Method Article

Cuantificación de las propiedades elásticas de las biopelículas ambientales mediante elastografía de coherencia óptica

DOI:

10.3791/66118

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March 1st, 2024

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1Theoretical and Applied Mechanics Program, Northwestern University, 2Civil and Environmental Engineering Department, Northwestern University, 3Mechanical Engineering Department, Northwestern University, 4Black & Veatch

In This Article

Summary

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Este artículo destaca la eficacia de la técnica de elastografía de coherencia óptica (OCE) en la caracterización rápida y no destructiva de las propiedades elásticas de la biopelícula. Aclaramos los procedimientos críticos de implementación de OCE para mediciones precisas y presentamos los valores del módulo de Young para dos biopelículas granulares.

Abstract

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Las biopelículas son biomateriales complejos que comprenden una red bien organizada de células microbianas encerradas en sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de producción propia. En este artículo se presenta una descripción detallada de la implementación de medidas de elastografía de coherencia óptica (OCE) adaptadas para la caracterización elástica de biopelículas. OCE es una técnica óptica no destructiva que permite el mapeo local de la microestructura, morfología y propiedades viscoelásticas de materiales blandos parcialmente transparentes con alta resolución espacial y temporal. Proporcionamos una guía completa que detalla los procedimientos esenciales para la correcta implementación de esta técnica, junto con una metodología para estimar el módulo de Young de biopelículas granulares a partir de las mediciones recolectadas. Estos consisten en la configuración del sistema, la adquisición de datos y el posprocesamiento. En la discusión, profundizamos en la física subyacente de los sensores utilizados en OCE y exploramos las limitaciones fundamentales con respecto a las escalas espaciales y temporales de las mediciones de OCE. Concluimos con posibles direcciones futuras para avanzar en la técnica OCE para facilitar las mediciones elásticas de biopelículas ambientales.

Introduction

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En el tratamiento de aguas residuales y la recuperación de recursos hídricos, las biopelículas beneficiosas en los reactores de crecimiento adjuntos se emplean cada vez más para permitir que los microbios conviertan contaminantes indeseables, como la materia orgánica, el nitrógeno y el fosfato, en formas estabilizadas que puedan eliminarse fácilmentedel agua. En estos sistemas, la función emergente de la biopelícula, es decir, las transformaciones bioquímicas, está estrechamente asociada con la diversidad de microbios que residen en ella y los nutrientes que estos microbios reciben2. En consecuencia, el crecimiento continuo de la biopelícula puede plantear un desafío para mantener la funcionalidad constante del reactor porque el crecimiento de la nueva biopelícula puede alterar los procesos metabólicos generales de la biopelícula, las características de transferencia de masa y la composición de la comunidad. Estabilizar el entorno de la biopelícula tanto como sea posible puede proteger contra tales cambios3. Esto incluye garantizar un flujo constante de nutrientes y mantener estable la estructura de la biopelícula con un espesor constante4. El monitoreo de la rigidez y la estructura física de la biopelícula permitiría a los investigadores obtener información sobre la salud general y el funcionamiento de la biopelícula.

Las biopelículas presentan propiedades viscoelásticas 5,6,7. Esta naturaleza viscoelástica da como resultado una combinación de una deformación instantánea y lenta, dependiente del tiempo, en respuesta a fuerzas mecánicas externas. Un aspecto único de las biopelículas es que, cuando se someten a una deformación sustancial, responden como líquidos viscosos. Por el contrario, cuando se someten a una deformación menor, su respuesta es comparable a la de los sólidos5. Además, dentro de esta región de pequeña deformación, existe un rango de deformación bajo el cual las biopelículas exhiben una relación lineal fuerza-desplazamiento 5,6,7. Las deformaciones dentro de este rango lineal son óptimas para evaluar las características mecánicas de la biopelícula, ya que producen mediciones reproducibles. Varias técnicas pueden cuantificar la respuesta elástica dentro de este rango. La elastografía de coherencia óptica (OCE) es una técnica emergente que se está adaptando para el análisis de biopelículas en este rango lineal (deformaciones del orden de 10-4-10-5)8,9.

La aplicación más consolidada de OCE hasta el momento es en el campo biomédico, donde la técnica se ha aplicado para caracterizar tejidos biológicos que solo requieren un acceso óptico superficial. Por ejemplo, Li et al. utilizaron OCE para caracterizar las propiedades elásticas del tejido cutáneo10. Otros autores caracterizaron las propiedades elásticas anisotrópicas de los tejidos corneales porcinos y humanos y cómo se ven afectados por la presión intraocular 11,12,13,14,15,16. Algunas ventajas del método OCE para el estudio de biopelículas son que no es destructivo y proporciona una resolución espacial de mesoescala, no requiere ninguna preparación de la muestra y el método en sí es rápido; Proporciona mediciones corregistradas de la estructura física y las propiedades elásticas (p. ej., porosidad, rugosidad superficial y morfología)8,9,17,18.

El método OCE mide el desplazamiento local de las ondas elásticas que se propagan en una muestra utilizando tomografía de coherencia óptica sensible a la fase (OCT). La OCT es un interferómetro óptico de baja coherencia que transforma los cambios locales en el desplazamiento de la muestra en un cambio de intensidad que se registra con un espectrómetro óptico. La técnica OCT también se ha utilizado en la investigación de biopelículas para la caracterización de la estructura de mesoescala, la distribución de la porosidad en tres dimensiones y la deformación de la biopelícula 17,19,20,21. Además, Picioreanu et al. estimaron las propiedades mecánicas de la biopelícula utilizando el modelado inverso de la interacción fluido-estructura de imágenes de deformación de la sección transversal de OCT22.

Por otro lado, las mediciones de OCE, junto con el modelado de ondas elastodinámicas inversas, producen la velocidad de onda de las ondas elásticas en la muestra, lo que permite la caracterización de las propiedades elásticas y viscoelásticas de la muestra. Nuestro grupo adaptó la técnica OCE para la medición cuantitativa de las propiedades elásticas y viscoelásticas de la biopelícula 8,9,18 y validó la técnica frente a las mediciones de reometría de cizallamiento en muestras de placas de gel de agarosa18. El enfoque OCE proporciona estimaciones precisas y fiables de las propiedades de la biopelícula, ya que la velocidad de onda elástica medida se correlaciona con las propiedades elásticas de la muestra. Además, la caída espacial de la amplitud de la onda elástica se puede correlacionar directamente con las propiedades viscoelásticas debido a los efectos viscosos en el material. Hemos reportado mediciones OCE de las propiedades viscoelásticas de biopelículas bacterianas de cultivo mixto cultivadas en cupones en un reactor anular giratorio (RAR) y biopelículas granulares con geometrías complejas utilizando modelos de ondas elastodinámicas18.

La técnica OCE es también una potente alternativa a la reometría tradicional18que se utiliza para la caracterización viscoelástica. Los métodos de reometría son los más adecuados para muestras con geometría plana. Como tal, las biopelículas granulares, que tienen formas y morfologías superficiales arbitrarias, no se pueden caracterizar con precisión en un reómetro 8,23. Además, a diferencia de la OCE, los métodos de reometría pueden ser difíciles de adaptar para mediciones en tiempo real, por ejemplo, durante el crecimiento de la biopelícula en las células de flujo24,25.

En este artículo, mostramos que las mediciones OCE de la velocidad de onda independiente de la frecuencia de las ondas superficiales se pueden utilizar para caracterizar las propiedades elásticas de la biopelícula sin la necesidad de modelos complicados. Este desarrollo hará que el enfoque OCE sea más accesible para la comunidad de biopelículas en general para estudiar las propiedades mecánicas de las biopelículas.

La Figura 1 muestra una ilustración esquemática del sistema OCT utilizado en este estudio. El sistema incorpora varios instrumentos, incluido un sistema OCT comercial sensible a la fase en el dominio espectral, un generador de retardo, un generador de funciones y un transductor piezoeléctrico. El sistema OCT funciona según el principio de interferometría mediante el empleo de una fuente de luz de banda ancha con una longitud de onda central de 930 nm. La intensidad de la luz recopilada, que se correlaciona con los intrincados detalles estructurales de la muestra, se analiza en la unidad de posprocesamiento y luego se convierte en una imagen transversal de la muestra, comúnmente conocida como imagen OCT. La profundidad de la imagen de la OCT depende de la gravedad de la dispersión óptica en la muestra que se deriva de la variación local en el índice de refracción y se limita a 1-3 mm en tejidos biológicos y biopelículas. Dado que la fase óptica de la muestra y la intensidad de la interferencia se modulan por el movimiento, la OCT se puede utilizar para detectar el desplazamiento local de la muestra. Aprovechamos la sensibilidad de desplazamiento de la OCT en el método OCE para rastrear el campo de desplazamiento en estado estacionario de las ondas elásticas en la muestra. Específicamente, el generador de funciones emite un voltaje sinusoidal para accionar el transductor piezoeléctrico. El transductor, a su vez, se estira y se contrae con un historial de tiempo oscilatorio. El desplazamiento oscilatorio del transductor imparte una fuerza sinusoidal sobre la superficie de la muestra a través de una punta de cuña impresa en 3D en el vértice del transductor, lo que conduce a la generación de ondas elásticas armónicas en la muestra. La punta de cuña hace un ligero contacto con la muestra, de modo que la muestra permanece intacta después de que el actuador se retrae de la superficie de la muestra. Para registrar el desplazamiento local en la muestra, se adquieren escaneos de profundidad adyacentes separados por un retardo de tiempo fijo en cada píxel de la muestra. La diferencia de fase óptica entre escaneos consecutivos en cada punto de píxel es proporcional al desplazamiento vertical local en el mismo punto. La sincronización entre el desplazamiento del transductor y la óptica de barrido en el sistema OCT se logra a través de un pulso de disparo que se origina en el generador de funciones y se retarda en el generador de retardo. Este paso de sincronización facilita la adquisición de imágenes transversales consistentes de la distribución de fase óptica local en la muestra. Estas imágenes son directamente proporcionales al desplazamiento armónico vertical local en la muestra y se conocen como imagen OCE. Las imágenes OCE se adquieren a diferentes frecuencias de accionamiento del transductor para obtener la longitud de onda elástica y la velocidad de la onda en función de la frecuencia. Las velocidades de onda medidas se analizan con un modelo elastodinámico para determinar las propiedades elásticas de la muestra.

Protocol

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1. Configuración del sistema

  1. Reúna los componentes del sistema que incluyen el sistema OCT comercial (unidad base, soporte, cabezal de imágenes y computadora), generador de forma de onda, transductor, generador de retardo/pulso, un interruptor con conexiones BNC, cables y adaptadores BNC, postes ópticos y abrazaderas.
  2. Conecte la señal de sincronización del generador de funciones a un interruptor. Conecte el otro puerto del switch al generador de retardo.
  3. Conecte la salida del generador de funciones a los cables del transductor.
  4. Conecte las salidas del generador de retardo al canal de disparo en la parte posterior de la unidad base OCT. La señal de salida del generador de retardo es un pulso de disparo para iniciar el movimiento de la óptica de escaneo en el sistema OCT.
  5. Encienda los componentes del sistema (unidad base OCT, computadora, generador de funciones y generador de retardo) e inicie el software OCT.
  6. Configure el generador de retardo para enviar una señal de disparo lógico de transistor-transistor a la unidad base OCT. Consulte el manual del sistema OCT para conocer los requisitos de la señal de disparo.
  7. Coloque el transductor debajo de la lente OCT. El transductor tiene una punta de cuña impresa en 3D pegada en uno de sus extremos que sirve como fuente de línea para las ondas elásticas.

2. Adquisición de imágenes

  1. En el software OCT, seleccione el modo de adquisición Doppler y habilite el disparador externo.
  2. Coloque la biopelícula granular debajo de la lente en un portamuestras y muévala hacia la punta del transductor utilizando una etapa de traducción. Asegúrese de que el transductor haga contacto suave con la superficie de la muestra, como se muestra en la Figura 2. Se utilizaron dos biofilms granulares (también conocidos como lodos granulares) con diferentes diámetros nominales (4,3 mm y 3,3 mm). Esta selección se realizó para investigar el impacto del tamaño de la biopelícula en sus propiedades mecánicas. Estos se obtuvieron comercialmente.
    NOTA: El portamuestras empleado en este estudio consiste en una placa de plástico impresa en 3D con múltiples hendiduras semiesféricas. Este soporte no permite realizar mediciones en condiciones nativas. Por lo tanto, introdujimos agua del entorno natural durante las mediciones para evitar que la muestra se secara.
  3. Especifique la región de exploración haciendo clic en los puntos inicial y final de la línea de interés (ruta de propagación de ondas) en la ventana del monitor de muestra. Centre esta línea con respecto a la punta del transductor y asegúrese de que esté perpendicular al borde de la punta.
  4. Especifique el número de píxeles a lo largo de la región de escaneo y la profundidad de la muestra y aumente el número de escaneos B (imágenes transversales 2D) que se registrarán para mejorar la relación señal-ruido de las imágenes OCE. Los resultados presentados se obtuvieron utilizando 1523 píxeles a lo largo de la ruta de escaneo y 1024 píxeles a lo largo de la profundidad. Se realizaron un total de 50 B-scans.
  5. Haga clic en el botón Escanear y encienda el interruptor. Las imágenes OCT y OCE deben aparecer en la pantalla. Active el interruptor dentro del tiempo de espera del disparo y el tiempo de preparación del escaneo.
  6. Asegúrese de que la intensidad de referencia esté dentro del rango óptimo y coloque la muestra dentro de la región focal del objetivo del microscopio OCT. Una muestra correctamente enfocada debe tener su borde superior cerca de la parte superior de la imagen.
  7. Ajuste el contorno de fase en la imagen OCE en la barra de herramientas de visualización aumentando el valor más alto de la barra de color del lado izquierdo y disminuyendo el valor más bajo de la barra de color del lado derecho. Esto aumentará el contraste de los flecos.
  8. Configure el generador de funciones para producir una tensión sinusoidal de frecuencia única pulsando el botón Sinusoidal en el panel frontal y especifique la frecuencia de excitación inicial para las mediciones. Las mediciones de este estudio comienzan en 4 kHz y terminan en 9,6 kHz. Habilite el conector de salida presionando la tecla de salida.
  9. Establezca un voltaje aceptable para la medición. Este valor debe maximizar la visibilidad de los flecos, pero también evitar el ajuste de fases. Para las biopelículas de este estudio y el rango de frecuencia de las mediciones, un voltaje entre 5 y 10 V suele dar como resultado un mapa de fases con buen contraste.
  10. Adquiera las imágenes OCT y OCE haciendo clic en el botón Grabar .
  11. Repita las mediciones a diferentes frecuencias para obtener imágenes transversales del campo de onda elástico con diferentes longitudes de onda (o períodos de franja).

3. Análisis de imágenes

  1. Obtener el tamaño físico de los píxeles. El tamaño físico de píxel en x se obtiene dividiendo el campo de visión en la dirección x por el tamaño de la imagen en la dirección x y luego multiplicándolo por un factor de dos. El tamaño físico de píxel en z se obtiene dividiendo el campo de visión en la dirección z por el tamaño de la imagen en la dirección z. Los valores de campo de visión y tamaño de imagen se almacenan en la matriz de estructura con la información de la imagen a la que se puede acceder con la función OCTFileOpen proporcionada en el SDK de MATLAB en el paquete ThorImageOCT.
  2. Obtenga las matrices OCT y OCE utilizando las funciones OCTFileGetIntensity y OCTFileGetPhase, respectivamente, y tome el promedio de las tramas grabadas. Estas funciones se proporcionan en el SDK de MATLAB en el paquete ThorImageOCC.
  3. Obtenga las ubicaciones de los píxeles del borde superior de la muestra binarizando la imagen y detectando los píxeles blancos de arriba a abajo para cada columna.
  4. Extraiga la distribución de fase de la imagen OCE a lo largo de este borde utilizando la función improfile y calcule la longitud de arco acumulada en dimensiones reales. Calcule la longitud del arco tomando la suma acumulada de la norma de diferencias escaladas entre puntos consecutivos en las direcciones x y z.
  5. Calcule la transformada de Fourier rápida espacial de la distribución de fase OCT medida (es decir, a partir de las imágenes OCE) con respecto a la longitud de arco acumulada utilizando la función plomb.
  6. Determine la ubicación del pico en el espectro. Esta ubicación representa la frecuencia espacial de la onda. Calcule la velocidad de onda (o velocidad de fase) a partir de la relación entre la frecuencia de excitación del transductor (unidades de Hz) y la frecuencia espacial (unidad de longitud inversa).

Results

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En este estudio, se utilizaron biopelículas granulares (también conocidas como lodos granulares), que se obtuvieron comercialmente. Los gránulos son biopelículas esféricas que se forman a través de la autoagregación, lo que significa que no requieren un portador o superficie sobre la cual crecer26. La Figura 3A muestra una imagen representativa de OCT de corte transversal que surge debido a la variación espacial del índice de refracción local en una biopelícula granular. El biofilm tiene un diámetro nominal de 3 mm. Algunas de las características internas, incluidos los poros y los vacíos que están cerca de la superficie de la muestra, se ven en la imagen. El aumento de la dispersión óptica a lo largo de la profundidad de la muestra evita que la fuente de luz OCT llegue al centro de la muestra, lo que hace que la región central carezca de cualquier información discernible. La Figura 3B muestra la imagen OCE transversal de la muestra para una frecuencia de excitación del transductor de 5,1 kHz. El contraste local en la imagen se correlaciona con el desplazamiento vertical local inducido por la onda elástica que se propaga en la muestra. El espaciamiento físico de las franjas a lo largo del trayecto de propagación corresponde a la longitud de onda de la onda superficial elástica. La onda superficial se propaga cerca de la superficie de la muestra y tiene una profundidad de penetración cercana a la longitud de onda. La extensión espacial del desplazamiento de la onda superficial no se ve en la imagen debido a la limitada penetración óptica de la fuente de luz OCT en la muestra. La distribución de fase óptica a lo largo del trayecto de propagación de la onda elástica (Figura 4A) se utiliza para determinar la frecuencia espacial de la onda superficial. La frecuencia espacial se obtiene tomando la transformada rápida de Fourier (FFT; Figura 4B) de los datos y seleccionando la frecuencia a la que la magnitud del espectro FFT es mayor.

Es crucial seleccionar un voltaje generador de funciones de magnitud suficiente para producir un patrón de franjas que exhiba un contraste óptimo en la imagen OCE. Sin embargo, se deben evitar voltajes excesivamente grandes, ya que esto puede resultar en un ajuste de fase en la imagen OCE, como se ilustra en la Figura 5A. La envoltura de fase surge porque la diferencia de fase óptica en la medición está restringida al intervalo entre -π y π. Cuando la fase supera uno de estos límites, se pliega hasta el límite opuesto, creando una distribución de fase discontinua. En consecuencia, surge la necesidad de desenvolver fases, lo que plantea desafíos y puede introducir posibles imprecisiones. Otro factor a tener en cuenta para obtener mediciones precisas de las ondas es el número de franjas presentes en la imagen OCE. A bajas frecuencias de transductor, representadas en la Figura 5B, es posible que un ciclo completo de oscilación de la onda superficial no se capture completamente debido al pequeño tamaño del gránulo, y el espectro FFT puede producir estimaciones erróneas para la frecuencia espacial (o longitud de onda inversa). Otra fuente de error en la estimación de la frecuencia espacial es la presencia de modos de onda elástica espacialmente superpuestos, como las ondas superficiales y las ondas de corte a granel, en la imagen OCT. Estos modos de onda se mezclan, creando patrones de interferencia complicados que pueden ser difíciles de analizar. La presencia de varios modos de onda más allá de las ondas superficiales puede introducir efectos de interferencia cerca del transductor, dependiendo de la muestra específica, la frecuencia de excitación y la amplitud. La Figura 6 es un ejemplo de una imagen OCE obtenida con una frecuencia de excitación de 5,5 kHz, en la que una onda de corte masiva cerca del punto de excitación local interfiere con el campo de onda superficial. La Figura 7A muestra una distribución de fase que diverge del patrón de onda sinusoidal decreciente observado en la Figura 4A, atribuido a la combinación de modos de onda. En consecuencia, la FFT resultante exhibe un pico más amplio, como se muestra en la Figura 7B. El mismo fenómeno puede ocurrir cerca de defectos como vacíos o regiones con marcadas variaciones en las propiedades elásticas/viscoelásticas. En estas áreas, el campo de desplazamiento local se modifica debido a la interferencia de la onda incidente o superficial y las ondas dispersas del defecto.

Calculamos la velocidad de onda para la onda superficial a frecuencias entre 4,0 y 9,6 kHz para dos biopelículas granulares con diferentes diámetros nominales (4,3 mm y 3,3 mm). Los gráficos de velocidad de onda se denominan curvas de dispersión. Para los ajustes utilizados, cada medición de dispersión tardó aproximadamente 15 minutos. Dentro del intervalo de frecuencia seleccionado, múltiples ciclos del perfil de desplazamiento sinusoidal están presentes en las imágenes OCE, lo que permite una determinación precisa de la frecuencia espacial junto con un notable contraste de fase. La Figura 8 ilustra las curvas de dispersión obtenidas. Estas curvas representan las curvas de dispersión promedio para tres ubicaciones dentro de cada muestra. Las velocidades de onda superficial se acercan a un valor constante, llamado velocidad de onda de Rayleigh, cR, que está relacionado con el módulo de corte de la muestra a través de la relación,

cR = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2

donde, G es el módulo de corte, r es la densidad de masa y ν es la relación de Poisson27,28. Es constante porque la profundidad de penetración de la onda elástica es menor que el diámetro de la muestra. Esencialmente, la onda elástica viaja cerca de la superficie de la muestra con una velocidad de onda que es directamente proporcional al cuadrado del módulode Young 28. Sin embargo, debido al ruido de medición, la velocidad de la onda no es completamente constante en este rango de frecuencia. Tomamos el promedio de las velocidades de onda para frecuencias entre 6.0 y 9.6 kHz para la muestra más pequeña y entre 4.0 y 9.6 kHz para la muestra más grande. Esta velocidad media de la onda se emplea para estimar el módulo de Young de la muestra.

Suponemos que la muestra es incompresible debido a su alto contenido de agua. Por lo tanto, ν = 0,5. Por lo tanto, cR está directamente relacionado con E = 3G para un sólido incompresible, donde E es el módulo de Young de la muestra27,28. Las líneas discontinuas de la Figura 8 representan las velocidades de onda de Rayleigh para las diferentes muestras. Suponemos una composición de biopelícula compuesta principalmente por agua, con una densidad de 1000 kg/m3. En consecuencia, el módulo de Young calculado de las biopelículas granulares es de 85 kPa y 205 kPa para las biopelículas granulares con diámetros nominales de 4,3 mm y 3,3 mm, respectivamente. Esta medición confirma la capacidad de la técnica para discernir las diferencias de propiedades mecánicas entre las biopelículas.

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Figura 1: Configuración de la elastografía de coherencia óptica. El esquema del sistema utilizado aquí se muestra en la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Muestra montada. La biopelícula granular se coloca en el portamuestras mientras el transductor hace contacto suave con ella. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes OCT y OCT de biofilm granular. (A) Imagen OCT. (B) Imagen OCE para una onda superficial que se propaga a 5,1 kHz que muestra un buen contraste de franja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Distribución de fase y FFT. Para la imagen que se muestra en la Figura 3B, (A) distribución de la diferencia de fase a lo largo del borde superior de la muestra y (B) FFT de la distribución de la diferencia de fase que muestra un pico estrecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Imágenes de OCT y OCT de biopelícula granular. (A) Imagen OCE para una onda superficial que se propaga a 5,1 kHz que muestra el envoltura de fase. (B) Imagen OCE para una onda superficial que se propaga a 1,3 kHz sin un ciclo completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Imagen OCE que muestra una combinación de modos. Esta imagen es de una ubicación diferente de la muestra e ilustra la combinación de modos para una onda que se propaga a 5,5 kHz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Distribución de fase y FFT. Para la imagen que se muestra en la Figura 6, (A) distribución de la diferencia de fase a lo largo del borde superior de la muestra y (B) FFT de la distribución de la diferencia de fase que muestra un pico más amplio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Curvas de dispersión. La velocidad de onda en dos muestras con diferentes tamaños se muestra a diferentes frecuencias con barras de desviación estándar. La velocidad de onda de Rayleigh correspondiente para la parte plana de las curvas se traza en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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La profundidad de imagen alcanzable en el sistema OCT está determinada por el grado de penetración de la luz de la fuente de luz, que depende de la longitud de onda de la fuente. Además, la longitud de onda determina la resolución axial. Las longitudes de onda más largas pueden penetrar más profundamente en la muestra, pero a expensas de una resolución axial reducida en comparación con las longitudes de onda más cortas. La resolución transversal, por otro lado, depende tanto de la apertura numérica del sistema como de la longitud de onda, con longitudes de onda más cortas que ofrecen una resolución más alta. El aumento de la apertura numérica introduce una compensación al limitar la profundidad de campo29. La resolución espacial se limita a la longitud de onda elástica más corta que se puede detectar con una relación señal-ruido suficiente. La metodología actual de OCE está limitada a 0,5 mm 9,30. Si bien esta técnica está limitada por el tamaño de la muestra, debe ser aplicable a varios tipos de biopelículas. La forma del biofilm, granular o plano, no inhibirá la técnica. La transparencia de la muestra también juega un papel importante en la determinación de la profundidad de penetración. Los materiales con alta transparencia permiten que la luz atraviese toda la muestra, haciéndola imperceptible a la observación, mientras que las muestras opacas impiden la penetración de la luz, produciendo detalles mínimos sobre su estructura interna 9,28. En el contexto de este estudio, basta con una profundidad de penetración en el rango milimétrico.

Otro posible problema para estas mediciones es que en muestras más grandes, en las que el tamaño no limita el número de ciclos de onda elástica, el campo de visión (FOV) del microscopio OCT puede ser el factor limitante del número de ciclos medidos. Para las mediciones aquí, el campo de visión está limitado a 9 mm por 9 mm; por lo tanto, las longitudes de onda elásticas superiores a 9 mm no se pueden resolver en este microscopio OCT. El uso de una lente con un campo de visión más amplio permitiría obtener imágenes de muestras más grandes, produciendo más franjas a estas frecuencias más bajas. Los desafíos también surgen en frecuencias más altas. Para las muestras de este estudio, más allá de 10 kHz, la onda experimenta una atenuación significativa, disminuyendo la magnitud de la distribución de la diferencia de fase y complicando la determinación de la frecuencia espacial. Este problema se puede mitigar aumentando el voltaje del generador de funciones, aumentando así el desplazamiento del transductor. Sin embargo, aumentar el desplazamiento solo es útil hasta cierto punto, ya que esto eventualmente terminará en la envoltura de fase9. Alternativamente, la mejora de la sensibilidad del sistema mediante la implementación de una fuente de luz con mayor potencia puede contrarrestar la envoltura de fase causada por desplazamientos más grandes y facilitar la detección de la respuesta dinámica a excitaciones más pequeñas. Una mayor sensibilidad facilita la implementación de métodos OCE acústicos que ofrecen el beneficio de la carga sin contacto, pero que se ven más profundamente afectados por la alta atenuación31.

Al realizar estas mediciones en biopelículas, es crucial mantener las muestras hidratadas. El secado conduce a un aumento indeseable de la rigidez, lo cual es irrelevante ya que la atención se centra en evaluar las propiedades de la muestra en su entorno nativo. No se estudió el secado inducido por la iluminación. Sin embargo, observamos que se agregó agua del medio natural periódicamente a lo largo de la medición, y durante ese tiempo, la morfología de la muestra se monitoreó a través de las imágenes de OCT, y no se observaron cambios perceptibles en la morfología. Además, al colocar el transductor y capturar imágenes OCE, es esencial tener en cuenta las características discernidas en la imagen OCT. Las heterogeneidades a lo largo del trayecto de propagación de las ondas pueden distorsionar el campo ondulatorio y, por lo tanto, deben evitarse9. Además, mantener un contacto suave con la biopelícula es crucial, ya que una presión excesiva sobre la muestra, además de modificar potencialmente sus características mecánicas, también podría provocar una distorsión del campo de ondas. Finalmente, la región de escaneo debe ser perpendicular a los frentes de onda para garantizar que la frecuencia espacial de la onda armónica se determine con precisión a partir de la medición.

Para algunas frecuencias, se observaron variaciones significativas en las velocidades de las ondas en ambas muestras, lo que puede atribuirse a sus heterogeneidades inherentes, al campo de onda a esa frecuencia específica y a la morfología de las trayectorias de propagación. Anteriormente demostramos que el perfil de velocidad de onda medido a través de una biopelícula granular seccionada no es uniforme debido a la microestructura heterogénea9. En consecuencia, cuando se emplea esta técnica en biopelículas granulares, es imperativo realizar mediciones en múltiples ubicaciones de la muestra para obtener una representación promediada.

Una observación importante con respecto a las curvas de dispersión es que exhiben comportamientos distintos para diferentes tamaños de muestra. En el caso de la muestra más grande, la curva permanece relativamente constante en todo el rango medido. Sin embargo, para la muestra más pequeña, hay una tendencia al alza en la velocidad de la onda con el aumento de la frecuencia, particularmente en la parte inferior del rango. Este fenómeno se puede atribuir a la presencia de efectos viscoelásticos a frecuencias más bajas y a la generación de modos de guía de ondas elásticas. Estos efectos se tuvieron en cuenta en nuestro trabajo anterior utilizando modelos inversos más sofisticados 8,9,18.

Es importante tener en cuenta que en los sistemas granulares aeróbicos, la biomasa no se distribuye uniformemente a lo largo de la altura del reactor. Durante las fases de no aireación, los gránulos más grandes tienden a depositarse en el fondo del reactor. Esta distribución desigual da como resultado agregados de diferentes tamaños que tienen acceso a diferentes cantidades de sustrato. Como resultado, los agregados de diferentes tamaños exhiben una composición de comunidad distinta. Además, debido a que el exceso de lodo se elimina selectivamente, los gránulos más grandes tienden a retenerse en el reactor durante períodos más largos, mientras que los más pequeños se eliminan más fácilmente32. La notable diferencia en el módulo de Young sugiere una posible conexión entre la composición de la biopelícula, la edad y las propiedades mecánicas.

En resumen, el método de elastografía de coherencia óptica (OCE) ofrece un medio rápido y no destructivo para evaluar la velocidad de onda elástica en biopelículas. Este método supera las limitaciones de las mediciones reológicas y exhibe atributos mejorados en comparación con las técnicas alternativas de elastografía 8,18. Además, su aplicabilidad se extiende más allá de las biopelículas granulares para abarcar cualquier muestra parcialmente transparente con una profundidad de penetración óptica adecuada y un tamaño lo suficientemente grande como para ser resuelto por el sistema, incluidos ejemplos como hidrogeles33, córnea34 y piel35. Los avances futuros del método abarcan varios aspectos clave. En primer lugar, el aumento de la frecuencia de las ondas elásticas armónicas en el rango de cientos de kHz permitirá longitudes de onda de unos pocos micrómetros, logrando así una resolución espacial a una escala similar. En segundo lugar, se mejorará la relación señal/ruido del sistema de detección óptica aumentando la potencia óptica del sistema OCT de 2 mW (corriente) a 20 mW. Por último, sustituiremos el actuador armónico de contacto por una fuente de presión de radiación acústica sin contacto. Esta adición facilitará una operación no invasiva y no destructiva y permitirá interrogar muestras de biopelícula en sus entornos nativos.

Disclosures

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Aqua-Aerobic Systems, Inc. (Rockford, IL, EE.UU.) por proporcionar las biopelículas granulares estudiadas en este trabajo. Los autores también agradecen el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias a través de los premios #210047 y #193729.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Portamuestras
cuña impresa en 3D
Cables BNCde ancho Cualquier marca
Generador de retardoStanford Research SystemsDG535DG535 Retardo digital / Generador de pulsos 
Generador de funcionesAgilent Technologies33250A 80 MHz Generador de funciones / formas de onda arbitrarias
Biofilm granularSistemasobtenidos de un reactor aeróbico de lodos granulares (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLABMathWorksRelease 2022a (MATLAB 9.12)
Transductor piezoeléctricoThorlabsPK2JUP1pila piezoeléctrica discreta, 75 V, 30.0 y micro; m
Desplazamiento SD-OCT SystemThorlabsGanymede II, LSM03 lente de escaneo
ThorImageOCTThorlabsVersión: 5.5.5
impreso en 3D Punta de de 3 mm acuaeróbicos

References

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