Diferenciación de linajes del sistema nervioso entérico a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

La derivación de linajes del sistema nervioso entérico (SNE) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) proporciona una fuente escalable de células para estudiar el desarrollo y la enfermedad del SNE, y para su uso en medicina regenerativa. Aquí, se presenta un protocolo detallado in vitro para derivar neuronas entéricas a partir de hPSCs utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas.

Resumen

El sistema nervioso entérico humano, ENS, es una gran red de tipos de células gliales y neuronales con una notable diversidad de neurotransmisores. El SNE controla la motilidad intestinal, la secreción de enzimas y la absorción de nutrientes, e interactúa con el sistema inmunitario y el microbioma intestinal. En consecuencia, los defectos de desarrollo y adquiridos del SNE son responsables de muchas enfermedades humanas y pueden contribuir a los síntomas de la enfermedad de Parkinson. Las limitaciones en los sistemas de modelos animales y el acceso al tejido primario plantean importantes desafíos experimentales en los estudios del SNE humano. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la derivación efectiva in vitro de los linajes ENS a partir de células madre pluripotentes humanas, hPSC, utilizando condiciones de cultivo definidas. Nuestro protocolo comienza con la diferenciación dirigida de hPSCs a células de cresta neural entérica en un plazo de 15 días y produce diversos subtipos de neuronas entéricas funcionales en un plazo de 30 días. Esta plataforma proporciona un recurso escalable para estudios de desarrollo, modelado de enfermedades, descubrimiento de fármacos y aplicaciones regenerativas.

Introducción

El sistema nervioso entérico (SNE) es el componente más grande del sistema nervioso periférico. El SNE contiene más de 400 millones de neuronas que se encuentran dentro del tracto gastrointestinal y controlan casi todas las funciones del intestino. La comprensión molecular del desarrollo y la función del SNE y sus defectos en las neuropatías entéricas requiere el acceso a una fuente fiable y auténtica de neuronas entéricas. El acceso al tejido primario humano es limitado, y los modelos animales no logran recapitular los fenotipos clave de la enfermedad en muchas neuropatías entéricas. La tecnología de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ha demostrado ser extremadamente beneficiosa para proporcionar una fuente ilimitada de los tipos de células deseados, especialmente aquellas que son difíciles de aislar de las fuentes primarias 2,3,4,5,6,7. Aquí, proporcionamos detalles de un método in vitro robusto y escalonado para obtener cultivos de ENS a partir de hPSCs. Estos cultivos escalables derivados de hPSC abren vías para los estudios de desarrollo, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos de alto rendimiento, y pueden proporcionar células trasplantables para la medicina regenerativa.

Los linajes de neuronas entéricas se derivan de las células de la cresta neural (NC) que siguen la ruta de desarrollo del ENS durante la embriogénesis. En los embriones, las células NC emergen a lo largo de los márgenes de la placa neural plegada. Proliferan, migran y dan lugar a muchos tipos diferentes de células, incluidas las neuronas sensoriales, las células de Schwann, los melanocitos, el esqueleto craneofacial y las neuronas entéricas y la glía ^8,9,10. La decisión sobre el destino de la célula depende de la región distinta a lo largo del eje anteroposterior de la que emergen las células NC, es decir, NC craneal, NC vagal, NC troncal y NC sacra. El SNE se desarrolla a partir de células NC vagales y sacras, dominando las primeras la población de neuronas entéricas debido a la extensa migración a lo largo del intestino y colonizando el intestino¹¹.

La derivación de células NC a partir de PSCs comúnmente implica una combinación de inhibición dual de SMAD y activación de la vía WNT^12,13. Hasta hace poco, todos los protocolos de inducción de NC incluían aditivos de suero y otros productos animales en las condiciones de cultivo. Los medios químicamente indefinidos no solo reducen la reproducibilidad de la inducción de NC, sino que también desafían los estudios mecanicistas del desarrollo. Para superar estos desafíos, Barber et al¹⁴ desarrollaron un protocolo de inducción de NC utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas y, por lo tanto, fue ventajoso sobre los métodos alternativos que dependen de factores de reemplazo sérico (por ejemplo, KSR)^13,14. Esto se obtuvo mediante reemplazos de medios basales y optimización de un protocolo presentado originalmente por Fattahi et al para derivar células NC entéricas a partir de hPSCs. Este sistema mejorado es la base del protocolo de diferenciación de hPSC que se presenta aquí. Comienza con la inducción de las células de la cresta neural entérica (ENC) en un período de 15 días mediante la modulación precisa de la señalización de BMP, FGF, WNT y TGFβ además del ácido retinoico (AR). A continuación, derivamos los linajes de ENS mediante el tratamiento de células con factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF). Todas las composiciones de los medios están definidas químicamente y producen cultivos neuronales entéricos robustos en un plazo de 30 a 40 días.

Además del sistema de cultivo celular monocapa descrito aquí, se han desarrollado enfoques alternativos de inducción de NC que utilizan cuerpos embrioides que flotan libremente^15,16. Se ha demostrado que las células migratorias en estos cultivos expresan marcadores NC con un subconjunto que representa el NC vagal. Se han utilizado cocultivos con tejido intestinal primario para enriquecer los precursores entéricos de NC en estos cultivos. Las composiciones de los medios en estos estudios contienen una combinación de diferentes factores, como el factor de crecimiento nervioso, NT3 y el factor neurotrófico derivado del cerebro. En esta etapa, no está completamente claro cómo estos factores podrían afectar las identidades de compromiso de los precursores de neuronas entéricas. Para una comparación eficiente de la inducción entérica de NC en los cultivos monocapa y en los cultivos basados en cuerpos embrioides, se necesitan más datos. Teniendo en cuenta los diferentes diseños de cultura en estas estrategias, el uso de cada método debe considerarse y optimizarse de acuerdo con la aplicación específica en mente.

El protocolo presentado aquí es reproducible y ha sido probado con éxito por nosotros y otros utilizando diferentes líneas de hPSC (inducidas y embrionarias) ^8,14,16.

Protocolo

1. Preparación de los medios

NOTA: Las concentraciones mencionadas a lo largo del protocolo son concentraciones finales de los componentes del medio. Prepare todos los medios en condiciones estériles en una campana de flujo laminar y almacene a 4 °C en la oscuridad. Úselo dentro de las 2 semanas.

1. Medio de mantenimiento hPSC: Mezcle el suplemento de medio de mantenimiento hPSC sin alimentador (20 μL/mL) con su medio base.
2. Medio A: Agregue la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) y CHIR99021 (600 nM) al medio base de diferenciación.
3. Medio B: Agregue SB431542 (10 μM) y CHIR99021 (1,5 μM) al medio base de diferenciación.
4. Medio C: Añadir SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) y RA (1 μM) al medio base de diferenciación.
5. Medio de cresta neural completa (NCC): Agregue FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) y MEM NEAAs (10 μL/mL) al medio neurobasal.
6. Medio ENC: Agregue GDNF (10 ng/mL), ácido ascórbico (100 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) y MEM NEAAs (10 μL/mL) al medio neurobasal.
7. Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1x: Diluir 500 mM de EDTA (1000x) hasta una concentración final de 500 μM en PBS.
   NOTA: Utilice PBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺ en todo este protocolo a menos que se indique lo contrario.

2. Recubrimiento de placas de cultivo

1. Placas recubiertas de matriz de membrana basal: Descongele rápidamente y diluya una alícuota congelada de 500 μL de matriz de membrana basal en 50 ml de DMEM:F12 refrigerado mediante pipeteo vigoroso con una pipeta serológica de 50 mL. Cubrir los pocillos con la solución diluida de matriz de membrana basal (100 μL por^cm2 de superficie del pocillo) e incubarlos durante la noche a 37 °C. Aspire el medio de recubrimiento antes de usarlo. Para evitar la gelatinización de la matriz de la membrana basal, realice este paso lo más rápido posible y utilice DMEM:F12 frío para disolver la alícuota congelada.
   NOTA: La temperatura de la matriz de la membrana basal debe mantenerse fría durante la descongelación (en hielo) y la alícuota (tubos en hielo) para evitar la coagulación.
2. Placas recubiertas de PO/FN/laminina: Prepare una solución de poliornitina (PO) de 15 μg/mL en PBS diluyendo un stock de 1000x. Cubrir los pocillos con 100 μL de solución de PO/PBS por^cm2 de superficie de pocillo e incubar las placas durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, aspire PO/PBS y cubra los pocillos a 100 μL por^cm2 de superficie del pocillo con una solución de FN/laminina/PBS recién hecha que contenga 2 μg/mL de fibronectina (FN) y 2 μg/mL de laminina. Las placas se pueden utilizar después de un mínimo de 2 h de incubación a 37 °C. Aspire FN/laminina/PBS antes de usar.

3. Mantenimiento de la cultura hPSC

NOTA: Todos los pasos de incubación celular se realizan a 5% de CO₂ y a 37 °C en una incubadora humidificada.

1. Aspire el medio de hPSC del cultivo de hPSC y agregue medio fresco (200 μL por^cm2 de área de superficie del pozo) cada dos días hasta que las colonias sean ~80% confluentes.
2. Para el paso, aspire el medio hPSC y lave las celdas con 100 μL de PBS por^cm2 de superficie de pocillo.
   NOTA: Es importante utilizar PBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺ para lavar las células.
3. Agregue 500 μM de EDTA (100 μL por^cm2 de área de superficie del pocillo). Vuelva a colocar la tapa del plato. Observe a través de un microscopio invertido y controle las células para detectar el desprendimiento de los bordes de la colonia (2-4 min).
4. Utilice una pipeta serológica de 5 o 10 ml para transferir el mismo volumen de medio hPSC a cada pocillo y recoja mecánicamente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   NOTA: El tiempo óptimo de incubación de EDTA depende de la línea iPSC. Evite el pipeteo vigoroso para separar las colonias, ya que puede provocar una disociación excesiva de las colonias y la muerte celular. Al pasar para iniciar una placa de diferenciación, incube las células con EDTA durante 1-2 minutos más.
5. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las celdas (2 min, 290 x g, 20-25 °C) y desechar con cuidado el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender las células en un volumen apropiado de medio hPSC y transfiéralas a pocillos de una nueva placa recubierta de matriz de membrana basal.
   NOTA: Para el mantenimiento regular de hPSC, utilice una relación de paso de 1:18 a 1:24 (1:18 significa transferir un tercio de las células disociadas de un solo pocillo de una placa de 6 pocillos a una placa completamente nueva). Para iniciar una placa de diferenciación, siga una proporción de paso de 5:6.
7. Incubar al 5% de CO₂ y 37 °C.

4. Inducción de la cresta neural

NOTA: Este paso se representa esquemáticamente en la Figura 1A. Comienza la diferenciación NC cuando las células son aproximadamente 80% confluentes. Esto se logrará dentro de 1-2 días cuando las células se pasen en una proporción de 5:6 (ver arriba). Iniciar la diferenciación NC en el día 0 con células hPSC pluripotentes y totalmente indiferenciadas. Para una alta eficiencia, los bordes de las colonias deben tener un mínimo de células diferenciadoras. Paso y placa hPSC para la diferenciación cuando las colonias son grandes, o el centro de la colonia comienza a engrosarse/oscurecerse cuando se monitorea con un microscopio invertido. Prestar atención a la confluencia y morfología tiende a ser más fiable que el número de células plateadas, ya que puede variar dependiendo de la línea celular y puede variar de 50.000 a 200.000 por^cm2.

1. En el día 0, reemplace el medio de mantenimiento hPSC por el medio A que contenga 1 ng/mL de BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL de medio por^cm2 de área de superficie de pozo).
2. En el día 2, las células deben ser 100% confluentes. Aspire suavemente el medio A gastado y alimente las células con el medio B que contenga 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μL de medio por^cm2 de superficie de pocillo).
   NOTA: A medida que los cultivos crecen durante la inducción de NC, las células pueden desprenderse de la monocapa subyacente. Evite la pérdida excesiva de células retirando suavemente los medios viejos y agregando medios nuevos al costado del pocillo.
3. En el día 4, alimente las células nuevamente con el medio B (200 μL de medio por^cm2 de área de superficie del pocillo).
4. El día 6, reemplace el medio B por el medio C que contenga 10 μM de SB431542, 1,5 μM CHIR99021 y 1 μM de ácido retinoico (400 μL de medio por^cm2 de superficie de pocillo).
5. Los días 8 y 10, alimente como el día 6.

5. Formación de esferoides ENC

NOTA: Este paso se representa esquemáticamente en la Figura 1B.

1. El día 12, aspire suavemente el medio C y lave las células con 100 μL de PBS por^cm2 de superficie de pocillo. Añadir el mismo volumen de solución de desprendimiento de células e incubar durante 30 min al 5% de CO₂ y 37 °C.
2. Diluya la solución de desprendimiento celular agregando el mismo volumen de medio NCC que contenga 10 ng/mL de FGF2, 3 μM de CHIR99021, 10 μL/mL de suplemento de N2, 20 μL/mL de B27, 10 μL/mL de L-glutamina y 10 μL/mL DE MEM NEAA. Con una pipeta serológica, extraiga la suspensión unicelular y añádala a un tubo cónico de 15 mL.
3. Centrifugar las celdas (2 min, 290 x g, 20-25 °C) y desechar con cuidado el sobrenadante.
4. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue 12 ml (para una placa completa de 6 pocillos) de medio NCC y vuelva a suspender las células por completo pipeteando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces. Transfiera la suspensión de la celda a una placa de fijación ultrabaja.
   NOTA: Aproximadamente 10^cm2 de células monocapa ENC se resuspenden en 2 mL de medio NCC y se transfieren a un pocillo de una placa de fijación ultrabaja. Esto equivale a una placa de inducción NC completa de 6 pocillos transferida a una placa de fijación ultra baja completa de 6 pocillos.
5. El día 14, agite suavemente las placas hasta que se reúnan pequeños esferoides en el centro de cada pocillo. Con una micropipeta P1000 y con un movimiento circular lento, aspire el medio NCC gastado alrededor de la circunferencia de cada pocillo. Trate de evitar eliminar los esferoides que flotan libremente.
6. Alimente las células con el volumen original de medio NCC.

6. Inducción EN

NOTA: Este paso se representa esquemáticamente en la Figura 1B.

1. El día 15, aplique la misma técnica utilizada el día 14 para eliminar suavemente el medio y lavar los esferoides con PBS. Elimine la mayor cantidad posible de PBS, evitando los esferoides.
2. Añadir solución de desprendimiento de celda (100 μL por^cm2 de superficie de pocillo) y disociar los esferoides en células individuales incubando durante 30 min al 5% de CO₂ y 37 °C.
3. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue un volumen igual de medio ENC (que contenga 10 ng/ml de GDNF, 100 μM de ácido ascórbico, 10 μL/ml de suplemento de N2, 20 μL/ml de suplemento de B27, 10 μL/mL de L-glutamina y 10 μL/mL DE MEM NEAA en medio neurobasal) a cada pocillo y rompa los esferoides restantes mediante 2-3 rondas de pipeteo mecánico. Transfiera las células a un tubo cónico de 50 mL.
   NOTA: Evite el estrés excesivo y la muerte celular que pueden ocurrir por el pipeteo forzado o el uso de pipetas con una abertura de punta más pequeña.
4. Centrifugar las celdas (2 min, 290 x g, 20-25 °C) y desechar con cuidado el sobrenadante. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue ~ 5-10 mL de medio ENC y vuelva a suspender las células por completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces.
5. Cuente la concentración de células viables usando azul de tripán y un método de conteo de células como un hemocitómetro.
   PRECAUCIÓN: Se sospecha que el azul de tripán es un carcinógeno. Manéjelo con cuidado, deséchelo adecuadamente.
6. Agregue suficiente volumen de medio ENC con el objetivo de recubrir aproximadamente 300,000-400,000 células viables por^cm2 de área de superficie a una densidad de aproximadamente ~ 1,000,000 de células por mL. Aspire la solución de FN/laminina/PBS de los pocillos de la placa.
   NOTA: Elija el formato de placa de acuerdo con los ensayos previstos para los cultivos EN, ya que esta etapa marca el paso final de resiembra del protocolo. Los progenitores de las neuronas entéricas se pueden congelar el día 15. Después de disociar las esferas con la solución de desprendimiento de células, vuelva a suspender los progenitores a aproximadamente 5 x 10⁶ células/mL en un medio de congelación como DMSO al 10% o Stem-cellbanker. Cuando sea necesario, descongele en medios ENC tibios con 5 μM de inhibidor de ROCK Y-27632. Celdas de placa en el formato de placa deseado. Reemplace el medio con ENC nuevo después de un par de horas.
7. Agregue suavemente las células en los pocillos recubiertos de PO / FN / laminina. Evite que las burbujas queden atrapadas debajo de la suspensión de la celda, evitando que las células se adhieran al recubrimiento de PO/FN/laminina, especialmente cuando se utilizan placas con un tamaño de pocillo más pequeño, como las placas de 384 pocillos. Esto podría conducir a la muerte celular.
8. Alimente las células cada dos días con medio ENC (200 μL por^cm2 de superficie de pocillo) hasta el día 30-40, después de lo cual reduzca la frecuencia de alimentación (a una o dos veces por semana) pero duplique el volumen de alimentación (a 400 μL de medio por^cm2 de área de superficie de pocillo).
   NOTA: Esto es importante ya que la eliminación y adición excesiva de medios podría facilitar el desprendimiento del cultivo neuronal de la superficie de los pocillos. Para prevenir prospectivamente el desprendimiento, especialmente para cultivos a largo plazo, complementar ENC con FN (2 μg/mL) y laminina (2 μg/mL) una vez por semana.

Resultados

Este protocolo proporciona un método para derivar la cresta neural entérica y las neuronas entéricas a partir de hPSCs utilizando condiciones de cultivo definidas químicamente (Figura 1A-B). La generación de neuronas de alta calidad depende de un paso eficiente de inducción de la cresta neural entérica. Esto se puede evaluar visualmente comprobando la morfología de las esferas que flotan libremente, que deben verse redondas con superficies lisas con un tamaño aproximado de 0,1 a 0,4 mm, como se ve en la Figura 1C. Estos esferoides también deben expresar el factor de transcripción 10 (SOX10)^17,18 del marcador de cresta neural SRY-Box17,18, como se puede observar en la Figura 1D. Durante la fase de inducción de neuronas entéricas, las neuritas pueden hacerse visibles ya en el día 25-30 (Figura 1E). Sin embargo, esto puede retrasarse en diferenciaciones con menor eficiencia que contienen contaminaciones celulares mesenquimales no deseadas. El sistema nervioso entérico humano es una colección de diversas neuronas que expresan diferentes neurotransmisores. Esta heterogeneidad se recapitula en el protocolo in vitro proporcionado y la expresión de marcadores clave puede evaluarse mediante métodos de tinción celular como la inmunofluorescencia y la citometría de flujo, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente 13,14,19,20,21 (Figura 1F,G).

Figura 1: Derivación de células ENC humanas y subtipos de neuronas entéricas a partir de hPSCs. (A) Inducción de cresta neural entérica (ENC) a partir de hPSC. Protocolo (días 0-12) que muestra las composiciones de medios para derivar células ENC a partir de hPSCs. (B) Formación de esferoides ENC e inducción de neuronas entéricas a partir del protocolo ENC. (días 12-15) que muestra la composición del medio para la formación de esferoides ENC. Posteriormente, se generan y maduran neuronas entéricas mediante el tratamiento con un medio que contiene GDNF y AA. (C) Imágenes representativas de contraste de fase de hPSCs diferenciadas en diferentes puntos temporales del protocolo. Barra de escala: 1000 μM. (D) SOX10::GFP que expresa esferoides ENC derivados de H9 iPSC en el día 14. Barra de escala: 1000 μm. (E) Imagen de contracción de fase de las neuronas del día 33. Barra de escala: 400 μm. (F-G) Imagen de inmunofluorescencia (F) y citometría de flujo (G) de marcadores de neurotransmisores en neuronas de día 40. Barra de escala: 50 μm. Abreviaturas: BMP4 = proteína BMP4 humana recombinante; RA = ácido retinoico; FGF2 = FGF humano recombinante básico; GDNF = factor neurotrófico derivado de una línea celular glial humana recombinante; AA = ácido ascórbico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método robusto in vitro para obtener neuronas entéricas de hPSCs en un plazo de 30-40 días (Figura 1E) y glía entérica que expresa proteína ácida fibrilar glial, GFAP y SOX10 en cultivos más antiguos (> día 55)13,14,19,22. Estas neuronas y glía son inducidas por la diferenciación escalonada de las hPSCs en células de la cresta neural vagal y entérica, seguidas de neuronas entéricas y progenitores gliales^13,14. Las células de la cresta neural expresan marcadores de cresta neural, factor de transcripción AP-2 alfa y beta, TFAP2A y TFAP2B, respectivamente²¹. Previamente demostramos que CD49 puede ser utilizado como un marcador para indicar la eficiencia de las células de cresta neural derivadas de hPSC¹⁴. La eficiencia y el éxito de este método dependen de una combinación de factores. En primer lugar, es fundamental realizar todos los pasos en condiciones estériles. Es importante analizar los cultivos de hPSC para detectar la contaminación por micoplasma, ya que puede afectar negativamente al crecimiento de las células madre y no es detectable visualmente. En segundo lugar, el uso de placas recubiertas de manera uniforme y adecuada reduce la posibilidad de crecimiento irregular de cultivos de hPSC y el desprendimiento de cultivos NC y neuronas más viejas de la superficie de los pocillos. En tercer lugar, para una alta eficiencia en la diferenciación es esencial comenzar con células hPSC pluripotentes y totalmente indiferenciadas. Las colonias de hPSC deben tener un mínimo de células diferenciadoras en los bordes de las colonias. Las hPSC deben ser pasadas o chapadas para su diferenciación cuando las colonias son grandes, o el centro de la colonia comienza a engrosarse/oscurecerse en color, como se observa a través de un microscopio de contraste de fase. Las células diferenciadas no deseadas (generalmente células mesenquimales), no solo disminuyen la eficiencia general de la diferenciación, sino que pueden resultar en el desprendimiento de neuronas de la superficie del pozo a medida que los cultivos envejecen. Por lo tanto, se recomienda monitorear cuidadosamente los cultivos de ENC en los primeros 15 días. En condiciones de diferenciación eficientes, aparecen discos oscuros en la superficie del cultivo ~ día 6, lo que indica una formación eficiente de esferoides en los días 12-15. Además, en la fase esferoide (día 12-15) las esferas que flotan libremente deben tener superficies lisas (Figura 1D). El mantenimiento de la fase esferoide 3D en los días 12-15 es generalmente suficiente para mejorar la pureza de los ENC para la diferenciación posterior de los cultivos en linajes de ENS. Sin embargo, para estudios que requieren poblaciones tempranas y puras de células progenitoras de ENC, se recomienda FACS usando CD49D. CD49D es un marcador de superficie específico para los linajes NC derivados de SOX10:hPSC y se ha utilizado con éxito en líneas celulares^13,14. Para obtener más información sobre el aislamiento de células CD49D+ mediante FACS y recomendaciones sobre la estrategia de compuertas, los lectores deben consultar el artículo de Barber et al., Figura 2D, Recuadro 1 y Figura suplementaria 6¹⁴. En cuarto lugar, para maximizar la eficiencia, la diferenciación debe comenzar cuando los cultivos de hPSC son monocapa y ~80% confluentes. Esto significa tener una cultura totalmente confluente el día 2. Una menor confluencia afecta negativamente a la eficiencia y los cultivos muy densos tienden a tener una mayor tasa de muerte celular y pueden conducir potencialmente a la aparición de células diferenciadas no deseadas.

El replanteo de las células en el día 15 marca un paso importante en este protocolo. Este es el último paso de transferencia celular para un cultivo neuronal monocapa y, por lo tanto, el diseño de la placa debe elegirse de acuerdo con los ensayos planificados. El número de células transferidas a cada pocillo puede afectar considerablemente a la diversidad neuronal y a las neuronas más viejas que permanecen adheridas a la superficie de los pocillos. En general, es deseable una densidad de células en el rango de 250.000-350.000 células por^cm2 (alrededor de 75.000-100.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos o 500.000-700.000 por pocillo de una placa de 24 pocillos). A partir del día 30-40, se podría considerar la adición de fibronectina y laminina al medio de alimentación (no más de una vez a la semana) para prevenir prospectivamente el desprendimiento de neuronas, especialmente para las células planificadas para cultivos de neuronas más largos. En este punto, se recomienda reducir la frecuencia de alimentación a una vez cada 5-7 días y dejar algo de medio en cada pocillo antes de agregar medio fresco adicional. Esto reduce la posibilidad de aplicar un estrés físico innecesario sobre las proyecciones neuronales. Teniendo en cuenta la evaporación del medio (especialmente para los pocillos en el borde de la placa), se pueden eliminar 75 μL y agregar 100 μL de medio fresco a cada pocillo. Con base en la experiencia, los cultivos cultivados en placas de imagen de fondo de cubreobjetos de polímero tienden a vivir y permanecer adheridos a la superficie del pozo durante más tiempo. Por lo tanto, se recomienda considerar las placas de imagen de fondo de cubreobjetos de polímero para experimentos que requieran cultivos neuronales muy antiguos, como cocultivos con otros tipos de células. Aunque las placas recubiertas de PO/FN/laminina secadas al aire aún podrían rendir en una diferenciación eficiente, esto no se ha probado sistemáticamente para el propósito de este protocolo. Por lo tanto, se recomienda el uso de placas recién recubiertas.

El protocolo aquí descrito se basa en un protocolo previamente publicado por Barber et al¹⁴. En comparación con los métodos de inducción de ENC más antiguos que utilizan medios que contienen factores de reemplazo sérico (p. ej., KSR)^13,14, las condiciones actuales del medio del protocolo están químicamente definidas. Esto es ventajoso hacia diferenciaciones más consistentes y permite estudios de desarrollo más precisos mediante la manipulación de las condiciones de cultivo. Este robusto protocolo genera de forma reproducible cultivos de neuronas entéricas a partir de líneas independientes de células madre inducidas y embrionarias que han sido probadas, como H9, UCSF4 y WTC11. Un aspecto poderoso del protocolo presentado es su capacidad para generar una variedad de subtipos neuronales de ENS que se asemejan a los que se encuentran en el ENS humano. Por ejemplo, la expresión de marcadores específicos para diferentes identidades neuroquímicas del SNE puede comprobarse mediante citometría de flujo e imágenes de fluorescencia (Figura 1F,G). El rango típico de poblaciones neuronales entéricas derivadas de hPSC positivas para óxido nítrico sintasa 1 (NOS1) es del 5% al 20%; colina O-acetiltransferasa (CHAT) es 40%-60%; El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es del 15%-30% y la serotonina (5-HT) es del 15%-30%. Sin embargo, el grado en que la conectividad estructural y funcional in vitro entre estos subtipos modela con precisión las redes celulares in vivo requiere más estudios. Además, los análisis de células individuales para ampliar el perfil transcripcional de subtipos individuales no solo ayudarían a comparar mejor las identidades celulares in vivo e in vitro, sino que también beneficiarían a los estudios moleculares y de desarrollo, así como a las futuras optimizaciones de protocolos para enriquecer subtipos específicos para el descubrimiento de fármacos y la medicina regenerativa.

A pesar de que los cultivos contienen diferentes células neuronales, y en cultivos más antiguos gliales, este protocolo no genera los otros tipos de células que se encuentran naturalmente en el nicho in vivo del ENS, como las células musculares, las células epiteliales y las células inmunitarias. El estudio de la interacción del ENS con estos tipos de células en el contexto de la salud y la enfermedad requiere inversión en la optimización de los sistemas de cocultivo y organoides intestinales. En general, aquí se describe un método poderoso para generar diferentes subtipos de ENS a partir de hPSC in vitro . Los cultivos escalables son adecuados para estudios de desarrollo del SNE humano, pruebas toxicológicas y experimentos de modelado de enfermedades destinados a desarrollar terapias farmacológicas y proporcionar células trasplantables para el tratamiento de neuropatías entéricas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A5960
B27 suplemento (sin suero, menos vitamina A)	Gibco	12587-010
Matriz de membrana basal, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D systems	314-BP
Centrífuga de cultivo celular	Eppendorf, modelo n.º 5810R	02262501
Solución de desprendimiento de células, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Tubos cónicos	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
diferenciación, Essential 6	Life Tecnologías	A1516401
DMEM/F-12 sin glutamina	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Medio de mantenimiento hPSC sin alimentador, Essential 8 Flex Medium Kit	Technologies	A2858501
FGF2	R& D systems	233-FB/CF
Fibronectina	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocitómetro	Hausser Scientific	1475
Células madre pluripotentes humanas, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubadora con humedad, temperatura y CO2 controlados	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Microscopio invertido	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Campana de flujo laminar	Thermo Fisher Scientific	serie 1300 clase II, tipo A2
Laminina	Cultrex	3400-010
Suplemento de L-glutamina, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Placas multipocillo, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium Life	Technologies	21103049
PBS (libre de Ca y Mg)	Life Technologies	10010023
Llenadora de pipetas	Eppendorf	Z768715-1EA
Puntas de pipeta	USA scientific	1111-2830
Pipetas	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
placas de imagen de fondo de cubreobjetos de polímero,	ibidi ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R& D systems	1614
Tinte azul tripano, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Placas de fijación ultra bajas	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 diclorhidrato	R& Sistemas D	1254