Artículo de método

Modelado de la cirugía de cataratas en ratones

DOI:

10.3791/66050

⸱

1 de diciembre de 2023

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este método modela la cirugía de cataratas in vivo mediante la extracción de células de fibra del cristalino de ratones adultos y dejando atrás la bolsa capsular con células epiteliales del cristalino (LEC) adjuntas. A continuación, se evalúa la respuesta a la lesión en varios momentos postoperatorios utilizando criterios moleculares y morfológicos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cirugía de cataratas (SC) es un tratamiento eficaz para las cataratas, una de las principales causas de discapacidad visual en todo el mundo. Sin embargo, el SC conduce a la inflamación ocular y, a largo plazo, puede dar lugar a una opacificación capsular posterior (OCP) y/o a una luxación del cristalino impulsada por el sobrecrecimiento postquirúrgico de las células epiteliales del cristalino (LEC) y su conversión en miofibroblastos y/o células fibrosas aberrantes. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales la CS da lugar a la inflamación y la PCO son todavía oscuros porque la mayoría de los modelos in vitro no recapitulan la respuesta de cicatrización de las LEC observadas in vivo, mientras que los modelos animales tradicionales de cirugía de cataratas, como los conejos, no permiten la manipulación genética de la expresión génica para probar los mecanismos. Recientemente, nuestro laboratorio y otros han utilizado con éxito ratones modificados genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares que impulsan la inducción de la señalización proinflamatoria y la transición epitelial de LEC a mesenquimatoso, lo que lleva a nuevos conocimientos sobre la patogénesis del PCO. Aquí, informamos sobre el protocolo establecido para modelar la cirugía de cataratas en ratones, que permite un perfil transcripcional robusto de la respuesta de las LEC a la eliminación de células de fibra del cristalino a través de RNAseq, la evaluación de la expresión de proteínas mediante inmunofluorescencia semicuantitativa y el uso de herramientas modernas de genética de ratones para probar la función de genes que se supone que participan en la patogénesis de secuelas agudas como la inflamación, así como la conversión posterior de LEC en miofibroblastos y/o células aberrantes de las fibras del cristalino.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cristalino es un tejido transparente altamente organizado que refracta la luz para producir una imagen claramente enfocada en la retina 1,2,3. Este órgano especializado está rodeado por una membrana basal ininterrumpida (la cápsula), que aísla el cristalino de otras partes del ojo. La superficie anterior interna de la cápsula ancla una monocapa de células epiteliales del cristalino (LEC), que luego se diferencian en el ecuador del cristalino en células de fibra del cristalino, que comprenden la gran mayoría del cristalino3. Una catarata ocurre cuando el cristalino pierde su transparencia debido a factores como el envejecimiento, la mutación genética, la radiación UV, el estrés oxidativo y el trauma ocular4. La catarata es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo, especialmente en los países con una atención médica deficiente5. Sin embargo, esta afección ahora se trata fácilmente mediante la extirpación quirúrgica de las células opacas del cristalino mediante facoemulsificación en la que se extrae la cápsula central del cristalino y el epitelio adjunto del cristalino, seguido del uso de una sonda vibratoria para romper la masa celular del cristalino en fragmentos más pequeños que se pueden succionar; dejando atrás una bolsa capsular con algunas LEC ecuatoriales adjuntas1. La visión se restaura más comúnmente mediante la implantación postquirúrgica de una lente intraocular (LIO) artificial.

Si bien la cirugía de cataratas (SC) es un tratamiento altamente efectivo y mínimamente invasivo para las cataratas, la recuperación postquirúrgica de un paciente puede verse obstaculizada agudamente por el desarrollo de inflamación ocular 5,6,8. Esta inflamación puede causar dolor postquirúrgico, edema de retina que conduce al desprendimiento de retina, así como exacerbación de otras afecciones inflamatorias y fibróticas como uveítis y glaucoma 4,7,8,9. La inflamación ocular post-CS (PCS) generalmente se trata con colirios antiinflamatorios que están plagados de un mal cumplimiento por parte del paciente o cirugía de cataratas sin gotas que puede conducir a un aumento de la prevalencia de moscas volantes 8,10,11. A largo plazo, los resultados de la CS pueden verse comprometidos por el desarrollo de opacificación capsular posterior (OCP)12. La PCO ocurre cuando las LEC residuales que quedan después de la cirugía experimentan una respuesta de cicatrización de la herida, proliferan y migran a la cápsula posterior del cristalino a los meses o años, contribuyendo a la obstrucción visual secundaria13,14.

La comprensión de los mecanismos moleculares por los cuales el CS da lugar a tales respuestas agudas y crónicas representa un gran desafío en el campo, ya que gran parte de la literatura que investiga el PCO se basa en la inducción de la conversión de LEC a miofibroblastos en cultivo mediante tratamiento con factor de crecimiento transformante activo beta (TGFβ)12,15. Los modelos de bolsas capsulares humanas creados a partir de lentes de cadáver cultivadas in vitro reflejan mejor la biología de las PCS del cristalino, ya que las LEC se cultivan en su membrana basal nativa, pero son difíciles de manipular mecánicamente, no recapitulan el entorno intraocular y son inherentemente variables debido a la variabilidad de lente a lente (o de donante a donante)16,17. Los modelos in vivo de cirugía de cataratasde conejo 1,18 y primates no humanos19,20 superan algunos de estos problemas, pero aún no son fáciles de manipular para los estudios mecanicistas. En particular, un estudio previo de la regeneración del cristalino de los mamíferos encontró una regeneración significativa del cristalino dentro de las cuatro semanas posteriores a la extracción de las células de fibra del cristalino de los ratones, dejando atrás las células epiteliales del cristalino y la cápsula, mientras que no se produjo un recrecimiento del cristalino cuando se extrajo todo el cristalino21,22. Posteriormente, simplificamos este procedimiento y lo optimizamos para el estudio de la respuesta aguda de las LEC a la eliminación de células de fibra del cristalino y su posterior conversión en una población mixta de células con propiedades de miofibroblastos y células de fibra. 

Utilizando este modelo murino de cirugía de cataratas, hemos demostrado que las células epiteliales del cristalino remodelan drásticamente su transcriptoma a las 6 horas PCS para producir numerosas citocinas proinflamatorias23, mientras que comienzan a expresar marcadores fibróticos a las 24 h PCS 12,23, antes del inicio de la señalización canónica de TGFβ. Los experimentos mecanicistas en ratones knockout utilizando este modelo revelaron que la expresión de fibronectina celular por parte de las LEC es necesaria para una respuesta fibrótica sostenida PCS, probablemente debido tanto a su papel en el ensamblaje de la MEC fibrótica como a la señalización celular12. Otros estudios mostraron que la αVβ8-integrina es necesaria para la transición de LECs a miofibroblastos debido a su función en la activación de TGFβ, y el potencial de este enfoque para identificar pistas terapéuticas anti-PCO se confirmó ya que un antagonista de αVβ8-integrina también bloqueó LEC EMT15.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe cómo eliminar las células de fibra del cristalino de ratones vivos (Figura 1y Figura 4) mientras se deja atrás la cápsula del cristalino y las LEC para modelar la respuesta de la LEC a la cirugía de cataratas.

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Protocolo

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El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Delaware bajo el protocolo #1039-2021-1. De acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión24, todas las cirugías de supervivencia ocular solo se pueden realizar en un ojo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo. En la Figura 2 y la Figura 3 se muestran enfoques alternativos para extraer las fibras del cristalino y suturarlas.

1. Animales

  1. Para este procedimiento, utilice cualquier cepa de ratón de laboratorio de tipo salvaje o genéticamente modificada que tenga ojos con lentes intactos.
    1. Utilice ratones C57BL/6 como punto de partida, ya que sus respuestas son altamente reproducibles tanto a nivel morfológico como molecular25,26.
      NOTA: Se puede utilizar C57BL/6 o cualquier cepa de ratón. En el protocolo de vídeo, se utiliza el ratón FVB para una mejor demostración visual.
    2. Realizar estudios de la respuesta de mutantes en otras cepas de ratón con controles emparejados por cepas.
      NOTA: Con la práctica, este procedimiento se puede realizar en ratones cuyos cristalinos tienen cataratas siempre que la cápsula del cristalino esté intacta y el cristalino no haya sufrido una licuefacción significativa. Véase el estudio de ratones con deleción condicional del cristalino del factor de transcripción Sip127.
  2. Realice esta cirugía en ratones de ambos sexos, desde las 8 semanas hasta los 24 meses25,26.
    1. Realice esta cirugía en ratones aún más jóvenes (después de la apertura de los párpados) con práctica, aunque será más difícil ya que estos ojos serán significativamente más pequeños.
    2. Tenga especial cuidado con las cirugías en ratones ancianos debido a su menor tolerancia a la anestesia25,26.
      NOTA: Las diferencias de sexo en las respuestas a la cirugía son más prevalentes en ratones ancianos26.

2. Preparación de soluciones e instrumentos quirúrgicos

  1. Obtenga agentes anestésicos y analgésicos, gotas de dilatación, bisturí desechable estéril, pinzas Dumont #5, pinzas de sutura 2-110, agujas (26 G 1/2 y 27 G 45° punta dispensadora doblada 1"), jeringas y solución salina balanceada (BSS).
  2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos en un autoclave.

3. Antes de la anestesia

  1. Antes de la anestesia, administre al ratón una gota de atropina al 1% y una gota de fenilefrina al 2,5% para dilatar la pupila (véase la figura 1A) del ojo que se está sometiendo a la cirugía. Aplique ungüento oftálmico en el ojo no operado para evitar que la superficie se seque.
    NOTA: La declaración de ARVO sobre el uso de animales en la investigación ocular24 solo permite que un solo ojo se someta a una cirugía de supervivencia, dejando el otro ojo intacto para que el animal conserve la visión. Así, las cirugías de supervivencia son siempre unilaterales; Sin embargo, el ojo contralateral no operado se puede operar justo antes del sacrificio para crear controles de "tiempo cero" emparejados con los animales.
  2. Asegúrate de que las gotas para los ojos no corran por la cara del ratón y entren en la nariz, ya que esto puede obstruir su respiración.
  3. Prepare una jeringa con BSS estéril utilizando una aguja estéril de 26 G 1/2. Coloque la jeringa con una punta dispensadora estéril de 27 G y 45° doblada y roma de 1 pulgada (denominada punta dispensadora a continuación).

4. Anestesia

  1. Después de las gotas oftálmicas, anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de solución de xilacina/ketamina/acepromazina (35 mg/kg, 80 mg/kg y 0,5 mg/kg) (Figura 1B).
    NOTA: Es posible que la anestesia inhalada no sea posible a menos que se pueda utilizar un cono nasal especializado para permitir el acceso al ojo necesario para la cirugía.

5. Realización de la incisión

  1. Una vez que el ratón está completamente bajo anestesia, medido por la falta de reflejo de pinzamiento del dedo del pie, y su pupila se ha dilatado completamente (2 mm) (Figura 4A), el ratón está listo para la cirugía.
    1. Mueva el ratón anestesiado a la etapa de un microscopio óptico de disección compuesta. Use una almohadilla térmica para asegurarse de que el mouse tenga una regulación térmica adecuada y use cortinas estériles.
    2. Observe el ojo con un aumento de 10x-20x utilizando un microscopio de disección (consulte la Tabla de materiales para obtener información específica).
  2. Haga una incisión de 1-1,5 mm en el centro de la córnea con un bisturí quirúrgico estéril. Asegúrese de que la incisión se extienda a través de la córnea e incida en la cápsula anterior del cristalino (Figura 1C y Figura 4B).

6. Separación de las fibras de la lente de la bolsa capsular

  1. Sujete la jeringa con una punta dispensadora que contenga BSS estéril y expulse suavemente 1 gota de BSS por encima de la córnea para humedecer la superficie y manipularla posteriormente.
  2. Separe la masa de fibra de la lente de la cápsula de la lente.
    1. Inserte la punta dispensadora a través de la incisión corneal central en la incisión de la cápsula del cristalino, luego mueva suavemente la aguja con un movimiento circular mientras libera lentamente el BSS para separar las conexiones apical-apicales entre las células epiteliales y de fibra del cristalino (hidrodisección), expulsando finalmente la masa de fibras del cristalino (Figura 1D).
    2. En la mayoría de los casos, la masa de fibra eventualmente se adherirá a la punta dispensadora durante este procedimiento (Figura 2A). Si esto sucede, retire suavemente la punta dispensadora del ojo interior; y limpiar con una toalla estéril para retirar este pañuelo. Repita hasta que se retiren todas las células de fibra de la lente.
    3. Alternativamente, use micropinzas (número 5 Dumont) para extraer el núcleo del cristalino (Figura 2B). Si utiliza este método, tenga cuidado de que la incisión corneal original exceda el diámetro del núcleo para garantizar una fácil extracción.
  3. Enjuague la cápsula de la lente con BSS estéril para eliminar las fibras restantes.
  4. Confirme que la cápsula del cristalino queda dentro del ojo (Figura 1E y Figura 4C) observando su apariencia translúcida/vítrea a través del microscopio.

7. Inflar la cámara anterior y suturar la incisión corneal

  1. Inflar la cámara anterior a su profundidad normal inyectando BSS a través de la incisión en la cámara anterior.
    1. Añadir inhibidores o activadores de vías de señalización de interés para el BSS para probar su papel en la respuesta a lesiones del cristalino12,15.
      NOTA: Los animales también pueden ser tratados sistémicamente con inhibidores de la vía, que pueden ser necesarios dependiendo de la farmacocinética del recambio del fármaco, ya que el equilibrio del humor acuoso se restablece después de la cirugía15.
  2. Suturar la incisión corneal con nudos cuadrados utilizando hilo de nailon 10-0 con una aguja cónica y curvada de 5,3 mm 1/2c (Figura 1F y Figura 4D-F).
    1. Coloque una puntada de nudo cuadrado en la parte central de la incisión o dos puntadas de nudo cuadrado en las mitades superior e inferior de la incisión original (véase la figura 3). El número de puntos depende de la longitud de la incisión corneal.
    2. No perfore ambos colgajos de córnea a la vez. En su lugar, sostenga un colgajo corneal con pinzas en la mano no dominante y empuje la aguja/nailon a través de él. Una vez que se haya perforado un lado de la córnea, empuje la aguja/nailon a través del siguiente colgajo corneal. Cierre los colgajos corneales con puntos de nudo cuadrado.

8. Cuidados postquirúrgicos

NOTA: Se aplica una pomada antibiótica tópica en el ojo y se administran agentes analgésicos. Los ratones no suelen mostrar signos de sufrimiento después de la cirugía inicial. Si es necesario, se puede usar una versión de liberación lenta de buprenorfina.

  1. Inmediatamente después de esta cirugía, realice los siguientes subpasos.
    1. Aplique una gota de ungüento oftálmico de eritromicina al 0,5% directamente sobre la sutura. Asegúrese de que toda la incisión esté cubierta con ungüento.
    2. Administrar una inyección intraperitoneal de buprenorfina (0,1 mg/kg).
  2. Permita que el ratón se recupere de la anestesia en una jaula colocada sobre una almohadilla térmica para optimizar el soporte térmico.
    NOTA: Vigile al animal para detectar signos de trauma, angustia o malestar. Algunos signos incluyen infección/rascado en el sitio quirúrgico, sutura desplazada, pérdida de pelo, etc.

9. Seguimiento de la recuperación de los animales

  1. Monitorear la recuperación del animal después de la cirugía hasta que despierte de la anestesia.
  2. Revise los ratones todos los días durante los primeros 3 días después de la cirugía.
    NOTA: Por lo general, no es necesario quitar los puntos porque los ratones se sacrifican antes de la curación completa (2 semanas de PCS) o los puntos se caen espontáneamente.
  3. Administrar buprenorfina por vía oral, según sea necesario para el tratamiento del dolor después de 4-8 h después de la cirugía, a una dosis de 0,5 mg/kg (en gelatina) o una dosis de 0,1 mg/kg para aquellos que no comen. Alternativamente, administre buprenorfina de liberación prolongada justo antes de la cirugía.
    NOTA: Cuando sea posible, se deben utilizar analgésicos preventivos, sin embargo, esto puede requerir ajustes en el protocolo analgésico que requieren revisión y aprobación del comité institucional de cuidado y uso de animales.

10. Eutanasia

  1. Sacrificar al ratón en el momento deseado después de la cirugía.
    1. Extirpó el ojo operado utilizando el ojo no operado como tejido de control; o volver a anestesiar al animal, realizar una cirugía de extracción de células de fibra del cristalino en el ojo contralateral no operado previamente, y luego sacrificar inmediatamente al animal (sin permitirle despertar de la anestesia) para proporcionar un control operado en tiempo cero.
    2. Asegure una disección y recolección de tejidos rápidas.
      NOTA: Las LEC experimentan cambios transcriptómicos a los pocos minutos de la cirugía, por lo que la recolección rápida de tejido y la fijación/congelación son necesarias cuando se estudian las respuestas tempranas de las LEC a la cirugía.

11. Realización de análisis adicionales en los tejidos del cristalino recolectados

  1. Utilice el tejido obtenido para inmunotinción, secuenciación de ARN, cultivo celular o análisis occidental 12,15,23,25,26,28. La citometría de flujo también es teóricamente posible12, aunque el pequeño número de LECs en el cristalino del ratón (~40.000)29 y la presencia de restos celulares asociados a la cápsula después de la cirugía hacen que esto sea un desafío.
  2. Inmunotinción
    1. Eutanasia del ratón en una cámara mediante inhalación de CO2 (4 L/min) de una bombona de gas. Aumente el caudal a 8-10 L/min una vez que el ratón esté inconsciente y continúe esta exposición hasta el cese completo de la respiración más 1 min.
      NOTA: El ratón puede ser sacrificado utilizando un método apropiado según las Pautas de AVMA para la Eutanasia de Animales o según las pautas o políticas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
    2. Asegure el sacrificio adecuado empleando un método secundario de eutanasia, por ejemplo, la dislocación cervical.
      NOTA: El laboratorio de Duncan ha investigado puntos de tiempo que van desde minutos hasta meses PCS 12,15,23.
    3. Después de que el ratón haya sido sacrificado humanamente, aísle el ojo operado para su análisis.
      1. Sostenga las micropinzas en la mano no dominante para agarrar el ojo operado mientras sostiene las microtijeras en la mano dominante.
      2. Corta suavemente el nervio óptico y los músculos que anclan el ojo.
        NOTA: Tenga especial cuidado al manipular los ojos que se operaron recientemente en comparación con los que han tenido más tiempo para sanar el PCS. Los ojos recién operados son estructuralmente más frágiles.
    4. Incrustar el ojo diseccionado en medios OCT para su posterior criosección, inmunotinción y microscopía confocal semicuantitativa 28,30.
  3. Aislamiento de la bolsa capsular con células asociadas para secuenciación de ARN, cultivo celular o análisis de Western blot
    1. Eutanasia del ratón en una cámara mediante inhalación de CO2 (4 L/min) de una bombona de gas. Aumente el caudal a 8-10 L/min una vez que el ratón esté inconsciente y continúe esta exposición hasta el cese completo de la respiración más 1 min.
    2. Asegure el sacrificio adecuado empleando un método secundario de eutanasia, por ejemplo, la dislocación cervical.
    3. Si se requiere una PCS temprana en el tiempo (dentro de 1-2 días), retire los puntos antes de la extracción de tejido o haga otra incisión en la córnea a través de la cual extraer la cápsula del cristalino.
      NOTA: En puntos posteriores de PCS, es probable que los puntos se hayan caído, por lo que se necesitará una nueva incisión.
  4. Localiza la cápsula de la lente translúcida.
    1. Inserte suavemente las micropinzas a través de la abertura corneal, agarre la cápsula y retírela de la cámara anterior.
    2. Coloque la cápsula en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o en una placa de cultivo para su posterior análisis.

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Resultados

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Basándose en los resultados de este método quirúrgico, el Laboratorio Duncan ha utilizado este modelo de ratón de cirugía de cataratas para construir un curso de tiempo de respuesta a la lesión de las células epiteliales del cristalino después de la cirugía (Figura 5). A las 6 h después de la cirugía, el 5% del transcriptoma epitelial del cristalino se expresa diferencialmente (Figura 6A), incluyendo la regulación positiva de numerosos genes de respuesta tempran...

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Discusión

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Esta técnica quirúrgica requiere un manejo avanzado del ratón y habilidades microquirúrgicas que requieren práctica para desarrollarse. Lo más difícil de dominar es la colocación de suturas finas en la córnea para cerrar la herida. Supongamos que el experimentador es un novato total en la sutura. En ese caso, se recomienda practicar primero el uso de cuerda y tela, luego pasar a practicar el uso de suturas de gran diámetro en frutas pequeñas para dominar los movimientos necesarios de la ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El laboratorio de Duncan ha recibido apoyo financiero de Pliantx para probar terapias anti-PCO utilizando este modelo de cirugía.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo del Instituto Nacional del Ojo (EY015279 y EY028597) y Delaware INBRE (P20 GM103446).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5% Pomada oftálmica de eritriomicina USPBaush Lomb24208-910-55
1% Sulfato de atropina solución oftálmicaAmneal60219-1748-2
1% Tropicamida solución oftálmica USPAkorn17478-102-12
10-0 Sutura de nailonEthicon7707G
2,5% Clorhidrato de fenilefrina solución oftálmica USPAkorn17478-200-12
26 G 1/2 Agujas - rectasBD PrecisionGlide5111
27 G 45° punta dosificadora doblada 1"Harfington
Solución salina balanceadaPhoenix57319-555-06
Bupranorfina (0,1 mg/kg)APP Pharmaceticals401730D
Soluciónde clorhexidina
Portaagujas 2-110Duckworth & Kent2-110-3E
Tijeras Noyes, rectasHerramientas de ciencia fina12060-02
Microscopio modelo Nikon SMZ800Bisturí
No.11Pluma2975#11
Pinzas #5 DumontCiencias de Microscopía Electrónica72700-D
Xilacina/Ketamina/Acepromazina (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0,5 mg/ kg) soluciónAPP Pharmaceticals401730D
desechable estéril Nikon

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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