Este protocolo describe un método fiable para obtener criosecciones de alta calidad de ojos de conejo enteros. En él se detallan los procedimientos de disección, fijación, inclusión y seccionamiento de ojos de conejo, que pueden adaptarse fácilmente para su uso en cualquier estudio que utilice inmunohistoquímica en ojos más grandes.
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Artículo de método
Obtención de criosecciones de alta calidad de ojo de conejo entero
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe cómo obtener criosecciones de retina de alta calidad en animales más grandes, como conejos. Después de la enucleación, el ojo se sumerge brevemente en el fijador. A continuación, se extraen la córnea y el iris y se deja el ojo toda la noche para una fijación adicional a 4 °C. Después de la fijación, se retira la lente. A continuación, el ojo se coloca en un criomold y se llena con un medio de inclusión. Al retirar el cristalino, el medio de inclusión tiene un mejor acceso al vítreo y conduce a una mejor estabilidad de la retina. Es importante destacar que el ojo debe incubarse en un medio de inclusión durante la noche para permitir una infiltración completa en todo el vítreo. Después de la incubación durante la noche, el ojo se congela en hielo seco y se secciona. Se pueden obtener secciones completas de la retina para su uso en inmunohistoquímica. Se pueden utilizar protocolos de tinción estándar para estudiar la localización de antígenos dentro del tejido de la retina. El cumplimiento de este protocolo da como resultado criosecciones de retina de alta calidad que se pueden utilizar en cualquier experimento que utilice inmunohistoquímica.
Introducción
La retina está compuesta por varias capas de células especializadas dentro del ojo que juntas trabajan para convertir la luz en señales neuronales. Debido a que la retina desempeña un papel fundamental en la visión, la comprensión de su estructura y función puede proporcionar información valiosa sobre algunas de las causas más comunes de pérdida de visión, como la degeneración macular y la retinopatía diabética, entre otras.
Los conejos sirven como un modelo animal conveniente en la investigación de la retina, ya que ofrecen varias ventajas en comparación con otros modelos. Los ojos de conejo son relativamente similares en anatomía a los oj....
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Protocolo
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad del Sur de California. En el desarrollo de este protocolo se utilizaron catorce (n = 14) conejos de entre 4 y 6 meses de edad. Se utilizaron animales machos y hembras. Todos los animales pesaron entre 2,0 y 2,5 kg. Todos los animales estaban alojados individualmente. Puede encontrar una lista de materiales y equipos recomendados en la Tabla de Materiales.
1. Preparación
- Preparación del fijador.
- Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en solución ....
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Resultados
Después del procesamiento de tejidos, se puede utilizar un protocolo de inmunofluorescencia estándar para investigar cualquier número de procesos biológicos dentro de la retina. Las figuras 3A-C ilustran imágenes representativas de fluorescencia de una sección de retina obtenida mediante microscopía confocal. La sección retiniana fue inmunoteñida de acuerdo con un protocolo previamente descrito12.
Las secci.......
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Discusión
Antes de implementar el protocolo anterior, nos enfrentábamos constantemente a dificultades con el procesamiento de tejidos de ojos de conejo para IHQ. Habíamos adaptado varios protocolos de los ojos de animales más pequeños, como ratones, pero descubrimos que estos conducían a una fijación inadecuada y a dificultades con el corte de tejidos. Hay varias consideraciones importantes que permiten secciones consistentes y de alta calidad de la retina del conejo.
Una consideración es el gran tamaño.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Gracias a Rosanna Calderón, Dominic Shayler y Rosa Sierra por su asesoría técnica. Este estudio fue financiado en parte por una subvención sin restricciones al Departamento de Oftalmología de la Facultad de Medicina Keck de la USC de Investigación para Prevenir la Ceguera (AN), NIH K08EY030924 (AN), la Fundación Las Madrinas en Terapéutica Experimental para la Oftalmología (AN), un Premio al Desarrollo Profesional de Investigación para Prevenir la Ceguera (AN), Fundación Oftalmológica de los Caballeros Templarios (AN), y la Fundación Conmemorativa Edward N. y Della L. Thome (AN, KG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo de 100 mm | Corning | 353025 | Se utiliza para la disección (pasos 1.3, 3 y 5) |
| Tubo de 50 ml | Genesee Scientific | 28-106 | Para fijación y crioprotección (paso 1) |
| Criostato | Leica | CM1850 | Para crioseccionado (paso 7) |
| Tijeras curvas | Fine Science Tools | 91500-09 | Se utiliza para la disección (pasos 1.3, 3 y 5) |
| DAPI | Fisher Scientific | D3571 | Diluido 1:1.000 en tampón de bloqueo |
| Microscopio de disección | Zeiss | Stemi 2000-C | Utilizado para la disección (pasos 1.3, 3 y 5) |
| Burro anti-Cabra 488 | Fisher Scientific | A-11055 | Diluido 1:1.000 en tampón |
| de bloqueo Burro anti-Ratón 555 | Fisher Scientific | A-31570 | Diluido 1:1.000 en tampón |
| de bloqueoPinzas | Fine Science Tools | 91150-20 | Se utiliza para la disección (pasos 1.3, 3 y 5) |
| Cubierta deslizante de vidrio | VWR | 48404-453 | Para crioseccionado (paso 7) |
| Anti-SOX2 | de cabra R& D Systems | AF2018 | Diluido 1:100 en tampón de bloqueo |
| Cuchillas criostéricas desechables de alto perfil | Leica Microsystems Inc. | 14035838926 | Para crioseccionar (paso 7) |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | Se utiliza para limpiar el exceso de PBS o OCT (pasos 3 y 6) |
| Anti-RPE65 para ratones Novus | Bio | NB100-355SS | Diluido 1:100 en tampón de bloqueo |
| OmniPur Sacarosa | Millipore 167117 | Utilizado para crioprotección (paso 1.2) | |
| Solución de paraformaldehído al 20% | Microscopía electrónica Ciencias | 15713 | Utilizado como fijador de tejidos (diluido al 4% en el paso 1.1) |
| Molde de inclusión desechable Peel-A-Away (22x22x20 mm de profundidad) | Polysciences, Inc. | 18646A | Se utiliza como molde de inclusión (paso 6) |
| Solución salina tamponada con fosfato, 1x | Corning | 21-030-CV | Se utiliza en la preparación de fijador (paso 1.1) y crioprotector (paso 1.2) |
| Hoja de bisturí n.º 15 | Feather | 08-916-5D | Se utiliza para la disección (pasos 1.3, 3 y 5) |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | Para criosección (paso 7) |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | Utilizado como medio de inclusión (paso 6) |
Referencias
- Peiffer, R. L. Jr, Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. , Academic Press. 409-433 (1994).
- Davis, F. A. T....
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Reimpresiones y permisos
