestro enfoque para evaluar la eficacia de varios tratamientos UV/ozono en la representación de rejillas hidrófilas antes de la inmersión. Este paso en la preparación de muestras crioEM utilizando rejillas recubiertas de grafeno es fundamental, y hemos encontrado que nuestro método sencillo para cuantificar la hidrofilicidad relativa de las rejillas resultantes es útil. Utilizando este protocolo, demostramos la utilidad de emplear rejillas recubiertas de grafeno para la determinación de la estructura mediante la generación de una reconstrucción 3D de alta resolución de S. pyogenes Cas9 catalíticamente inactivo en complejo con ARN guía y ADN diana.

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Protocolo

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1. Preparación del grafeno CVD

  1. Prepare la solución de grabado de grafeno como se describe a continuación.
    1. Disuelva 4,6 g de persulfato de amonio (APS) en 20 ml de agua de grado molecular en un vaso de precipitados de 50 ml para obtener una solución de 1 M y cúbralo con papel de aluminio. Deje que APS se disuelva por completo mientras continúa con el paso 1.2.
  2. Prepare una sección de grafeno CVD para el recubrimiento de metacrilato de metilo (MMA). Corta con cuidado una sección cuadrada de grafeno CVD. Transfiera el cuadrado a un cubreobjetos (50 mm x 24 mm) dentro de una placa de Petri limpia y cúbralo durante el transporte a la máquina de recubrimiento giratorio.
    NOTA: Un cuadrado de 18 mm x 18 mm debe producir 25-36 cuadrículas recubiertas de grafeno.

2. Recubrimiento de grafeno CVD con MMA

  1. Ajuste la configuración del recubrimiento giratorio a un centrifugado de alta velocidad de 60 s a 2.500 rpm. Coloque con cuidado el grafeno CVD en el mandril del tamaño adecuado.
    NOTA: Idealmente, el grafeno CVD se extenderá 1-2 mm sobre el borde del mandril seleccionado para evitar la aspiración de MMA en el sistema de vacío.
  2. Presione el botón Take/Absorb para activar la bomba de vacío y fijar el grafeno CVD al mandril. Aplique MMA en el centro del cuadrado de grafeno CVD, cierre la tapa y presione el botón Inicio/Parada inmediatamente. Para un cuadrado de 18 mm x 18 mm de grafeno CVD, 40 μL de MMA son suficientes.
  3. Una vez que se haya detenido el centrifugado, desconecte la bomba de vacío y recupere con cuidado el grafeno CVD recubierto de MMA con unas pinzas. Invierta el grafeno CVD de modo que el lado recubierto de MMA quede hacia abajo y vuelva a colocarlo en el cubreobjetos de vidrio.

3. Grabado con plasma de la parte posterior de grafeno

  1. Transfiera el grafeno CVD en el cubreobjetos al descargador de incandescencia y descargue la luminiscencia durante 30 s a 25 mA con unas pinzas de punta plana.
  2. Regrese el grafeno CVD en el cubreobjetos a la placa de Petri y cúbralo durante el transporte al área de grabado de cobre. El recubrimiento MMA protegerá la capa superior de grafeno del grabado por plasma.

4. Corte de cuadrados de grafeno CVD recubiertos de MMA del tamaño de una cuadrícula

  1. Use dos pares de pinzas para sostener el cuadrado de grafeno CVD. Tome nota de la orientación del cuadrado de grafeno CVD, mantenga el lado MMA hacia arriba mientras está sujeto a las pinzas (CRITICAL).
  2. Corta el grafeno CVD en cuadrados de aproximadamente 3 mm x 3 mm. Use dos juegos de pinzas de acción inversa para este paso para sujetar el cuadrado de grafeno CVD con el lado derecho hacia arriba y anclarlo en su posición, y también para sostener el borde de un cuadrado de 3 mm x 3 mm después de cortarlo del resto del cuadrado.

5. Disolución de sustrato de cobre de grafeno CVD recubierto de MMA

  1. Flote con cuidado cada cuadrado de 3 mm x 3 mm en la solución APS. Haga contacto con la superficie de la solución APS antes de soltar cada cuadrado. Incline el vaso de precipitados de tal manera que cada cuadrado pueda colocarse en la solución en un ángulo poco profundo; Esto asegura que el cuadrado no se hunda.
  2. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio e incube durante la noche a 25 °C.

6. Eliminación de películas de MMA/grafeno de APS

  1. Utilice un cubreobjetos de vidrio con unas dimensiones de 12 mm x 50 mm y extraiga los cuadrados de MMA/grafeno del APS sumergiendo suavemente el cubreobjetos verticalmente en el APS y luego moviendo el cubreobjetos lateralmente de modo que haga codo con un cuadrado flotante de MMA/grafeno.
  2. Retire con cuidado el cubreobjetos y asegúrese de que el cuadrado se adhiera completamente al costado del cubreobjetos al retirarlo.
  3. Transfiera los cuadrados de MMA/grafeno a un vaso de precipitados limpio de 50 ml lleno de agua de grado molecular durante 20 minutos. Sumerja suavemente el cubreobjetos con un cuadrado de MMA/grafeno unido al agua verticalmente y asegúrese de que el cubreobjetos se desprenda del cubreobjetos al interactuar con la superficie del agua. Repita para todos los cuadrados de MMA/grafeno.

7. Adherir grafeno a las rejillas

  1. Con unas pinzas de acción negativa, sumerja suavemente una rejilla verticalmente en el agua con el lado de carbono frente a un cuadrado flotante de MMA/grafeno. Una vez en contacto con el cuadrado, retire con cuidado la rejilla y asegúrese de que el cuadrado se adhiera completamente al lado de carbono de la rejilla al retirarlo. Minimice el movimiento lateral de la rejilla cuando se sumerja en agua para evitar dañar los cuadrados de la rejilla (CRÍTICO).
  2. Coloque las rejillas en un cubreobjetos limpio con MMA/grafeno hacia arriba y séquelas al aire durante 1 a 2 minutos. Transfiera las rejillas recubiertas de grafeno/MMA a una placa calefactora ajustada a 130 °C con unas pinzas de punta plana.
  3. Cubra con la parte superior de una placa de Petri de vidrio e incube durante 20 min. Retira del fuego y deja enfriar a temperatura ambiente durante 1 a 2 min.
    PRECAUCIÓN: Tenga cuidado ya que la parte superior de la placa de Petri estará extremadamente caliente.

8. Disolución de MMA con acetona

  1. Transfiera todo el cubreobjetos a una placa de Petri llena de 15 ml de acetona. Incubar durante 30 min.
  2. Utilizando una pipeta serológica de vidrio limpio, transfiera la acetona, en la que se incubaron las rejillas, a un contenedor de residuos. Agregue con cuidado 15 ml de acetona fresca a la placa de Petri con una pipeta serológica de vidrio limpio. Incubar durante 30 min.
  3. Repita estos pasos de lavado para un total de 3 lavados con acetona.

9. Eliminación de acetona residual con isopropanol

  1. Después de 3 lavados con acetona, retire la acetona y reemplácela con 15 ml de isopropanol con una pipeta serológica de vidrio limpio. Incubar durante 20 min.
  2. Repita 3 veces para un total de 4 lavados con isopropanol. Retire con cuidado las rejillas del isopropanol y séquelas al aire en un cubreobjetos limpio con unas pinzas.
    NOTA: El isopropanol residual puede dificultar la liberación de las rejillas de las pinzas. Hacer contacto entre la rejilla y el cubreobjetos limpio antes de soltar la rejilla de las pinzas puede aliviar este problema.
  3. Evapore los residuos orgánicos transfiriendo el cubreobjetos con rejillas recubiertas de grafeno a una placa calefactora ajustada a 100 °C durante 10 min. Deje enfriar a temperatura ambiente y guárdelo al vacío hasta su uso.

10. Tratamiento UV/ozono de rejillas recubiertas de grafeno

  1. Con unas pinzas de acción inversa, coloque suavemente las rejillas en un área de iluminación limpia de un limpiador UV/ozono con el lado recubierto de grafeno hacia arriba.
  2. Deslice el área de iluminación para cerrarla y encienda la máquina. Gire el dial de tiempo al tiempo de tratamiento designado para comenzar el tratamiento UV/ozono de las rejillas.
    NOTA: La duración del tratamiento es un parámetro ajustable, y el exceso de tratamiento tiene el potencial de dañar la red. Han et al.30 recomiendan 10 min de tratamiento UV/ozono, y también hemos encontrado que un tratamiento de 10 min es suficiente. Consulte el paso 12 para obtener orientación sobre cómo ajustar este tiempo de tratamiento.
  3. Proceda directamente a sumergir una muestra de crioEM en las rejillas tratadas siguiendo los pasos de inmersión descritos en Koh et al.37.
    NOTA: Los hidrocarburos atmosféricos pueden acumularse en la superficie de la rejilla después del tratamiento UV/ozono y aumentar la hidrofobicidad de la superficie del grafeno38,39. Para evitar esto, sumerja inmediatamente las rejillas tratadas con UV/ozono. Puede ser ventajoso tratar las rejillas UV/ozono en lotes, por ejemplo, tratar UV/ozono seis rejillas e inmediatamente sumergir esas seis rejillas, luego tratar UV/ozono un segundo lote de rejillas, seguido de sumergir el segundo lote.

11. Captura de una imagen de difracción

  1. Asegúrese de que el microscopio esté bien sintonizado con la iluminación paralela establecida y ajuste el desenfoque final a -0,2 μm.
  2. Inserte la pantalla fluorescente y el haz se detendrá por completo. Ingrese al modo de difracción para visualizar claramente los puntos de difracción.
  3. Adquiera una imagen con una cámara CCD y evalúela con un software de análisis de imágenes.
    NOTA: Los puntos de difracción más fácilmente observables e identificables generados por una monocapa de grafeno son 6 puntos correspondientes a una frecuencia espacial de 2,13 Å. Utilice una herramienta de medición para estimar la distancia desde el centro del haz difractado hasta uno de estos puntos de difracción en unidades recíprocas. En particular, 2,13 Å figure-protocol-1 0,47 Å-1.

12. Evaluación de la hidrofilicidad de la red

  1. Prepare la configuración de imágenes. Localice un soporte para teléfono, una superficie de imagen de mesa, un teléfono con cámara, una funda de vidrio y una película de parafina. Las imágenes que se muestran aquí se obtuvieron utilizando un soporte de teléfono y una superficie de imagen de mesa que se imprimieron en 3D utilizando los archivos .stl proporcionados, lo que resultó en mediciones de ángulo de contacto más fácilmente reproducibles y cuantificables (Figura suplementaria 1A).
  2. Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre la superficie plana, luego corte un cuadrado de 1 cm por 1 cm de película de parafina y colóquelo sobre el cubreobjetos de vidrio. Coloque el teléfono en el soporte del teléfono, orientando el teléfono de modo que la cámara quede en el plano con el cubreobjetos de vidrio. Asegure el teléfono en esta posición con bandas elásticas (Figura complementaria 1B). Tome una foto de muestra para verificar que la cámara esté alineada con la superficie de la imagen.
  3. Inmediatamente después del tratamiento UV/ozono de las rejillas recubiertas de grafeno, coloque una sola rejilla en el cuadrado de la película de parafina en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el lado del grafeno esté orientado hacia arriba. Agregue una gota de agua de 2 μL en el centro de la superficie de la rejilla con una pipeta e inmediatamente tome una foto.
    NOTA: Repita este paso después de: i) los intervalos deseados de tratamiento UV/ozono para determinar una duración suficiente del tratamiento; o ii) intervalos de tiempo deseados después del tratamiento UV/ozono para medir cuánto tiempo después del tratamiento la superficie de la rejilla mantiene su carácter hidrofílico.
  4. Calcule los ángulos de contacto a partir de fotos importándolas a ImageJ43 y utilizando el complemento de ángulo de contacto.

13. Análisis de una sola partícula del conjunto de datos complejos dCas9

NOTA: Todo el procesamiento de imágenes descrito en este protocolo se realizó utilizando cryoSPARC versión 4.2.1.

  1. Preprocese películas mediante los trabajos Patch Motion Correction y Patch CTF Estimation. Realice la selección de partículas mediante el trabajo Selector de blobs, utilizando una mancha esférica cuyo diámetro oscila entre 115 Å y 135 Å.
  2. Extraiga partículas mediante el trabajo Extraer de micrografías, utilizando el coeficiente de correlación normalizado (NCC) y umbrales de potencia, lo que da como resultado aproximadamente 200-300 partículas por micrografía. Tenga en cuenta que los umbrales apropiados y el recuento de partículas resultante pueden variar, y los usuarios deben inspeccionar la calidad de la selección en una variedad de micrografías para identificar las condiciones adecuadas.
  3. Realice reconstrucciones iniciales multiclase utilizando el trabajo de reconstrucción Ab-initio, que requiere tres clases. Es probable que dos de las tres clases contengan partículas que no sean Cas9, incluidos los contaminantes de la superficie. Seleccione la clase similar a dCas9 para su posterior procesamiento.
    NOTA: Se pueden aplicar rondas adicionales de reconstrucción Ab-initio multiclase o refinamiento heterogéneo para refinar aún más la pila de partículas.
  4. Realice el refinamiento 3D mediante el trabajo Refinamiento no uniforme seleccionando los parámetros predeterminados. Estime la resolución de la reconstrucción utilizando los trabajos de Validación (FSC) y ThreeDFSC, empleando los mapas y la máscara del refinamiento 3D final.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fabricación exitosa de rejillas crioEM recubiertas de grafeno utilizando el equipo (Figura 1) y el protocolo (Figura 2) descritos aquí dará como resultado una monocapa de grafeno que cubrirá los orificios de la lámina que puede confirmarse por su patrón de difracción característico. Para promover la adsorción de proteínas a la superficie del grafeno, se puede utilizar el tratamiento UV/ozono para hacer que la superficie sea hidrófila mediante la instalación d...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La preparación de muestras de CryoEM implica una serie de desafíos técnicos, ya que la mayoría de los flujos de trabajo requieren que los investigadores manipulen manualmente las rejillas frágiles con extremo cuidado para evitar dañarlas. Además, la posibilidad de vitrificación de cualquier muestra es impredecible; Las partículas a menudo interactúan con la interfaz aire-agua o con la lámina de soporte sólida que se superpone a las rejillas, lo que puede llevar a que las partículas adopten las orientaciones preferidas o ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los especímenes se prepararon y se obtuvieron imágenes en las instalaciones de CryoEM en MIT.nano en microscopios adquiridos gracias a la Fundación Arnold y Mabel Beckman. Los dispositivos de imágenes de ángulo de contacto se imprimieron en el MIT Metropolis Maker Space. Agradecemos a los laboratorios de Nieng Yan y Yimo Han, y al personal de MIT.nano por su apoyo a lo largo de la adopción de este método. En particular, extendemos nuestro agradecimiento a los doctores Guanhui Gao y Sarah Sterling por sus perspicaces discusiones y comentarios. Este trabajo fue financiado por las subvenciones R01-GM144542, 5T32-GM007287 de los NIH y la 2046778 de subvenciones NSF-CAREER. La investigación en el laboratorio de Davis cuenta con el apoyo de la Fundación Alfred P. Sloan, el Fondo James H. Ferry, la Clínica J del MIT y la Familia Whitehead.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
precipitados de 250 mL (3x)Fisher02-555-25B
Vaso de precipitados de 50 mL (2x)Corning1000-50
AcetonaFisherA949-4
Papel de aluminioFisher15-078-292
Persulfato de amonioFisher(I17874
Cubreobjetos 50 mm x 24 mmMattekPCS-1.5-5024
Francano CVDSupermercado de grafenoCVD-Cu-2x2
easiGlow descargadorTed-Pella91000S
Fisher50-239-60
Cortador de vidrioGrainger21UE26
Placa de Petri de vidrio y cubierta VWR75845-544
Pipeta serológica de vidrioFisher13-676-34D
Estuche de almacenamiento de rejillaEMS71146-02
Placa calefactoraFisher07-770-108
IsopropanolSigma W292907
KimwipeFisher06-666
Tijeras de laboratorio Fisher13-806-2
Metacrilato de metilo EL-6 KayakuMMA M310006 0500L1GL
Agua de grado molecularCorning46-000-CM
Pinzas de acción negativa (2x)Fisher50-242-78
Pipeta P20Rainin17014392
Pipeta P200Rainin17008652 
ParafilmFisher13-374-12
Puntas de pipetaRainin30389291
Rejillas Quantifoil con carbono agujereado EMSQ2100CR1
Recubridor giratorio  SetCasKW-4Acon mandril SCA-19-23
ReglaULINEH-6560
Termómetro LimpiadorGrainger 3LRD1
 BioForceSKU: PC440
Desecador de vacíoThomas Scientific1159X11
Papel WhatmanVWR28297-216
Vaso de Etanol Millipore-Sigma 1.11727 Pinzas de punta plana  UV/Ozono

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461(2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085(2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279(2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500(2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743(2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185(2018).

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