Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

Resumen

Los investigadores nuevos en el campo de la epigenética encontrarán en CUT&Tag una alternativa significativamente más fácil que los ensayos ChIP. CUT&Tag ha beneficiado enormemente a los estudios epigenéticos en poblaciones de células raras y primarias, generando datos de alta calidad a partir de muy pocas células. Este protocolo describe la realización de ensayos H3K4me1 CUT&Tag en mioblastos de ratón aislados de músculos de las extremidades posteriores de ratón.

Resumen

Este documento de protocolo tiene como objetivo proporcionar a los nuevos investigadores todos los detalles sobre el uso de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) para perfilar las ubicaciones genómicas de los factores de unión a la cromatina, las marcas de histonas y las variantes de histonas. Los protocolos CUT&Tag funcionan muy bien con mioblastos de ratón y células madre musculares (MuSC) recién aisladas. Se pueden aplicar fácilmente a muchos otros tipos de células, siempre y cuando las células puedan ser inmovilizadas por perlas de concanavalina-A. En comparación con CUT&Tag, los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) son experimentos que requieren mucho tiempo. Los ensayos ChIP requieren el tratamiento previo de la cromatina antes de que el material cromático pueda utilizarse para la inmunoprecipitación. En la reticulación de la ChIP (X-ChIP), el pretratamiento de la cromatina implica la reticulación y la sonicación para fragmentar la cromatina. En el caso de la ChIP nativa (N-ChIP), las cromatinas fragmentadas se logran normalmente por digestión de nucleasa microcócica (MNasa). Tanto la sonicación como la digestión con MNasa introducen cierto sesgo en los experimentos de ChIP. Los ensayos CUT&Tag se pueden completar en menos pasos y requieren muchas menos células en comparación con los ChIP, pero proporcionan información más imparcial sobre los factores de transcripción o las marcas de histonas en varias ubicaciones genómicas. CUT&Tag puede funcionar con tan solo 5.000 celdas. Debido a su mayor sensibilidad y menor señal de fondo que los ChIPs, los investigadores pueden esperar obtener datos de picos confiables a partir de solo varios millones de lecturas después de la secuenciación.

Introducción

El ensayo CUT&Tag se inventó para compensar algunos defectos evidentes de las ChIPs¹. Las dos principales desventajas de los ChIP son 1) el sesgo introducido al fragmentar la cromatina y 2) la incompetencia para trabajar con un número bajo de células. Los ensayos X-ChIP se basan en la sonicación o en la digestión de MNasa para obtener fragmentos de cromatina, mientras que los N-ChIP utilizan principalmente la digestión de MNasa para obtener nucleosomas. La sonicación muestra un sesgo hacia las ubicaciones relajadas de la cromatina, como las regiones promotoras², y aparentemente, la digestión de la MNasa también funciona de manera más eficiente en las fibras de cromatina relajadas. Además, algunos informaron que la digestión de MNasa también muestra un sesgo dependiente de la secuencia de ADN³. Por lo tanto, en la etapa de preparación de la entrada de los ensayos ChIP, es imposible obtener fragmentos de cromatina de todo tipo de ubicaciones genómicas de una manera perfectamente aleatoria. Además, los ensayos ChIP normalmente generan señales de fondo más altas en comparación con CUT&Tag y requieren más de 10 veces más lecturas que CUT&Tag para acentuar dónde están los picos ^1,4,5. Esto explica por qué los experimentos de ChIP tienen que comenzar con muchas más células que CUT&Tag. Esto no es un problema cuando se estudian líneas celulares, ya que se pueden pasar repetidamente para lograr un número de células muy alto. Sin embargo, el ensayo ChIP definitivamente no es una herramienta epigenética fuerte para estudiar poblaciones de células primarias raras o preciosas, aunque las células primarias obviamente tienen implicaciones más prácticas y médicas.

Si bien el largo y complicado procedimiento de ChIP desalienta a algunos investigadores a aprender o usar esta técnica, las personas se sienten más cómodas con ensayos más fáciles como la inmunocitoquímica (ICC) o la inmunofluorescencia (IF). Un ensayo CUT&Tag se asemeja esencialmente al proceso de los experimentos ICC e IF, pero solo tiene lugar en un tubo de ensayo. Para empezar, CUT&Tag no necesita cromatina fragmentada y, en cambio, el genoma debe estar intacto para la unión de^anticuerpos. En el primer día de un experimento ChIP, los investigadores normalmente pasan hasta 4 horas preparando las cromatinas fragmentadas de los núcleos con sonicación o digestión de MNasa antes de que los trozos cortos de cromatina puedan mezclarse con perlas de anticuerpos ^4,5. En notable contraste, la carga de trabajo del primer día de un procedimiento CUT&Tag consiste simplemente en inmovilizar las células a las perlas de concanavalina-A y luego agregar el anticuerpo primario a las perlas celulares. Esto solo requiere ~ 40 min¹.

Vale la pena mencionar que la escisión bajo objetivos y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa importante a CUT&Tag. CUT&RUN se estableció sobre la base de un mecanismo de trabajo similar al de CUT&Tag. En CUT&Tag, los anticuerpos guían la transposasa pA/G-Tn5 a todos los lugares donde la enzima cortará cada uno un trozo de cromatina y, mientras tanto, lo marcará con adaptadores de creación de bibliotecas, mientras que en CUT&RUN, el papel de pA/G-Tn5 lo desempeña la pA/G-MNasa que solo realiza la parte de corte del trabajo⁶. Por lo tanto, en comparación con CUT&Tag, CUT&RUN requiere un paso adicional que consiste en pegar los adaptadores de creación de bibliotecas en las piezas de ADN fragmentadas por pA/G-MNasa ^7,8. Debido a las grandes similitudes entre CUT&Tag y CUT&RUN, los investigadores familiarizados con CUT&Tag se adaptarán fácilmente a la ejecución competente de CUT&RUN. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen algunas pequeñas diferencias entre CUT&Tag y CUT&RUN. Los protocolos CUT&RUN normalmente utilizan la concentración física de sal (~150 mM) en las etapas de lavado, mientras que en CUT&Tag, el tampón de lavado 300-Dig tiene un alto contenido de sal. Por lo tanto, CUT&Tag es bueno para controlar el fondo al perfilar marcas/variantes de histonas o factores de transcripción, ya que estas proteínas se unen directa y fuertemente al ADN¹. CUT&Tag puede tener problemas al perfilar los factores asociados a la cromatina que no se unen directamente al ADN y muestran una afinidad débil con la cromatina. Los pasos de lavado con alto contenido de sal en CUT&Tag pueden eliminar los factores asociados a la cromatina y no causar señales en el resultado final. Aunque hay casos exitosos en los que CUT&Tag se puede utilizar para perfilar algunas proteínas no histonas / factores de transcripción⁹, todavía recomendamos CUT&RUN en lugar de CUT&Tag para perfilar proteínas asociadas a cromatina débilmente unidas.

Después de que los mamíferos alcanzan la edad adulta, sus tejidos musculares esqueléticos todavía contienen células madre musculares. Durante la lesión muscular, estas células madre pueden activarse y experimentar una expansión y diferenciación del número de células para regenerar^{las fibras} musculares dañadas. Estas células madre se conocen como células madre musculares/satélite (MuSC). Después de que las MuSC se aíslan de los animales o una vez activadas por una lesión muscular, comienzan a proliferar y se convierten en mioblastos.

Para obtener MuSCs a partir de la digestión del músculo esquelético de ratón, los marcadores de superficie MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 y α7-integrina (Itga7) se utilizan a menudo individualmente o en combinaciones para enriquecer MuSCs durante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)¹¹. Se ha demostrado que Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ es probablemente la mejor combinación de marcadores para obtener MuSCs¹² con una pureza del >95%. El FACS puede aislar las MuSC puras justo después de digerir los músculos frescos. Sin embargo, si el diseño experimental no requiere MuSCs puros en su aislamiento, el pre-siembra es más rentable que el FACS para obtener mioblastos >90% puros (progenie de MuSC).

Las MuSC recién aisladas de ratones no proliferan de manera eficiente en el medio F10 de Ham suplementado con suero fetal bovino (FBS). Para expandir mejor el número de células de MuSC y obtener suficientes mioblastos, se debe usar suero de crecimiento bovino (BGS) en lugar de FBS. Sin embargo, si BGS no está disponible, el medio completo F10 de Ham (que contiene aproximadamente un 20% de FBS) se puede mezclar con un volumen igual de medio condicional de células T para promover drásticamente la expansión del mioblasto¹³. Por lo tanto, este protocolo también describirá la preparación de medios MuSC condicionados por medios de células T.

Y lo que es más importante, este protocolo proporciona un ejemplo completo de la realización de ensayos CUT&Tag H3K4me1 en mioblastos de ratón aislados de los músculos de las extremidades posteriores de ratón. Tenga en cuenta que este protocolo también se aplica a otros tipos de células y marcas de histonas y variantes de histonas, y los lectores solo necesitan optimizar el número de células o las cantidades de anticuerpos para sus casos en función del enriquecimiento de las marcas o variantes de histonas específicas que estudian.

Para poder ser utilizada en CUT&Tag o CUT&RUN, la Tn5 o MNasa debe fusionarse con la proteína A o la proteína G para producir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNasa o pG-MNasa. Aparentemente, tanto la proteína A como la proteína G pueden fusionarse con estas enzimas al mismo tiempo para generar pA/G-Tn5 o pA/G-MNasa. La proteína A y la proteína G muestran afinidades diferenciales con las IgG de diferentes especies. Por lo tanto, la fusión de la proteína A y la proteína G juntas en la enzima puede superar este problema y hacer que la enzima sea compatible con anticuerpos de múltiples especies.

Protocolo

Los métodos presentados en este manuscrito están todos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Guangzhou. Los ratones utilizados para generar los resultados representativos de este manuscrito se alojaron y mantuvieron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Guangzhou.

1. Aislamiento de mioblastos de los músculos de las extremidades traseras del ratón (Ejemplo de uso de 1 ratón)

1. Diluir el ácido acético glacial con ddH₂O a 0,02 M y esterilizarlo en autoclave.
2. Diluir colágeno (de cola de rata) a 0,1 mg/mL con ácido acético 0,02 M.
3. Agregue esta solución de colágeno a las placas de cultivo para cubrir el fondo de la placa en una incubadora celular a 37 °C durante toda la noche.
4. Antes de usar, retire la solución de colágeno y lave el plato dos veces con 1x PBS. La solución de colágeno se puede reutilizar de 8 a 10 veces.
5. Sacrifica un ratón de 8 a 12 semanas. (Los ratones viejos tienen bajos rendimientos de MuSC y mioblastos).
6. Aísle y coloque todos los músculos de las extremidades traseras del ratón en un plato de 10 cm.
7. Use 1x PBS (con penicilina/estreptomicina) para enjuagar los músculos 4 veces. Después de cada enjuague, siempre transfiera los músculos a un nuevo plato.
8. Después del enjuague final, retire el PBS y pique los músculos con unas tijeras.
9. Agregue 6 mL de 1x PBS que contenga dispasa II (1.1 U/mL) y colagenasa II (830 U/mL) para digerir los músculos picados, y la digestión debería durar ~ 1.5 h.
10. Para realizar la digestión, transfiera los músculos picados a un tubo en un baño de agua a 37 °C o deje directamente los músculos picados dentro del plato y colóquelo en una incubadora de células de CO₂ a 37 °C.
11. Si usa una incubadora de células para digerir, agite el plato cada 15-30 minutos para mezclar bien la digestión.
    NOTA: La dispasa II debe elaborarse primero como caldo de 11 U/mL con medio DMEM (sin suero), y la colagenasa II debe elaborarse como caldo de 10.000 U/mL con 1x PBS.
12. Cuando se complete la digestión, use una pipeta de plástico de 10 ml para enjuagar los tejidos digeridos hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar completamente la mezcla de digestión.
13. Añadir 10 mL de medio de crecimiento MuSC/Myoblast para ralentizar la digestión. Los detalles sobre la preparación de los medios de crecimiento MuSC/Myoblast se pueden encontrar en la Sección 2.
14. Pasa la mezcla por un colador de 70 μm. Use 1x PBS para enjuagar la placa de digestión y pase este PBS a través del colador también, para recoger todas las células en la placa de digestión.
15. Centrifugar a 350 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante al vacío.
16. Vuelva a suspender el pellet de celda con 20 mL de 1x PBS y pase las células a través de un colador de 40 μm.
17. Centrifugar a 350 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante al vacío.
18. Utilice 20 mL de medio de crecimiento MuSC/Myoblast para resuspender las células y sembrar las células en una placa de plástico normal de 10 cm. Los MuSC no pueden adherirse a la parte inferior de la placa durante este tiempo y permanecerán flotando principalmente en el medio.
    NOTA: Este es el primer pre-enchapado en placas de plástico.
19. Después de 1,5 h, agite brevemente la placa y transfiera el líquido a dos platos de 10 cm recubiertos de colágeno, cada plato contiene 10 ml de cultivo. Ahora, los MuSC se adherirán y crecerán en las placas recubiertas de colágeno. Cambie el medio después de 2 días. Las placas recubiertas de colágeno se preparan como en los pasos 1-4 de esta sección.
20. Después de otro día, pase las células: Retire el medio, lave las células una vez con 1x PBS y tripsinícelas las células.
21. Utilice el medio de crecimiento MuSC/Myoblast para eliminar las células de las placas, muévalas a una nueva placa de plástico e incube en la incubadora de células durante 40 minutos.
    NOTA: Este es el segundo pre-chapado en placas de plástico.
22. Vierta el cultivo en una nueva placa de plástico e incube en la incubadora de células durante otros 20 minutos.
    NOTA: Este es el tercer pre-enchapado en placas de plástico.
23. A continuación, divida el sobrenadante de la placa en 8 placas de 10 cm recubiertas de colágeno para subcultivar las células. La proporción de pasajes aquí es 2: 8 (1: 4). Después de tres veces de pre-siembra descrita anteriormente, los mioblastos pueden alcanzar más del 90% de pureza. Por lo tanto, después de este punto, no es necesario pre-platear cuando se siguen pasando los mioblastos.

2. Preparación de medios de crecimiento MuSC/Myoblast (Ejemplo de preparación a partir de 5 ratones)

1. Sacrifique 5 ratones jóvenes y sanos de tipo salvaje, aísle el bazo y enjuague el bazo una vez con 1x PBS (con penicilina/estreptomicina).
2. Use tijeras para eliminar las partes oscuras o las manchas en el bazo, si las hay. Deseche el bazo si la mayor parte se ha vuelto negro.
3. Coloque los 5 bazos en un colador de 40 μm en la parte superior de un tubo de 50 ml.
4. Abra un paquete de jeringa estéril de 1 ml, extraiga el émbolo y deseche el cilindro.
5. En el colador de 40 μm, sostenga el tapón de goma y use el resto del pulgar del émbolo para triturar y disociar los tejidos del bazo en células individuales. Tenga cuidado de no tocar y contaminar el pulgar del émbolo al abrir el paquete de la jeringa.
6. Mientras muele el bazo, ocasionalmente use 1x PBS para lavar las células disociadas del bazo en el tubo de 50 ml debajo del colador.
7. Después de que todas las células del bazo se hayan enjuagado en el tubo de 50 ml a través del colador, centrifugue el tubo a 500 x g durante 10 minutos.
8. Utilice 1 ml de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos para resuspender el pellet. Lise los glóbulos rojos durante ~ 1 min.
   NOTA: El tampón de lisis de glóbulos rojos 10x contiene 155 mM de NH₄Cl, 10 mM de NaHCO₃ y 1 mM de sal disódica EDTA en ddH₂O. Filtre para esterilizar y no lo haga en autoclave. Diluir con ddH₂O a 1x antes de usar.
9. Llene el tubo de 50 ml con 1x PBS para detener el proceso de lisis de los glóbulos rojos.
10. Vuelva a colar la suspensión celular con un colador de 40 μm y luego centrifugue a 500 x g durante 10 min.
11. Vuelva a suspender las células con 2 mL de medio completo RPMI-1640 (medio RPMI-1640 con 10% de FBS y penicilina/estreptomicina) con un pipeteo muy suave.
12. Agregue más medios completos RPMI-1640 en el tubo y mezcle bien. Distribuya la suspensión celular en diez matraces de cultivo T75. El volumen final de cultivo en cada matraz de cultivo T75 debe ser de 20 mL.
13. Añadir 10 μL de caldo de Concanavalina-A en cada matraz de cultivo T75 y mezclar bien. La concanavalina-A activa la proliferación de las células T.
    NOTA: El stock de concanavalina-A es de 4 mg/mL y se prepara disolviendo concanavalin-A en 1x PBS. Aquí se utiliza la propia concanavalina-A, y no hay que confundirla con las perlas de concanavalina-A utilizadas posteriormente en los ensayos CUT&TAG.
14. Después de 48 h, complemente cada matraz T75 con otros 20 mL de medio completo RPMI-1640 para que el volumen total sume 40 mL.
15. Otras 24 h más tarde, recoja todo el cultivo en cada matraz T75 y centrifugue a 600 x g durante 3 min.
16. El sobrenadante es un medio condicional de células T y puede almacenarse entre -20 °C y -80 °C durante un máximo de 2 meses. Deseche los gránulos de células del bazo. Antes de usar, descongele el medio condicional de células T y esterilice aún más el medio con un filtro de 0,22 μm.
17. Para hacer el medio F10 de Ham, agregue 100 mL de FBS, 300 μL de caldo de bFGF y 6 mL de penicilina/estreptomicina en 500 mL de medio F10 de Ham.
    NOTA: el stock de bFGF es de 5 μg/mL y se prepara disolviendo bFGF en el medio F10 de Ham.
18. Mezcle el medio completo F10 del Ham con el medio condicional de células T filtradas descrito anteriormente en una proporción de 1:1 para crear el medio de crecimiento MuSC/Myobblast.

3. CUT&Tag con mioblastos (Ejemplo de 3 reacciones CUT&Tag)

1. Preparación de reactivos clave
   1. Purifique la transposasa pA/G-Tn5 internamente a partir de cultivo bacteriano utilizando el método publicado¹⁴. Esta enzima solo alcanza su forma funcional hasta que se monta con adaptadores de ADN que crean bibliotecas. Lo más importante es que pA/G-Tn5 está disponible comercialmente en muchas fuentes.
   2. Los oligonucleótidos para hacer adaptadores se muestran en la Tabla 1. En concreto, recocer Oligo-Rev con Oligo-A y Oligo-B, respectivamente, para hacer Adaptor-A y Adaptor-B de doble cadena en consecuencia. Los detalles del recocido para hacer los adaptadores se pueden encontrar en otro lugar¹⁴.
   3. Incubar el adaptador-A y el adaptador-B con transposasa pA/G-Tn5 a temperatura ambiente (RT) durante 2 h. Entonces, esta transposasa tomará su forma funcional. En las siguientes secciones de este manuscrito, la forma funcional de pA/G-Tn5 se denominará pA/G-Tn5a.
      NOTA: Si el pA/G-Tn5 se compra en lugar de fabricarse internamente, asegúrese de aclarar si el artículo comprado es pA/G-Tn5 montado con adaptadores (en otras palabras, listo para usar) o si es solo la enzima pA/G-Tn5 en sí. Si se trata solo de la enzima, prepare los dos adaptadores descritos anteriormente y móntelos en el pA/G-Tn5 antes de utilizar finalmente esta enzima para CUT&Tag.
   4. Para las recetas del tampón de encuadernación, el tampón de lavado, el tampón de lavado, el tampón de 300-Dig y el tampón de etiquetado, los lectores también pueden consultar Kaya-Okur et ^al.1.
   5. Prepare el tampón de unión, que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl₂ y 1 mM de MnCl₂.
   6. Prepare el tampón de lavado, que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,5 mM de espermidina y 1x cóctel de inhibidores de proteasa.
   7. Prepare la digitonina como un caldo concentrado en DMSO y luego prepare el tampón de lavado agregando digitonina en el tampón de lavado a una concentración de 0,5 mg / mL.
   8. Prepare el tampón de anticuerpos añadiendo EDTA a una concentración de 2 mM y BSA a una concentración del 0,1%, en el tampón Dig-wash.
   9. Prepare tampón 300-Dig que contiene 20 mM de HEPES pH 7,5, 300 mM de NaCl, 0,5 mM de espermidina, 1x cóctel de inhibidores de la proteasa y 0,1-0,5 mg/mL de digitonina.
   10. Prepare el tampón de etiquetado complementando el tampón 300-Dig con 10 mM MgCl₂. MgCl₂ puede activar la actividad enzimática de pA/G-Tn5a.
       NOTA: La información de otros materiales se proporciona en el archivo de la Tabla de Materiales .
2. Activación del cordón de concanavalina-A
   1. Mezcle 30 μL de perlas de concanavalina-A (10 μL para cada reacción) en 300 μL de tampón de unión en un tubo de centrífuga de 1,5 mL. Invierta varias veces para mezclar bien. Coloque el tubo en una rejilla magnética. Después de que el líquido esté claro, retire el sobrenadante.
   2. Retire el tubo de la rejilla magnética, agregue 300 μL de tampón de unión en el tubo, mezcle bien y divida uniformemente en 3 tubos de una tira de tubo de 8 PCR. Designe cada tubo con una reacción CUT&Tag.
   3. Coloque la tira de tubo de 8-PCR en una rejilla magnética y espere hasta que el líquido esté claro.
   4. Aspire el sobrenadante y retire los tubos de la rejilla magnética. Agregue 10 μL de tampón aglutinante en cada tubo y mezcle bien. Coloque las perlas preparadas en hielo o a 4 °C hasta que las celdas estén listas para continuar.
3. Unión de células en perlas de concanavalina-A
   1. Tripsinizar mioblastos de ratón cultivados de las placas, lavar las células una vez con RT 1x PBS y, finalmente, resuspender las células en el tampón de lavado en RT. Evite la tripsinización excesiva, ya que esto puede comprometer la afinidad de la membrana celular con las perlas de concanavalina-A.
   2. Ajuste la densidad celular a alrededor de 7 x 10⁵ células/mL en el tampón de lavado, de modo que 100 μL de suspensión celular contengan aproximadamente 70.000 células, suficientes para una reacción CUT&Tag.
   3. Pipetear 100 μL de la suspensión celular en cada tubo de la tira de tubo de 8-PCR, que ya contiene 10 μL de perlas de Concanavalin-A preparadas. Mezclar bien e incubar en un agitador de "movimiento de balancín" durante 10 minutos a RT.
   4. Coloque la tira de tubo de 8-PCR en una rejilla magnética. Espere hasta que se aclare y retire el sobrenadante.
   5. Para evaluar si las perlas de concanavalina-A han secuestrado eficientemente las células, revise el sobrenadante bajo un microscopio para ver cuántas células quedan en el sobrenadante. Después de la etapa de unión de la perla de concanavalina-A, se deben observar muy pocas o ninguna célula en el sobrenadante.
4. Incubación de las células con un anticuerpo primario
   1. Para cada muestra, diluya 1 μL de anticuerpo H3K4me1 en 50 μL de tampón de anticuerpos y agregue el anticuerpo diluido en cada tubo de muestra. Mezcle bien las perlas con el anticuerpo diluido invirtiendo los tubos varias veces. Coloque las muestras en el agitador de "movimiento de balancín" para incubar a 4 °C durante toda la noche.
      NOTA: Como mencionó el Dr. Steven Henikoff¹, no fue necesario utilizar un control negativo de IgG en todos los ensayos CUT&Tag. En comparación con los ChIP, los ensayos CUT&Tag vienen con una señal de fondo mucho más baja o nula. Por lo tanto, el uso de IgG para realizar un ensayo CUT&Tag de "control negativo" no aporta ninguna información útil. Por el contrario, el uso de un anticuerpo validado por CUT&Tag para realizar un control positivo es importante para evaluar si el ensayo CUT&Tag ha funcionado.
5. Incubación de las células con un anticuerpo secundario
   1. Al día siguiente por la mañana, coloque las muestras en el estante magnético y espere hasta que las muestras se aclaren.
   2. Retire el sobrenadante, que es el anticuerpo primario. No es necesario lavar las cuentas; Añadir directamente 50 μL de anticuerpo secundario diluido (1:100) en cada tubo de muestra.
      NOTA: El anticuerpo secundario se diluye con tampón Dig-wash en una proporción de 1:100. Para permitir un reconocimiento más eficiente de pA/G-Tn5a, los anticuerpos secundarios no deben conjugarse con ninguna molécula o grupo como HRP, biotina o fluoróforos.
   3. Mezclar bien e incubar en el agitador "balancín" a RT durante 1 h.
   4. Vuelva a colocar las muestras en la rejilla magnética, espere hasta que las muestras se aclaren y deseche el sobrenadante.
   5. Agregue 200 μL de tampón Dig-wash en cada tubo e invierta varias veces para lavar el exceso de anticuerpos.
   6. Vuelva a colocarlo en la rejilla magnética, espere hasta que se aclare y retire el sobrenadante. Repita este lavado dos veces más para eliminar por completo el exceso de anticuerpos no unidos.
6. Incubación de las células con pA/G-Tn5a
   1. Después del último lavado, coloque las muestras en la rejilla magnética, espere hasta que las muestras se aclaren y retire todo el líquido del tubo. Para cada tubo de muestra, agregue 100 μL de tampón 300-Dig que contenga pA/G-Tn5a a 0,04 μM. Mezcle bien e incube en el agitador de movimiento de balancín durante 1 h a RT.
   2. Colóquelo en el estante magnético. Espere hasta que las muestras se aclaren y retire el sobrenadante.
   3. Agregue 200 μL de tampón 300-Dig en cada muestra, mezcle bien y colóquelo en el agitador para lavar la muestra durante 3 minutos a RT.
   4. Colóquelo en el estante magnético. Espere hasta que las muestras se aclaren y retire el sobrenadante. Repita este lavado dos veces más para eliminar el exceso de pA/G-Tn5a y bajar el fondo.
7. Escisión y etiquetado de los genomas
   1. Después del último lavado, coloque las muestras en la rejilla magnética y pipetee completamente el líquido del tubo. Para cada muestra, añadir 50 μL de tampón de etiquetado. Mezclar bien e incubar en una máquina de PCR a 37 °C durante 1 h. No utilice la función de calentamiento de la tapa de la máquina de PCR.
      NOTA: Opcionalmente, debido al desgaste del material durante el siguiente paso de purificación del ADN genómico, se pueden agregar algunos ADN con picos en el búfer de etiquetado para que los picos se muestren en los resultados finales de la secuenciación y se puedan usar para normalizar los datos. El método para preparar y utilizar el ADN en espiga se puede encontrar en otro lugar¹⁴.
8. Purificación total del ADN genómico
   1. Después del etiquetado, agregue otros 150 μL de tampón de etiquetado para cada muestra. El volumen total es ahora de 200 μL.
   2. A continuación, para cada muestra, añadir 10 μL de EDTA 0,5 M, 3 μL de SDS al 10% y 2,5 μL de 20 mg/mL de proteinasa K. Vortex para mezclar bien e incubar a 55 ^°C durante 2 h.
   3. Pipetear cada muestra en 200 μL de fenol/cloroformo en un tubo de centrífuga de 1,5 mL y vórtice durante 10 s. Centrifugar a 18.000 x g durante 5 min. Transfiera la capa superior a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
   4. Añadir 200 μL de cloroformo en cada tubo y vórtice durante 10 s. Centrifugar a 18.000 x g durante 5 min.
   5. Aspire la capa superior en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Luego, para cada muestra, agregue 550 μL de etanol al 100% para precipitar el ADN a -80 °C durante 1 h. Para visualizar mejor el pellet de ADN, agregue 1 μL de 20 mg/mL de glucógeno.
   6. Centrífuga a velocidad máxima (>18.000 x g) durante 15 min para granular el ADN.
   7. Vierta con cuidado el sobrenadante, lave la pastilla de glucógeno/ADN con etanol al 75% una vez y vuelva a centrifugar a velocidad máxima durante 5 minutos.
   8. Retire el etanol al 75% y vuelva a suspender el pellet de glucógeno/ADN con 21 μL de ddH₂O.
9. Preparación y secuenciación de bibliotecas
   1. Configure la PCR que prepara la biblioteca. Para indexar las muestras que se van a secuenciar juntas, utilice un cebador N7XX Illumina diferente para cada muestra y un cebador universal N5XX Illumina. Si se indexan más de 12 muestras, también se requerirán diferentes cebadores N5XX Illumina. Illumina proporciona doce cebadores N7XX y ocho cebadores N5XX, por lo que el número total de combinaciones de N7XX con N5XX es 12 x 8 = 96. La configuración de la reacción de PCR se muestra en la Tabla 2.
   2. Determine aproximadamente el número de ciclo de PCR en la PCR de preparación para bibliotecas mediante el número de células utilizado en el ensayo CUT&Tag. Normalmente, para un ensayo CUT&Tag con 50.000-100.000 células, 9-12 ciclos son suficientes, y los números de células entre 10.000-50.000 pueden requerir hasta 14 ciclos. El programa de PCR se muestra en la Tabla 3.
      NOTA: Para la mayoría de los ensayos CUT&Tag, si el anticuerpo ha funcionado correctamente, un número de ciclo de PCR entre 9 y 14 siempre debería generar una biblioteca útil para la secuenciación. Una buena biblioteca suele tener una concentración de 10-50 ng/μL (determinada por el ensayo Qubit) y de 20-30 μL de volumen. Por el contrario, si el anticuerpo no funcionó de manera eficiente y específica, entonces el simple aumento del número de ciclos no puede salvar los experimentos. Los números de ciclo excesivos no benefician en absoluto a los resultados y, en cambio, introducen más duplicados de PCR, lo que luego complicará el análisis de los datos.
   3. Utilice algunas cuentas de purificación de ADN/selección de tamaño disponibles en el mercado para purificar el ADN de la biblioteca y seleccionar el ADN de tamaños deseables.
   4. Diluya una pequeña alícuota de la biblioteca purificada con agua y utilícela para qPCR con cebadores específicos del locus para comprobar los enriquecimientos como en los experimentos de ChIP-qPCR. Antes de secuenciar la biblioteca, esto puede ayudar a determinar si CUT&Tag ha funcionado.
   5. Realice la secuenciación y el análisis de datos según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Los kits CUT&Tag están disponibles comercialmente en un puñado de empresas, y un ejemplo se puede encontrar en el archivo de la Tabla de Materiales .

Resultados

Antes de unir las células a las perlas de concanavalina-A, verifique la suspensión celular bajo el microscopio. En consecuencia, después de incubar las células con perlas de concanavalina-A, coloque los tubos de muestra en el estante magnético y el sobrenadante debe observarse nuevamente con un microscopio. Esto es para evaluar la eficiencia con la que las células han sido capturadas por las perlas de Concanavalin-A. El tampón de lavado que contiene 7 x 10⁵ células/mL debe verse como la Figura 1A bajo el microscopio. En contraste, la Figura 1B muestra el sobrenadante después de la unión de las perlas de Concanavalin-A, donde las perlas han eliminado todas las células. No tiene sentido continuar con los siguientes pasos de CUT&Tag si las perlas de Concanavalin-A ni siquiera capturaron células de manera eficiente. El tampón de lavado no debe contener ningún contenido de suero o EDTA/EGTA, ya que pueden abolir la unión de la membrana celular a las perlas de concanavalina-A. Sin embargo, la albúmina sérica bovina no interfiere con la unión de la concanavalina-A a las células.

Después de hacer las bibliotecas CUT&Tag por PCR, una pequeña alícuota de la biblioteca (3-4 μL) se puede electroforezar en un gel de agarosa al 1,2-1,5% para probar si la biblioteca es buena. En la figura 2 se muestra el ejemplo de bibliotecas H3K4me1 CUT&Tag exitosas que creamos. En una marca de histonas o una variante de histonas CUT&Tag, la mayoría de las unidades escindidas son aparentemente mononucleosomas, aunque también se pueden cortar dos nucleosomas juntos. Tres nucleosomas cortados y marcados juntos sería muy raro. Por lo tanto, se debe observar una matriz de nucleosomas que contenga mononucleosomas, dinucleosomas y muy pocos trinucleosomas en la electroforesis de las bibliotecas CUT&Tag de marcas de histonas. Los nucleosomas contienen 147 pb de ADN, pero con los adaptadores de secuenciación añadidos por la transposasa Tn5 y la PCR de biblioteca, el tamaño total de un mononucleosoma CUT&Tagged debería ser de 300 pb, como se muestra en la Figura 2.

Antes de gastar dinero en la secuenciación de alto rendimiento de las bibliotecas CUT&Tag, otro método de control de calidad es realizar qPCR con cebadores específicos del locus. Esto es equivalente a realizar ChIP-qPCR. Además, los cebadores específicos del locus de CUT&Tag qPCR están diseñados según los mismos principios que los cebadores ChIP-qPCR. La Figura 3 muestra la amplificación por qPCR de diferentes ubicaciones en el locus del gen Myod1. Myod1 codifica el factor de transcripción maestro, MyoD, que determina el linaje del músculo esquelético durante la miogénesis¹⁵. Como se muestra en la Figura 3, H3K4me1 está altamente enriquecido en el potenciador del núcleo (CER) y la región reguladora distal (DRR) del locus Myod1. CER y DRR son regiones potenciadoras muy bien establecidas para Myod1¹⁶. Esto es consistente con el fenotipo bien documentado de que H3K4me1 marca específicamente a los potenciadores comisionados¹⁷. Además, la Figura 3 muestra que el nivel de H3K4me1 es muy bajo en la región reguladora proximal (PRR) porque los nucleosomas en la región proximal de los promotores activos normalmente se modifican con H3K4me3¹⁸ en lugar de H3K4me1. Todos los pares de cebadores para estos loci evaluados fueron publicados previamente^19,20, y las secuencias se pueden encontrar en la Tabla 4. Normalmente, después de los controles de calidad mediante electroforesis de ADN de biblioteca y qPCR en loci específicos, los investigadores estarán seguros de proceder con la secuenciación.

Figura 1: Mioblastos resuspendidos en tampón de lavado. Vistas microscópicas tomadas (A) antes y (B) después de la unión de las cuentas de Concanavalin-A. El panel B muestra que casi no quedan células en la suspensión después de la incubación de las perlas de concanavalina-A, lo que indica que las células han sido capturadas eficientemente por las perlas. Es probable que las partículas pequeñas en el panel B sean las perlas excesivas de concanavalina-A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Electroforesis de librerías CUT&Tag. Se han realizado tres ensayos CUT&Tag H3K4me1 independientes, y cada uno se ha convertido en una biblioteca de secuenciación utilizando cebadores Illumina y PCR. Cada H3K4me1 CUT&Tag utilizó 70.000 mioblastos de ratón. La mayoría de las bibliotecas contienen mononucleosomas marcados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: amplificación por qPCR de diferentes localizaciones en el locus del gen Myod1 . La qPCR muestra que en los mioblastos de ratón, la marca H3K4me1 está altamente enriquecida en las regiones potenciadoras del gen Myod1 , lo que se alinea con las conclusiones publicadas. CER y DRR son potenciadores publicados de Myod1 que se encuentran aguas arriba del promotor de Myod1 . Tenga en cuenta que el PRR no tiene acumulación de H3K4me1, y esto también es consistente con el hecho de que los promotores activos están marcados principalmente con H3K4me3. Los enriquecimientos se calcularon normalizando al enriquecimiento de H3K4me1 en el "desierto de genes" de la muestra "Repeat 1". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre	Secuencias (5'-3'):
Oligo-Rev	phos-CTGTCTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

Tabla 1: Secuencias de oligonucleótidos para hacer el Adaptador-A y el Adaptador-B para montarlos en la transposasa pA/G-Tn5.

Fracción	Volumen
ADN genómico purificado después de la reacción CUT&Tag	21 μL
Imprimación N5XX (10 μM)	2 μL
Imprimación N7XX (10 μM)	2 μL
NEBNext Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad 2×	25 μL
	Total 50 μL

Tabla 2: Configuración de PCR para la preparación de la biblioteca CUT&Tag utilizando cebadores de indexación Illumina. Si utiliza un kit comercial CUT&Tag que contiene reactivos de PCR de biblioteca, como una mezcla de ADN polimerasa, siga el manual específico de ese kit para configurar la PCR de biblioteca.

Paso	Temperatura	Hora	Número de ciclo
1	72 oC	3 minutos	1
2	95 oC	3 minutos	1
3	98 oC	10 s	De 9 a 14
4	60 oC	5 s y, a continuación, vaya al paso 3
5	72 oC	1 minuto	1
6	4 oC	sostener	N/A

Tabla 3: Programa de PCR para la preparación de la biblioteca CUT&Tag utilizando cebadores de indexación Illumina.

Ubicación	Secuencias de cebadores (5'-3')
CER	Para: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	Para: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Rev: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	Para: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Rev: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
RRD	Para: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Rev: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	Para: ETIQUETA MORDAZA ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1	Para: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Rev: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2	Para: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Rev: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
Potenciador de IgH	Para: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Rev: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Desierto genético	Para: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Tabla 4: Cebadores específicos de locus para probar el enriquecimiento de H3K4me1 en diferentes ubicaciones del gen Myod1 .

Discusión

El número de células específico requerido en una determinada reacción CUT&Tag depende completamente del enriquecimiento de las marcas/variantes de histonas o proteínas de unión a la cromatina que se van a analizar. Normalmente, para marcas de histonas muy enriquecidas como H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac, etcétera, 25.000-50.000 mioblastos son suficientes para una reacción CUT&Tag. Sin embargo, algunas proteínas raras de unión a la cromatina pueden requerir hasta 250.000 células. El número de células utilizado en los ensayos CUT&Tag es crítico, lo que, si no se maneja bien, normalmente provoca el fracaso del ensayo. El uso de un número excesivo de células en una reacción CUT&Tag es perjudicial, especialmente cuando se analizan marcas de histonas muy enriquecidas. Comenzar con demasiadas células significa que no se asignan suficientes anticuerpos para cada célula. CUT&Tag no solo funciona con números de celda muy bajos, sino que también se puede aplicar a nivel de celda^{única 1}.

Sobre todo, el uso de un anticuerpo fiable y validado con alta afinidad y especificidad es siempre la clave para el éxito de un ensayo CUT&Tag. Al igual que los ensayos ChIP, inmunoprecipitación (IP) e IF, CUT&Tag también requiere el tipo de anticuerpos que pueden reconocer los^antígenos plegados de forma natural. Por el contrario, los anticuerpos que solo reconocen péptidos relajados en Western blot deben evitarse estrictamente en el CUT&Tag.

Si la optimización del número de células o el uso de un anticuerpo validado por inmunofluorescencia o bien citado aún no puede resolver el problema de la mala señal en un ensayo CUT&Tag, entonces analice si la proteína de interés es una proteína asociada a la cromatina que se une débilmente o ni siquiera se une directamente al ADN. En este caso, como se mencionó anteriormente, cambie a usar CUT&RUN en lugar de CUT&Tag. Alternativamente, una fijación ligera, como 5 minutos en paraformaldehído al 0,5% (seguido de 10 minutos de enfriamiento en glicina al 0,1 M), podría ser un método que valga la pena probar. Sin embargo, como nunca hemos practicado la fijación en ningún ensayo CUT&Tag, ni siquiera nos hemos encontrado con la necesidad de fijar las células antes de realizar CUT&Tag, no podemos hacer más comentarios sobre la reticulación.

Entendemos que algunas versiones de los protocolos CUT&Tag podrían afirmar que tanto la RT (2 h) como la 4 °C (durante la noche) para la etapa de incubación primaria de anticuerpos pueden generar resultados decentes²¹. Sin embargo, recomendamos encarecidamente utilizar 4 °C (durante la noche) en lugar de RT durante 2 h. Por otro lado, tampoco se recomienda prolongar el tiempo de incubación más de una noche.

En cuanto a la sensibilidad, el control de fondo y el grado de complejidad que los investigadores deben manejar, CUT&Tag es superior a los ensayos ChIP. Si hay que poner algunos inconvenientes para CUT&Tag en comparación con ChIP, entonces el único es que los protocolos CUT&Tag no incluyen un método de normalización interna como el uso de "Input" en un ensayo ChIP¹. Por lo tanto, al comparar las alturas de los picos entre muestras utilizando CUT&Tag, los investigadores deben igualar el número de celdas entre las muestras para empezar. Además, es fundamental incluir réplicas técnicas.

Este protocolo presenta todos los detalles de la realización de CUT&Tag en mioblastos de ratón proporcionando un ejemplo exitoso de H3K4me1 CUT&Tag en este tipo de célula. El método descrito aquí se puede aplicar directamente a los MuSC recién aislados sin ninguna modificación. Además, los experimentos CUT&Tag sobre marcas de histonas, variantes de histonas o factores de transcripción en otros tipos de células también se pueden llevar a cabo siguiendo este protocolo. En el caso de los miotubos o miofibras, primero se pueden aislar los núcleos y luego se puede llevar a cabo CUT&Tag en los mionúcleos. Al hacer esto, se pueden tratar los núcleos de la misma manera que se tratan las células en este protocolo CUT&Tag. Los miotubos y las miofibras son células multinucleadas, y no hemos probado si los miotubos o las miofibras se pueden unir directamente a las perlas de concanavalina-A, aunque esto podría ser factible.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Colágeno	Corning	354236
Colagenasa II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Perlas de Concanavalin-A	Bangs Laboratories	BP531
Digitonina	Sigma-Aldrich	300410
Dispasa II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Suero fetal bovino	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 anticuerpo	abcam	ab8895
Medios de radioaficionado F10	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hiperactivo Universal CUT& Kit de ensayo de etiquetas para Illumina	Vazyme	TD903	Este kit ha sido probado por nosotros para funcionar bien
Rack magnético para tubos EP de 1,5 mL	Qualityard	QYM06
Rack magnético para tiras de tubos de 8-PCR	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Para la reacción de PCR de fabricación de bibliotecas
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Debe montarse con adaptadores antes de usar
Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinasa K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 medios	Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Anticuerpo secundario (cobaya anti-conejo IgG)	Anticuerpos en línea	ABIN101961
Espermidina	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 para Illumina	Vazyme	TD202	Este kit proporciona imprimaciones Illumina N7XX y N5XX
VAHTS ADN Cuentas Limpias	Vazyme	N411	Puede sustituir a las perlas Ampure XP. Puede purificar CUT& Etiquete las bibliotecas y seleccione los fragmentos de ADN por tamaño