Artículo de método

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

DOI:

10.3791/66134

⸱

15 de diciembre de 2023

 ,  ,  , 
1Wuhan Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El accidente cerebrovascular isquémico sigue siendo la causa predominante de mortalidad y deterioro funcional entre las poblaciones adultas de todo el mundo. Solo una minoría de los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico son elegibles para recibir tratamiento de trombólisis intravascular o trombectomía mecánica dentro del período de tiempo óptimo. Entre los supervivientes de accidentes cerebrovasculares, alrededor de dos tercios sufren disfunciones neurológicas durante un periodo prolongado. El establecimiento de un modelo experimental de accidente cerebrovascular isquémico estable y repetible es extremadamente importante para investigar más a fondo los mecanismos fisiopatológicos y desarrollar estrategias terapéuticas efectivas para el accidente cerebrovascular isquémico. La arteria cerebral media (ACM) representa la localización predominante del accidente cerebrovascular isquémico en los seres humanos, y la oclusión del ACM es el modelo más utilizado de la isquemia cerebral focal. En este protocolo, describimos la metodología para establecer el modelo de oclusión distal de MCA (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6. Dado que el sitio de oclusión se localiza en la rama cortical de la ACM, este modelo genera una lesión infartada moderada restringida a la corteza. La caracterización neurológica, conductual e histopatológica ha demostrado disfunción motora visible, degeneración neuronal y activación pronunciada de la microglía y los astrocitos en este modelo. Por lo tanto, este modelo de ratón dMCAO proporciona una herramienta valiosa para investigar el ictus isquémico y el valor de la popularización.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El accidente cerebrovascular es una enfermedad cerebrovascular aguda frecuente caracterizada por una alta incidencia de discapacidad y mortalidad1. De todos los casos de ictus, casi el 80% pertenecen a ictus isquémico2. Hasta ahora, la trombólisis intravenosa sigue siendo uno de los pocos enfoques productivos para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo. Sin embargo, la efectividad del tratamiento trombolítico está limitada por la estrechez del tiempo efectivo y la ocurrencia de transformación hemorrágica3. En la fase de rehabilitación a largo plazo después de un accidente cerebrovascular isquémico, es probable que un número considerable de pacientes experimente disfunciones neurológicas duraderas4. Se necesita urgentemente más investigación para desentrañar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes del accidente cerebrovascular isquémico, así como para facilitar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas al accidente cerebrovascular isquémico. El establecimiento de un modelo fiable y replicable del ictus isquémico es crucial para la investigación básica, así como para la posterior investigación traslacional en el campo del ictus isquémico.

En 1981, Tamura et al. desarrollaron un modelo de isquemia cerebral focal mediante el empleo de electrocoagulación transcraneal en el sitio proximal de la arteria cerebral media (ACM)5. Desde entonces, numerosos investigadores han utilizado diversas metodologías como la ligadura, la compresión o el clipaje para inducir la oclusión distal del ACM (dMCAO) para establecer modelos de ictus isquémico transitorio o permanente 6,7,8. En comparación con el modelo de filamento, el modelo dMCAO presenta ventajas notables, como un menor tamaño del infarto y una mayor tasa de supervivencia, lo que lo hace más adecuado para investigar la recuperación funcional a largo plazo tras el ictus isquémico9. Además, el modelo dMCAO demuestra una mayor tasa de supervivencia en roedores envejecidos en comparación con el modelo de filamento, lo que lo convierte en una herramienta ventajosa para investigar el accidente cerebrovascular isquémico en modelos animales ancianos y comórbidos10. Se ha demostrado que el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico (TP) posee las características de menor invasividad quirúrgica y una tasa de mortalidad significativamente baja. Sin embargo, el modelo de TP presenta un mayor grado de necrosis celular y edema tisular en comparación con el modelo dMCAO, lo que lleva a la ausencia de circulación colateral11. Además, cabe destacar que las lesiones isquémicas observadas en el modelo de TP provienen predominantemente de la oclusión microvascular, que difiere sustancialmente de la isquemia cerebral inducida por embolia de grandes vasos en el modelo dMCAO12.

En este trabajo, presentamos la metodología para inducir el modelo murino de dMCAO mediante la coagulación del ACM distal mediante craneotomía con ventana ósea pequeña. Además, realizamos exámenes histológicos y evaluaciones conductuales para caracterizar de manera integral las lesiones isquémicas y los resultados de accidentes cerebrovasculares en este modelo experimental. Nuestro objetivo es familiarizar a los investigadores con este modelo y facilitar futuras investigaciones sobre los mecanismos patológicos del accidente cerebrovascular isquémico.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jianghan y se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices Éticas en Animales de Experimentación emitidas por el Centro para el Control de Enfermedades de China. En este protocolo se utilizaron ratones machos adultos C57BL/6J, de 10 semanas de edad, con un peso de 24-26 g. Todos los ratones fueron alojados bajo un ambiente controlado de ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con comida y agua ad libitum.

1. Preparación preoperatoria

NOTA: Los instrumentos y equipos clave necesarios para este protocolo se muestran en la Figura 1.

  1. Antes del procedimiento, esterilice los instrumentos quirúrgicos mediante autoclave.
  2. Administrar meloxicam por vía subcutánea a una dosis de 5 mg/kg para analgesia 60 min antes de la cirugía.
  3. Anestesiar al ratón con isoflurano al 5% en una cámara de inducción.
  4. Limpie la placa de cirugía de calefacción con etanol al 75% y active el interruptor de calefacción con la temperatura ajustada a 37 °C. A continuación, coloque el ratón en una posición lateral izquierda en el tablero, con la cabeza alejada del cirujano y la cola mirando hacia el cirujano.
  5. Coloque una mascarilla en la cara del ratón que proporcione un suministro constante de isoflurano al 2% y 0,3 L/min de oxígeno para la anestesia de mantenimiento. Aplique el ungüento ocular sobre la córnea para protegerla de la sequedad durante el procedimiento.
  6. Afeita el pelaje desde la órbita izquierda hasta el canal auditivo izquierdo con una afeitadora. Use cremas depilatorias para eliminar el pelaje restante para la esterilización.
  7. Preparar el área quirúrgica aplicando povidona yodada desinfectante y etanol al 75% tres veces.

2. Modelo MCAO distal

  1. Compruebe si el ratón está profundamente anestesiado evaluando los reflejos del pellizco del dedo del pie.
  2. Haga una incisión vertical entre la órbita izquierda y el canal auditivo izquierdo con una hoja de bisturí estéril.
  3. Retraiga el tejido blando de la piel con retractores y exponga el músculo temporal.
  4. Use micropinzas rectas para separar los segmentos apical y dorsal del músculo temporal del cráneo.
  5. Identifique la bifurcación del MCA, que asume una forma de "Y" debajo del hueso temporal con un sesgo hacia la base del cráneo (Figura 2A).
    NOTA: Si la bifurcación de la MCA no es visualmente discernible (debido a una variación anatómicamente normal), determine cuál es el vaso más rostral.
  6. Utilice un taladro craneal eléctrico para adelgazar el cráneo y hacer una ventana ósea (4 mm de diámetro) hasta que la duramadre, con su textura translúcida, se haga visible.
    NOTA: Agregue intermitentemente gotas de solución salina normal al cráneo para evitar el sobrecalentamiento durante este proceso.
  7. Retire la duramadre por encima de la arteria con micropinzas curvas para exponer la rama del ACM.
  8. Ajuste el electrocauterio a 7 W. Coagule la arteria con las pinzas eléctricas de coagulación en los sitios proximal y distal a la bifurcación de MCA (Figura 2A). Cuando la bifurcación no es visible debido a una variación anatómica, realice la coagulación en la rama de MCA identificada con precisión (como se mencionó anteriormente) en dos ubicaciones separadas aproximadamente 1 mm por13.
  9. Controle el flujo sanguíneo de la rama cortical izquierda de MCA utilizando un medidor de flujo sanguíneo de moteado láser.
    NOTA: Se excluyeron del estudio los ratones que mostraron una reducción del flujo sanguíneo de menos del 40% del valor basal después de la electrocoagulación.
  10. Suturar el músculo y la piel por separado utilizando suturas de ácido poliglicólico 5-0. Aplique gel de diclofenaco sódico y ungüento de mupirocina en la incisión cutánea con un hisopo de algodón estéril.
  11. Coloque el mouse en una cámara de recuperación. Monitoree a todos los ratones hasta que estén completamente despiertos. Administre meloxicam (5 mg/kg, SC) para la analgesia cada 24 h hasta 72 h.

3. Operación simulada

  1. Reproducir el mismo procedimiento que los mencionados anteriormente, excluyendo el proceso de coagulación arterial.

4. Pruebas de comportamiento

NOTA: Antes del dMCAO, los ratones se sometieron a entrenamiento conductual dos veces al día durante 3 días. En eltercer día después de la dMCAO, traslade los ratones a la sala de pruebas de comportamiento para una adaptación ambiental de 2 horas antes de la prueba.

  1. Prueba de fuerza de agarre14
    NOTA: El medidor de fuerza de agarre consta de una galga extensométrica de empuje y tracción y una barra horizontal de metal.
    1. Agarra la base de la cola del ratón. Baje gradualmente el mouse hacia la barra de agarre de metal hasta que agarre la barra horizontal con ambas patas delanteras (Figura 2B).
    2. Tire del ratón hacia atrás a una velocidad constante de unos 2 cm/s y mantenga su cuerpo horizontal.
    3. Registre la fuerza máxima en gramos (g) cuando el ratón suelta sus patas delanteras de la barra.
  2. Prueba de la pértiga15
    1. Coloque al ratón en la parte superior de un poste vertical de madera (50 cm de alto, 1 cm de diámetro) con la cabeza hacia arriba y permítale bajar del poste (Figura 2B).
    2. Registre el tiempo que tarda el ratón en dar la vuelta (T-turn) y el tiempo total que tarda en bajar del poste (T-total) con un tiempo de corte de 60 s.
  3. Prueba de extracción de cinta adhesiva16
    1. Sostenga el ratón y fije un parche de cinta adhesiva (2 × 2 mm) en la pata delantera derecha del ratón (Figura 2B).
    2. Vuelve a colocar al ratón en la jaula de cría y deja que se mueva libremente.
    3. Registre el tiempo que tarda el ratón en eliminar el adhesivo con un límite de 60 s.
  4. Prueba de cilindros17
    1. Coloque el ratón en un cilindro abierto de vidrio transparente (diámetro: 14 cm; altura: 20 cm) y registre su comportamiento exploratorio espontáneo de pie durante 3 minutos con una cámara (Figura 2B).
      NOTA: Durante el procedimiento experimental, se colocaron dos espejos a lo largo del cilindro para garantizar un registro óptimo de los movimientos de las extremidades anteriores.
    2. Limpie el cilindro con etanol al 75% para eliminar las señales olfativas residuales antes de probar el mouse posterior.
    3. Reduzca la velocidad de reproducción del video a 1/5 de la velocidad real y cuente el número de toques en la pared con la pata delantera izquierda (L) o derecha (R) o el uso simultáneo de ambas patas delanteras (B). Calcule la tasa de uso de la pata delantera derecha como (L-R)/(L + R + B) × 100%.

5. Perfusión y preparación de la muestra

  1. Eutanasia del ratón por inyección peritoneal, sobredosis de pentobarbital (300 mg/kg). Coloque al ratón en posición supina e inmovilice las extremidades.
  2. Haga una incisión en la línea media de la piel, comenzando desde la cavidad abdominal media y extendiéndose hacia la región superior del tórax.
  3. Abra el tórax con unas tijeras quirúrgicas y doble el xifoides hacia arriba con un hemostático. Retire con cuidado el pulmón y el diafragma para exponer el corazón.
  4. Inserte la punta de la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo y perfore la aurícula derecha con unas tijeras. Perfundir el corazón con 20 mL de solución salina normal a través del ventrículo izquierdo.
  5. Decapita al ratón y corta el cuero cabelludo a lo largo de la línea media entre los ojos. Corta el hueso a lo largo de ambos lados, comenzando desde la base del cráneo y abriéndose hasta la cuenca del ojo.
  6. Levante el cráneo y separe suavemente el cerebro de la base del cráneo con una pinza.
    NOTA: Los cerebros de la mitad de los ratones se sometieron a una tinción de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC), mientras que los cerebros de la otra mitad se sometieron a un examen histológico.
  7. Remoje los cerebros en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche para un análisis histológico de seguimiento.

6. Identificación del volumen del infarto

  1. Coloque el cerebro en un compartimento congelador de -20 °C del refrigerador durante 20 minutos.
  2. Coloque el cerebro en la matriz cerebral de 1 mm y corte el cerebro en secciones coronarias con un grosor de 2 mm utilizando cuchillas de micrótomo.
  3. Transfiera las secciones de cerebro a una placa de cultivo de 24 pocillos y agregue un 2% de TTC para cubrir el tejido cerebral. Coloque la placa de cultivo de 24 pocillos en un horno de temperatura constante durante 30 minutos con la temperatura ajustada a 37 °C.
  4. Levante con cuidado las secciones del cerebro y fíjelas en una solución de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos.
  5. Realice un escaneo óptico de estas secciones cerebrales con una resolución de 1200 x 1200 ppp mediante un escaneo.
  6. Mida el volumen del infarto cerebral sumando el área del infarto de cada sección (área del hemisferio derecho menos el área no lesionada del hemisferio izquierdo) utilizando el software Image J (https://imagej.net/software/imagej/index)18. Calcule el porcentaje de volumen de infarto como volumen de infarto/volumen del hemisferio derecho × 100%.

7. Análisis histopatológico y de tinción inmunofluorescente

  1. Tome las muestras de cerebro de la solución de paraformaldehído y enjuáguelas con agua corriente durante 1 h.
  2. Transfiera las muestras de cerebro a la máquina de deshidratación de tejidos automatizada. Inicie el programa preestablecido para la deshidratación, la vitrificación y la inmersión en cera. Incruste las muestras de cerebro deshidratado en parafina y córtelas en secciones de 5 μm de grosor con un micrótomo.
  3. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)
    1. Desparafinar las secciones con xileno 3 veces durante 8 minutos cada una.
    2. Rehidratar las secciones sumergiéndolas sucesivamente en etanol de gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) y agua destilada durante 5 min cada vez.
    3. Teñir las secciones con la solución de hematoxilina durante 5 min.
    4. Enjuague las secciones con agua destilada para lavar el residuo de hematoxilina, luego sumérjalas en alcohol de ácido clorhídrico al 5% para una diferenciación de 5 s. Lavar las secciones con agua destilada durante 2 min.
    5. Teñir las secciones con una solución de eosina durante 30 s y enjuagar el exceso de líquido manchante con agua destilada.
    6. Sumerja las secciones en etanol al 90%, etanol al 95%, etanol al 100% y xileno (2 veces) sucesivamente durante 5 minutos cada vez. Monte las secciones con un medio de montaje de bálsamo neutro.
  4. Tinción de inmunofluorescencia
    1. Desparafinar las secciones con xileno 3 veces durante 8 minutos cada vez.
    2. Rehidratar las secciones sumergiéndolas sucesivamente en etanol de gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) y agua destilada durante 5 min cada vez.
    3. Precaliente la solución de recuperación de antígeno de citrato para hervir en el microondas. Sumerja las secciones en la solución de recuperación de antígenos. Vuelva a calentar el tampón de recuperación de antígenos con baja potencia (20 W) durante 20 min.
    4. Apague el microondas y deje que el tampón de recuperación de antígenos se enfríe a temperatura ambiente (RT).
    5. Lave las secciones tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 0,1 mM durante 5 minutos cada vez.
    6. Incubar las secciones con una solución bloqueante (5% de albúmina sérica bovina) a RT durante 1 h para bloquear la unión inespecífica de la inmunoglobulina.
    7. Incubar las secciones con anticuerpo anti-NeuN de conejo (1:300), anticuerpo anti-Iba-1 de conejo (1:500) y anticuerpo anti-GFAP de ratón (1:500) a 4 °C durante la noche.
    8. Lave las secciones tres veces con 0,1 mM de PBS durante 5 minutos cada vez.
    9. Incubar las secciones con IgG conjugada Alexa 594 anti-conejo de cabra (1:500) o Alexa 488-conjugada de cabra (1:500) durante 1 h en RT.
    10. Lave las secciones con 0,1 mM de PBS y móntelas con un medio de montaje antidecoloración que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    11. Tome imágenes de tres campos microscópicos (300 μm × 300 μm) dentro de la penumbra isquémica utilizando un microscopio fluorescente a 594 nm y 488 nm, respectivamente.
    12. Utilizando el software ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), estime la densidad celular teñida positivamente promediando los recuentos en penumbra isquémica19.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los instrumentos clave utilizados para realizar el dMCAO son el conjunto de instrumentos microquirúrgicos, el vaporizador de isoflurano y el generador de electrocoagulación microquirúrgica monopolar que se muestra en la Figura 1. El procedimiento experimental de este estudio se ilustra en la Figura 2. En resumen, se empleó una pequeña craneotomía de ventana ósea para exponer el ACM distal, que posteriormente se coaguló para inducir isquemia cerebral focal perman...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el protocolo actual del modelo de electrocoagulación craneotomía dMCAO, los procedimientos quirúrgicos se realizan con una invasividad mínima, en la que solo se separa una porción del músculo temporal para mitigar los efectos adversos sobre la función masticatoria. Todos los ratones se recuperaron bien después del procedimiento, sin que se observaran casos de dificultades para alimentarse. El ACM se puede discernir fácilmente en el hueso temporal del ratón, lo que facilita la identificación precisa de las ubicaciones ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio contó con el apoyo de las subvenciones de la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de la provincia de Hubei (2022CFC057).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio
(TTC)		Sigma-Aldrich108380Colorante para tinción de TTC
Placa de cultivo de 24 pocillosCorning (EE. UU.)CLS3527Recipiente para tinción
de TTC con paraformaldehído al 4%Wuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1101Fijación de tejidos
5% albúmina sérica bovinaWuhan BOSTER Bio Co., Ltd.AR004Bloqueo de antígeno inespecífico
5-0 Sutura de ácido poliglicólicoJinhuan Medical Co., LtdKCR531Material para cirugía
Máquina de anestesiaMidmark CorporationVMRAnimal anestesiado
Medio de montaje antidecoloraciónBeyotime BiotechP0131Sello para tinción de IF
Automatización-deshidratación de tejidos 
máquina		Leica Biosystems (Alemania)TP1020Tejido deshidratado
Crema depilatoriaVeet (Francia)20220328Material para cirugía
Diclofenaco  sodio  gelWuhan Ma Yinglong Pharmaceutical
 Co., Ltd.		H10950214Analgesia para animales
Punta de broca (0,8 mm)Rwd Life Science Co., Ltd.Equipo para cirugía
Solución de tinción de eosinaWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1001Tinte para H& Tinción E
Ungüento para los ojosGuangzhou Pharmaceutical Co., LtdH44023098Material para cirugía
Microscopio de fluorescenciaOlympus (Japón)BX51Adquisición de imágenes
GFAP Anticuerpo monoclonal de ratónCell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, EE. UU.)		3670Anticuerpo primario para la tinción de FI
Cabra anti-ratón Alexa
488-IgG conjugada		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, EE. UU.)		4408Segundo anticuerpo para tinción de IF
Cabra anti-conejo Alexa
594-conjugado IgG		Cell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, EE. UU.)		8889Segundo anticuerpo para tinción de FI
Medidor de fuerza de agarreShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.XR501Equipo para prueba de comportamiento
Solución de tinción de hematoxilinaWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd.		G1004Tinte para H& Tinción E
Iba1 Anticuerpo monoclonal de conejoAbcamab178846Anticuerpo primario para la tinción de FI
IsofluranoRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10Medidor
flujo sanguíneo láser dopplerMoor Instruments (Reino Unido)moorVMS Monitoreo delflujo sanguíneo
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020 Analgesia para animales
MicrodrillRwd Life Science Co., Ltd.78001Equipo para cirugía
Juego de instrumentos microquirúrgicosRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-REquipo para cirugía
MicrotomoThermo Fisher Scientific (EE. UU.)HM325Producción de secciones de tejido
Cuchilla de micrótomoLeica Biosystems (Alemania)819Producción de secciones de tejido
Generador de electrocoagulación monopolarSpring Scenery Medical Instrument
Co., Ltd.		CZ0001Equipo para cirugía
Pomada de mupirocinaTianjin Smith Kline & Laboratorios French
Ltd.		H10930064Antiinfección para animales
Anticuerpo monoclonal NeuN RabbitCell Signaling Technology Inc.
(Danvers, MA, EE. UU.)		24307Anticuerpo primario para la tinción de FI
Bálsamo neutroAbsenta Bioscienceabs9177Sello para H& E tinción
de inclusión de parafinaThermo Fisher Scientific (EE. UU.)EC 350Producir bloques de parafina
Pentobarbital sódicoSigma-AldrichP3761Animal eutanasiático
Solución salina tamponada con fosfatoShanghai Beyotime Biotech Co., LtdC0221AEnjuague para la sección de pañuelos
AfeitadoraShenzhen Codos Electrical Appliances
Co.,Ltd.		CP-9200Equipo para cirugía
Solución de citrato de sodioShanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.P0083Recuperación de antígeno para tinción de FI
de para animales anestesiados Centro

Referencias

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