Un sistema versátil de frascos de vidrio para el perfilado de exudado de raíces semihidropónico

Dentro de suelos densamente poblados, la rizosfera presenta un nicho rico en carbono. Está formado por las raíces de las plantas a través de la exudación de hasta un 20% de carbono asimilado y alberga comunidades microbianas que son distintas del microbioma residente del suelo 1,2,3,4,5,6. A medida que los investigadores están aprovechando las funciones beneficiosas de los microbios asociados a las raíces y el potencial para la agricultura sostenible^{que lo} acompaña, esta observación, a menudo denominada efecto rizosfera, ha sido el foco de crecientes esfuerzos científicos. Sin embargo, hasta ahora, el diálogo químico entre microorganismos y plantas, que se propone como el impulsor del efecto rizosfera, sigue siendo poco conocido y, por lo tanto, la comprensión mecanicista para el desarrollo de soluciones microbianas confiables en la agricultura es limitada ^8,9,10.

Descifrar los exudados de las raíces en ambientes de suelo donde los metabolitos son fácilmente absorbidos por las partículas del suelo y rápidamente renovados por las comunidades microbianas no es sencillo, especialmente para las especies de plantas con sistemas de raíces finas, como la planta modelo Arabidopsis thaliana¹¹. Esta es la razón por la que, en la mayoría de los estudios, los exudados de las raíces se muestrean de sistemas hidropónicos. En estos microcosmos, las partes aéreas de las plantas se mantienen en su lugar mediante soportes de plantas personalizados o materiales más discretos como malla, agar y perlas de vidrio. Los contenedores utilizados van desde placas de Petri hasta placas de pocillos múltiples hasta varias cajas personalizadas y comerciales con o sin filtros de aireación 12,13,14,15,16,17,18,19. Dependiendo del sistema, las condiciones de crecimiento de las plantas variarán mucho y reflejarán las condiciones naturales en mayor o menor medida.

Aquí, presentamos un sistema semihidropónico a base de vidrio que es experimentalmente susceptible y produce resultados altamente reproducibles. Es fácil de ensamblar y usar y se basa en materiales comúnmente disponibles. El sistema se basa en un frasco de vidrio lleno de perlas de vidrio, aprovechando la naturaleza reutilizable y las propiedades de baja ligereza de la cristalería (Figura 1). Las perlas proporcionan soporte físico para la planta en crecimiento y simulan la impedancia mecánica, lo que contribuye a una arquitectura radicular más parecida a la del suelo en comparación con las configuraciones hidropónicas 19,20,21. Si se inoculan con microbios, las perlas de vidrio presentan superficies a las que se adhieren las bacterias.

El frasco de vidrio se puede cerrar para mantener la esterilidad y el sistema está diseñado para permitir suficiente espacio libre y circulación de aire, evitando un ambiente saturado de humedad. Los frascos son adecuados para el crecimiento prolongado de diferentes especies de plantas y se pueden escalar hacia arriba y hacia abajo utilizando frascos de diferentes tamaños. Aquí se muestran las aplicaciones de seis especies de plantas, que abarcan gramíneas C3 y C4, dicotiledóneas y leguminosas. Entre ellas se encuentran las especies modelo A. thaliana (dicotiledónea), Brachypodium distachyon (monocotiledónea C3), Medicago truncatula (leguminosa), así como especies de cultivos como Solanum lycopersicum (tomate, dicotiledónea), Triticum aestivum (trigo, monocotiledónea C3) y Sorghum bicolor (sorgo, monocotiledónea C4). El protocolo presentado incluye la configuración experimental del sistema, la esterilización de semillas y la germinación de seis especies de plantas, el trasplante de plántulas a frascos, diferentes medios de crecimiento, la inoculación de microbios, el muestreo de exudado de raíces y el procesamiento de exudado para análisis.

1. Preparación de plántulas: Esterilización superficial de semillas

NOTA: La esterilización de la superficie de las semillas y todos los pasos siguientes deben realizarse en condiciones estériles, a menos que se indique lo contrario. Los pasos 1.1 a 1.4 son específicos para la esterilización superficial de semillas de A. thaliana . Otras especies de plantas tienen variaciones alternativas en el tamaño del tubo (dependiendo del número de semillas y el tamaño de la semilla), el tiempo en las soluciones y las soluciones de esterilización (Tabla 1).

1. Agregue las semillas a un tubo de microcentrífuga (máximo 20 mg de semillas) y cubra las semillas con etanol al 70%.
   PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable. No lo use cerca de llamas abiertas.
2. Mueva los tubos cerrados de la microcentrífuga a una coctelera durante 15 minutos y ajuste la rotación de modo que las semillas se agiten suavemente.
3. Retire con cuidado el etanol al 70% con una pipeta y reemplácelo con etanol al 100%. Repita el paso 1.2.
4. Retire el etanol al 100% y seque las semillas dejando las tapas de los tubos de microcentrífuga abiertas en un flujo de aire estéril.
5. Una vez que las semillas estén secas, extiéndalas uniformemente en un medio Murashige and Skoog (MS) 0,5x con fito agar al 0,7% moviendo el tubo o usando pinzas estériles. Cierre las placas de agar y séllelas con cinta de microporos de 1,25 cm.
6. Coloque las placas horizontalmente en un estante de la cámara de crecimiento (16 h luz/8 h oscuridad, 22 °C día/18 °C noche, 150-160 μmol ^{m-2 s-1}).

2. Preparación de plántulas: Transferencia de semillas germinadas a platos frescos

NOTA: Los siguientes pasos son específicos para A. thaliana y no son necesarios para otras especies.

1. Después de la germinación, transfiera de 5 a 6 plántulas a nuevas placas de fito agar al 0,7% con medio MS 0,5x colocando las plántulas linealmente, aproximadamente a 3 cm de la parte superior (vea la posición de la roseta en la Figura 2D).
2. Selle las placas de agar con cinta de microporos de 1,25 cm y crezca verticalmente en la cámara de crecimiento (Figura 2D) hasta que las plántulas estén listas para ser transferidas a frascos a los 15-18 días después de la germinación (Tabla 2).

3. Preparación del sistema hidropónico: configuración del frasco

1. Agregue 150 ml de perlas de vidrio limpias de 5 mm a cada frasco limpio y cierre con la tapa (Figura 1A).
   NOTA: En este protocolo, las cuentas de vidrio de 5 mm son adecuadas para la mayoría de las especies²², pero el tamaño de la cuenta se puede ajustar si se desea.
2. Coloque suficiente papel de aluminio sobre los frascos cerrados para cubrir la unión de la tapa al frasco y el autoclave (121 °C durante 20 min) (Figura 1B).
3. Mantenga los frascos preparados tapados hasta que las plantas estén listas para ser transferidas (Tabla 2).

4. Preparación del sistema hidropónico: Adición de plántulas

1. Cuando las plántulas estén listas para ser transferidas a frascos (Tabla 2), retire el papel de aluminio y las tapas de los frascos en el banco estéril.
2. Si los frascos se van a inocular con bacterias, realice los siguientes pasos antes de pasar al paso 4.3; de lo contrario, omita el paso 4.2.
   1. Utilizando un asa de inoculación estéril, recoja colonias individuales de cultivos bacterianos puros en placas de agar y suspenda en 750 μL de MgCl estéril de 10 mM₂. Repita hasta que la solución esté turbia.
   2. Opcional: Lavar la suspensión 3 veces con 750 μL de MgCl_estéril de 10 mM 2 por centrifugación de 5 min a 1.000 × g y temperatura ambiente, seguido de la eliminación del sobrenadante y la resuspensión del pellet en 750 μL de 10 mM MgCl₂.
   3. Opcional: Si se inoculan varias especies bacterianas diferentes, mezcle las suspensiones de cepas individuales preparadas en los pasos 4.2.1-4.2.2 en proporciones iguales antes de continuar.
   4. Ajuste la densidad óptica en la longitud de onda de 600 nm (OD₆₀₀) a 0,2-0,4 en un medio MS de 0,5x (pH de 5,7 a 5,9, ajustado con KOH) u otro medio de crecimiento de elección (consulte el paso 4.3). Mida de nuevo el OD₆₀₀ para comprobar si la solución se ha diluido correctamente.
      PRECAUCIÓN: El KOH es corrosivo; Use guantes y bata de laboratorio.
   5. Diluir la suspensión hasta OD₆₀₀ 0,002-0,004 en el mismo medio (dilución 1:100).
      NOTA: Las densidades celulares finales dependerán de la cepa bacteriana utilizada, pero en nuestra experiencia, este inóculo corresponde aproximadamente a 3-6 × 10⁵ células ^mL-1.
   6. Agregue 35 ml de la dilución final por frasco. Agregue 35 ml de medio de crecimiento estéril a los frascos de control. Revuelva las cuentas para cubrir uniformemente con medios MS 0.5x antes de transferir la planta para que las raíces no se sequen. Continúe con el paso 4.4.
3. Agregue 35 ml de medio MS 0.5x a cada frasco (pH 5.7 a 5.9, ajuste con KOH). Revuelva las perlas para cubrir uniformemente con medios MS 0.5x antes de transferir la planta para que las raíces no se sequen.
   NOTA: El medio de cultivo puede modificarse, por ejemplo, mediante la eliminación de nutrientes, la adición de osmolitos para inducir estrés salino o el uso de diferentes valores de pH o medios de crecimiento. PRECAUCIÓN: El KOH es corrosivo; Use guantes y bata de laboratorio.
4. Coloque de 3 a 5 plantas de A. thaliana en un frasco colocando los sistemas de raíces entre las cuentas de vidrio.
   NOTA: El número de plantas por frasco es diferente para otras especies (Tabla 2).
5. Mueva las cuentas con pinzas o cucharas estériles para cubrir las raíces y levante las hojas del medio (Figura 1C).
   NOTA: Mueva con cuidado las plantas y las cuentas para evitar romper las raíces y estresar las plantas.
6. Agregue 2 tiras de cinta de microporos de 1,25 cm en la parte superior de los frascos y coloque suavemente la tapa en la parte superior (Figura 1D-F).
   NOTA: No presione la tapa hacia abajo para evitar obstruir el intercambio de aire.
7. Cubra el espacio entre la tapa y el frasco con cinta de microporos de 2,5 cm para mantener la esterilidad y permitir el intercambio de aire, y coloque los frascos en una cámara de crecimiento (Figura 1G, H).
8. Coloque de 4 a 8 frascos por condición experimental, dependiendo de la cuestión biológica y la variabilidad esperada.
9. Asegúrese de incluir controles biológicos negativos (por ejemplo, frascos sin plantas) para tener en cuenta el fondo de metabolitos del sistema experimental. Establezca el mismo número de réplicas para los controles negativos que para los tratamientos experimentales (p. ej., cuadruplicados).
10. Para períodos de crecimiento prolongados, reemplace el medio de crecimiento semanalmente: retire el resto del medio de crecimiento con una pipeta volumétrica de 25 ml y agregue 35 ml de medio fresco.

5. Recolección de exudados radiculares

1. Cuando las plantas alcancen la edad deseada, retire la cinta de microporos de 2,5 cm y la tapa en el banco estéril.
   NOTA: Para A. thaliana en nuestras condiciones de crecimiento, 21 días después de la germinación representa una etapa vegetativa madura antes del inicio de la floración. La etapa de desarrollo vegetativo es específica de la especie vegetal, y el momento del período de crecimiento cambia con las especies vegetales; Este tiempo puede modificarse dependiendo de la pregunta de investigación.
2. Para las pruebas de esterilidad, alícuota 20 μL de medio de crecimiento y pipetear en placas de agar LB.
   1. En el caso de los frascos inoculados, alícuota 100 μL de medio de crecimiento para utilizar en los recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) (p. ej., en una serie de diluciones²³).
      NOTA: En nuestra experiencia, las densidades bacterianas oscilan entre 10^{5-10 8} células vivas ^mL-1 del medio de crecimiento.
3. Retire la mayor cantidad posible de medio de cultivo con una pipeta volumétrica de 25 ml, evitando dañar las raíces.
4. Agregue 50 ml de medio de recolección (por ejemplo, 20 mM de acetato de amonio; pH 5.7-5.9 ajustado con HCl) pipeteando a lo largo de las paredes del frasco para evitar mojar las hojas. Cerrar los frascos con tapa e incubarlos en condiciones estériles durante el tiempo deseado de recolección del exudado. Para experimentos urgentes, 2 h es una buena ventana de recolección.
   PRECAUCIÓN: El HCl es corrosivo; Use guantes y bata de laboratorio. Para tiempos de recolección de exudado de raíces más largos, envuelva las tapas nuevamente con cinta adhesiva y mueva los frascos a la cámara de crecimiento.
5. Después de 2 h, retire la cantidad deseada de medios de recolección en tubos (p. ej., 50 ml para ensayos o análisis con exudados concentrados, o 2 ml para uso directo). Almacenar los exudados de raíz recogidos a -80 °C hasta su posterior procesamiento o análisis.
   1. Cuando se trabaja con frascos inoculados, centrifugar los exudados recolectados durante 10 min a 5.000 × g y 4 °C y utilizar solo sobrenadantes para el análisis. Alternativamente, filtre y esterilice los exudados con un filtro de 0,22 μm o 0,45 μm.
6. Si el experimento forma parte de una serie temporal, retire todo el medio de recolección restante de los frascos y agregue 35 ml de medio MS 0.5x. Vuelva a colocar la tapa y la cinta adhesiva de 2,5 cm antes de devolver los frascos a la cámara de crecimiento.
7. Mida el peso fresco de la raíz y el brote de todas las plantas en un frasco para luego normalizar los exudados de las raíces por el peso de la planta.
   NOTA: Los tejidos vegetales se pueden muestrear además si se desea.

6. Procesamiento de exudados de raíz para espectrometría de masas

1. Dependiendo del método analítico, liofilizar los exudados de la raíz para concentrarlos y eliminar el medio de recolección (-80 °C a 0,37 mbar hasta que no haya líquido). Almacenar a -80 °C hasta que esté listo para analizar.
   NOTA: Los datos presentados aquí se generaron con un análisis TOF-MS de inyección de flujo en un instrumento de tiempo de vuelo cuadrupolar de masa precisa.
2. Antes de la inyección en el instrumento analítico, reconstituya los exudados liofilizados o diluya los exudados de raíz sin procesar con el medio de recolección de acuerdo con el peso fresco de la raíz.
   NOTA: El medio de recolección se eligió para que fuera compatible con el espectrómetro de masas. Sin embargo, dependiendo del método analítico, pueden ser necesarios pasos de desalinización antes de la inyección.

El sistema experimental aquí presentado permite el control de los factores experimentales y ambientales que alteran los perfiles de exudación radicular. Comparamos el crecimiento de A. thaliana bajo diferentes condiciones de iluminación, edad de planta y densidades de plantas en dos laboratorios diferentes (Figura 3). Las plantas se veían sanas en todos los laboratorios (Figura 3A, B). Las condiciones de día corto (luces de 10 h frente a luz de 16 h, Figura 3) dieron como resultado una mayor masa radicular en comparación con las condiciones de día largo (Figura 3C, D). De manera similar, la masa radicular total de todas las plantas cultivadas en condiciones de día largo fue menor que en condiciones de día corto (Figura 3C). En general, la variabilidad del crecimiento dentro y entre frascos fue baja en todos los laboratorios.

El sistema de frascos de vidrio es compatible con una variedad de especies de plantas y etapas de desarrollo. El criterio de valoración para el análisis del exudado radicular suele ser de 21 días, ya que en nuestras condiciones experimentales, muchas especies de plantas se encuentran en una etapa vegetativa madura antes de pasar a la etapa reproductiva (Figura 4A-E). Las plantas se pueden retirar fácilmente del sistema experimental sin daños visibles en el sistema radicular. Por lo tanto, determinar el peso de los tejidos o utilizar los tejidos para el análisis posterior es sencillo. Los mayores pesos de los brotes se encontraron para el trigo, seguido del sorgo y el tomate. Los pesos de raíz más altos se encontraron para el sorgo, seguido por el trigo y M. truncatula. La relación raíz:brote difiere entre especies. En general, el peso de los tejidos varió entre 100 mg y 800 mg.

Un aspecto central de los sistemas experimentales que permiten la recolección de exudado radicular es la inoculación controlada con microbios para estudiar las interacciones planta-microbio en un ambiente definido. El sistema experimental presentado puede mantenerse estéril incluso con una manipulación repetida (véase la condición de "control" en la Figura 5), y las bacterias pueden añadirse y mantenerse durante períodos prolongados. Cuando se inocularon plantas de A. thaliana de 33 días de edad con una mezcla de bacterias comensales a DO600 0,004, las bacterias persistieron durante 12 días, que fue la duración completa del experimento (Figura 5). Las unidades formadoras de colonias incluso aumentaron 100 veces en el medio de crecimiento y también colonizaron las raíces (Figura 5C). Los fenotipos de las plantas inoculadas fueron indistinguibles de los de las plantas estériles (Figura 5A,B).

El sistema experimental presentado permite la recolección de exudado en muchas condiciones experimentales. Aquí, presentamos los perfiles de exudación de A. thaliana Col-0 recolectados en acetato de amonio o en agua de las mismas plantas consecutivamente (Figura 6A). Los exudados se almacenaron a -80 °C hasta el análisis, se normalizaron por el peso de la raíz y se analizaron por espectrometría de masas. Las muestras de frascos que contenían plantas se filtraron contra controles experimentales (frascos sin plantas). De los 2.163 metabolitos, 436 mostraron una señal por encima del fondo (20,16%) y se conservaron para su análisis. De estos, 416 o el 95% de los compuestos mostraron una clara abundancia entre las condiciones experimentales. Sin embargo, 26 metabolitos no pudieron atribuirse a ningún tipo de compuesto y, por lo tanto, no están definidos. La mayoría de los metabolitos (406 o 98%) fueron más abundantes en los exudados recolectados en agua. La acumulación consecutiva de exudados, primero en acetato de amonio y luego en agua, podría afectar el perfil de exudación, ya que las señales metabólicas podrían diluirse con el tiempo. Sin embargo, la señal de exudación casi exclusivamente más alta en el agua recolectada como segundo punto de tiempo no apoya esta hipótesis: la recolección de exudado en agua pura probablemente crea un choque osmótico para las plantas, lo que causa el aumento de la abundancia de metabolitos en comparación con un solvente de recolección equivalente a la solución de crecimiento (20 mM de acetato de amonio es equimolar a 0.5x medio MS). La investigación de las clases químicas de los compuestos identificados en ambas condiciones de crecimiento mostró que la mayoría de los compuestos son ácidos orgánicos y derivados (28,6%), seguidos de compuestos orgánicos de oxígeno (18%), compuestos organoheterocíclicos (14,2%) y lípidos (13,2%). Solo un pequeño subconjunto de metabolitos pertenece a fenilpropanoides y policétidos (8,7%) y bencenoides, (6%). Los compuestos orgánicos nitrogenados, nucleósidos, compuestos organosulfurados, alcaloides, lignanos y compuestos relacionados representan entre el 2% y el 0,5% de los compuestos clasificados (Figura 6B). La distribución de los metabolitos aquí representada corresponde a datos ya publicados utilizando otros tipos de sistemas de recolección de exudados radiculares24.

Figura 1: Configuración del frasco de vidrio. (A) Frasco con cuentas de vidrio. (B) Frasco con cuentas de vidrio listo para ser esterilizado en autoclave. (C) Plántulas en frascos (vista superior). (D) Plántulas en un frasco (vista superior) con cinta de microporos de 1,25 cm. (E) Plántulas en frascos (vista lateral) con cinta de microporos de 1,25 cm. (F) Plántulas en frascos (vista lateral) con cinta de microporos de 1,25 cm y tapa. (G) Completa la configuración del frasco con plántulas en frascos (vista lateral) con cinta de microporos de 1,25 cm, tapa y cinta de microporos de 2,5 cm. (H) Configuración completa del frasco (vista superior). (I) Plantas de 21 días de edad y listas para la cosecha (vista superior). Tamaño del frasco 147 mm de altura x 100 mm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Plántulas esterilizadas en superficie en placas de agar mediano Murashige y Skoog 0,5x en una cámara de crecimiento. (A) Arabidopsis thaliana (6 días de edad), (B) Brachypodium distachyon (6 días de edad), (C) Medicago truncatula (6 días de edad), (D) A. thaliana (18 días de edad). Placa de agar tamaño 120 mm x 120 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Plantas de Arabidopsis thaliana Col-0 cultivadas en frascos en condiciones de luz de día corto y largo. (A) Frasco con tres plantas de 33 días cultivadas en condiciones de día corto (10 h de luz/14 h de oscuridad, 220 μmol m-2 s-1 de intensidad de luz, 21 °C de día/18 °C de noche) y (B) frasco con cinco plantas de 21 días de edad cultivadas en condiciones de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad, 150-160 μmol m-2 s-1 intensidad lumínica, 22 °C día/18 °C noche). Peso de la raíz de (C) todas las plantas de un frasco y (D) de plantas individuales. ** representan los valores de significación de la prueba t (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cinco especies filogenéticamente distintas en el día 21 en la configuración del sistema de frasco de vidrio estéril. (A) monocotiledónea modelo Brachypodium distachyon, (B) leguminosa modelo Medicago truncatula, (C) dicotiledónea Solanum lycopersicum (tomate), (D) dicotiledónea Sorghum bicolor, (E) monocotiledónea Triticum aestivum (trigo). (F) Peso fresco de raíces y brotes de las especies cultivadas en frascos de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 días de edad) cultivada en condiciones de días cortos. (A) En un entorno estéril o (B) inoculado durante 12 días con un consorcio de bacterias comensales. (C) Unidades formadoras de colonias para frascos estériles (control) e inoculados del sustrato de crecimiento (izquierda) y de la raíz (derecha). N = 4 frascos para la condición de control estéril y n = 8 frascos para la condición inoculada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Perfiles distintos de exudado radicular para A. thaliana Col-0 de 21 días de edad. Los exudados se recogieron durante 2 h en acetato de amonio estéril de 20 mM (pH 5,7) seguido de 2 h en agua desionizada filtrada estéril. Los metabolitos se detectaron mediante espectrometría de masas mediante inyección directa. (A) Análisis de componentes principales de 436 metabolitos detectados por encima del nivel de fondo (comparación de frascos con plantas frente a frascos sin plantas). PC: componente principal con la cantidad de varianza explicada. Azul: exudados recogidos en agua, amarillo: exudados recogidos en acetato de amonio. (B) Gráfico circular de 416 metabolitos significativamente diferentes entre condiciones experimentales (prueba de Tukey) coloreado según la superclase (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Métodos de esterilización de semillas superficiales para múltiples especies. * Lavado 4-5 veces con agua desionizada filtrada entre etanol y lejía y al final; Unaincubación durante 3-6 h después de la lejía, reemplazando con agua desionizada filtrada cada 30 min.

Tabla 2: Edad de las plántulas en días para su transferencia a frascos y número de plantas por frasco para varias especies de plantas.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.