Generación de una línea celular RIP1 knockout U937 utilizando el sistema CRISPR-Cas9

Summary

A medida que los protocolos relacionados con CRISPR se vuelven cada vez más útiles y accesibles, aún pueden surgir complicaciones y obstáculos en condiciones experimentales específicas. Este protocolo describe la creación de una línea celular humana knockout de serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK1/RIP1) que interactúa con el receptor utilizando CRISPR/Cas9 y destaca los posibles desafíos encontrados durante este proceso.

Abstract

Este protocolo describe un procedimiento para eliminar el gen RIP1 utilizando CRISPR/Cas9 en la línea celular de monocitos humanos U937. El método utiliza plásmidos de ARN guía designados y plásmidos de empaquetamiento lentiviral para lograr la eliminación del gen RIP1. El protocolo aborda los desafíos y las mejoras de los métodos tradicionales de CRISPR, lo que permite su replicación para futuros estudios de muerte celular. Las células mutantes resultantes se pueden utilizar para investigar cambios mecanicistas en la muerte celular, donde las proteínas RIP1 funcionales desempeñarían un papel. Los ensayos de viabilidad demostraron una reducción significativa de la muerte celular en las células knockout después de la inducción de la necroptosis. La microscopía de fluorescencia reveló una marcada disminución de las especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales en las células knockout en las mismas condiciones. En conjunto, estos ensayos funcionales confirman la pérdida de la proteína RIP1. Optimizado para su uso con monocitos humanos U937, este procedimiento también puede adaptarse para dirigirse a otros reguladores clave de la muerte celular, produciendo mutantes funcionales y no letales. Los posibles escollos se abordan a lo largo de todo el libro para proporcionar información sobre los desafíos que pueden surgir durante la generación de mutantes.

Introduction

El uso de la tecnología de edición genética CRISPR/Cas9 ha evolucionado rápidamente desde su descubrimiento ^1,2,3. La capacidad de knock-in o knock-out genes dentro de líneas celulares o bacterias es invaluable para avanzar en la investigación y la comprensión de los mecanismos intracelulares 1,2,3,4,5,6. El sistema CRISPR-Cas9 mejora los métodos....

Protocol

En la Figura 1 se proporciona una representación esquemática del procedimiento. El ARN guía (ARNg) y la secuencia diana se indican en la Tabla 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recolección de vector de expresión lentiviral de ARNg CRISPR dirigido a RIP1 que contiene endonucleasa Cas9 y resistencia a la puromicina de Escherichia coli

1. E . coli de raya cuadrante que alberga ARNg vectorial lentiviralen placas de agar LB suplementadas con 100 μg/mL de ampic....

Results

Tras la producción de una población confluente de células U937 con mutación RIP1 CRISPR, se realizaron análisis SDS-PAGE y Western blot. El análisis de Western blot se utilizó para determinar la creación exitosa de una línea celular mutante RIP1 CRISPR mediante la evaluación de la pérdida de los niveles de expresión de la proteína RIP1. Esta determinación se realizó con base en el resultado comparativo de monocitos WT U937 y células NTC. En la Figura 2, no se detectó la exp.......

Discussion

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones detalladas y análisis de posibles trampas en la eficiencia y confiabilidad de la transfección y transducción lentiviral para crear una línea celular U937 knockout RIP1. A pesar de que este método de transfección y transducción requiere mucho trabajo y tiempo, generalmente se considera una forma eficiente de incorporar el ARNg y la endonucleasa Cas9 elegidos en líneas celulares difíciles de transfectar

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medio DMEM ajustado	Gibco	11995-040
Ampicilina	Sigma	A1593
bisBenzimida Hoechst 33342 triclorhidrato	Sigma	B2261
RPMI-1640 Medio completo	Sigma	R6504
Cepa de E. coli de ARNg NTC CRISPR	transOMIC	TELA1011
Cepa de E. coli de ARNg CRISPR RIP1	transOMIC	TEVH-1162203
Rotador de extremo a extremo	Thermo Scientific
Microscopio de fluorescencia EVOS FL	Tecnologías de la vida
Kit de plasmido GenElute Maxiprep	Sigma	PLX15
Anticuerpo IgG anti-conejo de cabra, conjugado HRP (H + L)	Sigma	AP307P
HEK293T Celdas	ATCC
Agitador de incubadora	Nuevo Brunswick Científico
LB Agar	BD	244520
LB Caldo	BD	244610
LV-MAX Mezcla de envases lentivirales	Gibco	Referencia A43237
MitoSOX Rojo	MedChemExpress	HY-D1055
Espectrofotómetro NanoDrop	Thermo Scientific
Necrostatina-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromicina	Sigma	P7255
Conejo antihumano RIP1 mAb	Tecnología de señalización celular	3493
SDS-PAGE y equipo de Western Blot	BioRad
TNF-&alfa;	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Monocitos Humanos	ATCC
Sistema de ensayo de proliferación celular WST-1	Takara	MK400
X-tremeGENE 9 Reactivo de transfección de ADN	Diagnóstico de Roche	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902