Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon

Shuyuan Wang; Haiyan Xiong; Qiyuan Chang; Xudong Zhuang; Yaochen Wu; Xinrui Wang; Congxian Wu; Zhifei Fu

doi:10.3791/66141

Artículo de método

Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon

DOI:

10.3791/66141

⸱

12 de enero de 2024

Shuyuan Wang^*¹ , Haiyan Xiong^*¹^,² , Qiyuan Chang^*¹^,³ , Xudong Zhuang^*⁴^,⁵^,⁶ , Yaochen Wu¹^,³ , Xinrui Wang⁴^,⁵^,⁶ , Congxian Wu¹ , Zhifei Fu¹^,⁷^,⁸

¹Public Technology Service Center, Fujian Medical University, ²The School of Pharmacy, Fujian Medical University, ³The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, ⁴College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, ⁵Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁶NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁷Institute of Neuroscience, Fujian Medical University, ⁸Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo detallado para la microscopía correlativa de luz y electrónica posterior a la inclusión de Epon utilizando una proteína fluorescente llamada mScarlet. Este método puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Esta técnica es susceptible de una amplia variedad de aplicaciones biológicas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) es una microscopía integral que combina la información de localización proporcionada por la microscopía de fluorescencia (FM) y el contexto de la ultraestructura celular adquirida por la microscopía electrónica (EM). CLEM es un compromiso entre fluorescencia y ultraestructura y, por lo general, la ultraestructura compromete la fluorescencia. En comparación con otras resinas de inclusión hidrofílicas, como el metacrilato de glicidilo, HM20 o K4M, Epon es superior en propiedades de conservación y seccionamiento de la ultraestructura. Anteriormente, habíamos demostrado que mEosEM puede sobrevivir a la fijación de tetróxido de osmio y a la inclusión de Epon. Usando mEosEM, logramos, por primera vez, Epon post embeding CLEM, que mantiene la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Aquí, proporcionamos detalles paso a paso sobre la preparación de la muestra EM, las imágenes FM, las imágenes EM y la alineación de la imagen. También mejoramos los procedimientos para identificar la misma célula fotografiada por imágenes FM durante la imagen EM y detallamos el registro entre las imágenes FM y EM. Creemos que se puede lograr fácilmente la microscopía electrónica y de luz correlativa posterior a la inclusión de Epon siguiendo este nuevo protocolo en instalaciones EM tradicionales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía de fluorescencia (FM) se puede utilizar para obtener la localización y distribución de la proteína diana. Sin embargo, se pierde el contexto que rodea a la proteína diana, lo cual es crucial para investigar a fondo la proteína diana. La microscopía electrónica (EM) tiene la resolución de imagen más alta y proporciona varios detalles subcelulares. Sin embargo, EM carece de etiquetado de objetivos. Al fusionar con precisión la imagen de fluorescencia tomada por FM con la imagen gris adquirida por EM, la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) puede combinar la información obtenida por estos dos modos de imagen 1,2,3,4.

CLEM es un compromiso entre la fluorescencia y la ultraestructura¹. Debido a las limitaciones de las proteínas fluorescentes actuales y a los procedimientos tradicionales de preparación de muestras EM, especialmente el uso de ácido ósmico (OsO₄) y resinas hidrofóbicas como el Epon, la ultraestructura siempre compromete la fluorescencia⁵. OsO₄ es un reactivo indispensable en la preparación de muestras EM, que se utiliza para mejorar el contraste de las imágenes EM. En comparación con otras resinas de incrustación, Epon es superior en propiedades de conservación y seccionamiento de la ultraestructura⁵. Sin embargo, ninguna proteína fluorescente puede retener la señal de fluorescencia después del tratamiento de OsO₄ y Epon embedding⁶. Para superar las limitaciones de las proteínas fluorescentes, se desarrolló el CLEM de pre-inclusión, en el que se realizan imágenes de FM antes de la preparación de la muestra EM⁶. Sin embargo, el inconveniente de la preincrustación de CLEM es el registro impreciso entre las imágenes FM y EM⁵.

Por el contrario, el método CLEM posterior a la inclusión realiza la obtención de imágenes FM después de la preparación de la muestra EM, cuya precisión de registro puede alcanzar los 6-7 nm ^5,6. Para retener la fluorescencia de las proteínas fluorescentes, se han utilizado concentraciones muy bajas de OsO₄ (0,001%)³ o los métodos de preparación de EM congelados a alta presión (HPF) y de sustitución por congelación (FS) ^4,7 a expensas de la ultraestructura comprometida o del contraste de la imagen EM. El desarrollo de mEos4b promueve en gran medida el progreso del CLEM posterior a la inclusión, aunque el metacrilato de glicidil se utiliza como resina de inclusión⁵. Con el desarrollo de mEosEM, que puede sobrevivir a la tinción de OsO₄ y a la inclusión de Epon, se logró por primera vez el CLEM de superresolución posterior a la incrustación de Epon, manteniendo la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente⁶. Después de mEosEM, se desarrollaron varias proteínas fluorescentes que pueden sobrevivir a la tinción de OsO₄y a la inclusión de Epon 8,9,10,11. Esto promueve en gran medida el desarrollo de CLEM.

Hay tres aspectos clave en el CLEM posterior a la incrustación de Epon. La primera es la proteína fluorescente, que debe mantener la señal fluorescente después de la preparación de la muestra EM. De acuerdo con nuestra experiencia, mScarlet es superior a otras proteínas fluorescentes reportadas. La segunda es cómo encontrar la misma célula de la que se obtienen imágenes de FM en imágenes de EM. Para resolver este problema, mejoramos el procedimiento para este paso para que uno pueda encontrar fácilmente la célula objetivo. El último es el método para alinear la imagen FM con la imagen EM. A continuación, detallamos el registro entre las imágenes FM y EM. En este protocolo, expresamos mScarlet en neuronas VGLUT2 y demostramos que mScarlet puede dirigirse a los lisosomas secundarios utilizando Epon post-inclusión de CLEM. Proporcionamos detalles paso a paso para el CLEM posterior a la inclusión de Epon, sin comprometer la fluorescencia y la ultraestructura.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cría de animales y los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad Médica de Fujian. El flujo de trabajo paso a paso del protocolo actual se muestra en la Figura 1.

1. Preparación de la muestra

Cerebro de ratón
1. Compre ratones transgénicos (ver Tabla de Materiales) y cebadores de oligonucleótidos (ver Tabla de Materiales) para genotipar a estos ratones.
2. Perfundir y extraer el cerebro intacto de la bóveda craneal siguiendo el protocolo previamente publicado^12,13.
3. Fije el cerebro del ratón con 10 ml de solución fijadora (ver Tabla de materiales) a 4 °C durante la noche.
4. Enjuague la solución fijadora durante 3 x 10 min con tampón fosfato (PB) 0,1 M.
5. Corta el cerebro del ratón en secciones de 500 μm de grosor utilizando un micrótomo oscilante (ver Tabla de materiales).
6. Corta las regiones fluorescentes en pequeños bloques con un bisturí usando un microscopio estereoscópico (ver Tabla de Materiales).
  NOTA: El volumen de los bloques pequeños no debe ser superior a 1 mm³.
Células cultivadas
1. Siembre las células HeLa en placas de cultivo celular de 6 cm y manténgalas en un medio de crecimiento (medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] bajo en glucosa, suplementado con suero fetal bovino [FBS]).
2. Al día siguiente, transfecte los plásmidos que contienen mScarlet en células utilizando el reactivo de transfección de ADN (consulte la Tabla de materiales) siguiendo el libro de instrucciones del kit de transfección.
3. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, tripsinizar las células transfectadas y centrifugarlas para obtener gránulos celulares a 1.000 × g. Los gránulos celulares se denominan bloques de muestra.

2. Preparación de la muestra EM

Fijación
1. Fije los bloques de muestra con una solución fijadora (véase la tabla de materiales) a 4 °C durante la noche.
2. Retire la solución fijadora y enjuague la solución fijadora durante 3 x 10 min con PB 0,1 M de los bloques de muestra.
Tinción con tetróxido de osmio (OsO₄)
1. Fijar los bloques de muestra con una solución de OsO₄ (ver Tabla de Materiales) a 4 °C durante 1 h.
2. Retire la solución de OsO₄ y enjuague la solución de OsO₄ 3 x 10 min con ddH₂O de los bloques de muestra.
Tinción de acetato de uranilo (UA)
1. Tiñir los bloques de muestra con una solución de UA al 2% (ver Tabla de Materiales) a 4 °C durante 1 h.
2. Retire la solución de UA y enjuague los bloques de muestra con ddH₂O durante 3 x 10 min.
Deshidratación por gradiente
1. Deshidratar los bloques de muestra con etanol de gradiente de la siguiente manera: 50% durante 10 min, 70% durante 10 min, 80% durante 10 min, 90% durante 10 min y 2 x 10 min en etanol al 100%.
2. Deshidratar los bloques de muestra con acetona anhidra durante 3 x 10 min.
Infiltración de resina
1. Infiltrar los bloques de muestra con resina de gradiente (ver Tabla de Materiales): acetona a resina 3:1 durante 1 h, acetona a resina 1:1 durante 2 h, acetona a resina 1:3 durante 3 h.
2. Sustituir por la resina pura durante 3 x 12 h.
Incrustación de resina
1. Transfiera los bloques de muestra a cápsulas (consulte la Tabla de materiales) con un palillo.
2. Añadir resina pura a la cápsula que contiene el bloque de muestra y polimerizar la resina en el horno a 60 °C durante 14-16 h.

3. Recubrimiento del cubreobjetos con nanopartículas de oro

Limpieza de cubrevidrios
1. Lave los cubreobjetos con tampón de limpieza (consulte la tabla de materiales) durante 2 h a 142 °C.
2. Enjuague el tampón de limpieza 3 x 10 min con ddH₂O.
3. Transfiera los cubreobjetos con cuidado a un vaso de precipitados que contenga alcohol etílico anhidro e incube durante la noche.
4. Seque al aire los cubreobjetos en un banco limpio durante varios minutos.
Cubre los cubreobjetos con nanopartículas de oro.
1. Fije un portaobjetos de vidrio en el centro de la rotación de una centrífuga de escritorio (consulte la Tabla de materiales) con cemento de vidrio.
2. Monta un cubreobjetos en el centro del portaobjetos de vidrio usando notas adhesivas.
3. Añadir 75 μL de pioloformo al 1% (ver Tabla de Materiales) en el cubreobjetos.
  NOTA: También probamos Formvar (ver Tabla de Materiales) y funciona bien.
4. Centrifugar durante 3 min a 1.360 × g (Figura 2A) para producir una fina capa de pioloformo en la superficie del cubreobjetos.
5. Incubar la superficie del cubreobjetos con 250 μL de poli-L-lisina al 0,1 % (véase la tabla de materiales) durante 1 h a temperatura ambiente (Figura 2B).
6. Enjuague con ddH₂O y seque al aire el cubreobjetos durante varios minutos.
7. Diluir nanopartículas de oro de 80 nm (ver Tabla de Materiales) con ddH₂O al 25% (v/v, OD₆₀₀ = 0.07) (ver Tabla de Materiales) y sonicar durante 15 min.
8. Incubar la superficie del cubreobjetos con las nanopartículas de oro diluidas durante 1 h a temperatura ambiente (Figura 2C).
9. Enjuague con ddH₂O y seque al aire el cubreobjetos durante varios minutos.
  NOTA: Funciona bien 2 semanas después de ser recubierto con pioloformo y nanopartículas de oro. Pero recomendamos usarlo inmediatamente después de recubrirlo.

4. Corte ultrafino

Recorte la superficie del bloque de muestra en un trapecio en ángulo recto. Corte secciones con un espesor de 100 nm con un cuchillo de diamante (ver Tabla de Materiales) con un ultramicrótomo (ver Tabla de Materiales). Separe una sola sección de la banda de sección y haga flotar la sección individual en el baño de agua.
Agregue una gota de ddH₂O en el centro del cubreobjetos recubierto de nanopartículas de oro. Tome una sección usando un bucle de muestra e invierta el bucle de muestra en la superficie de la gota de agua. Retire el bucle de muestra, dejando la sección en la superficie de la gota de agua.
Seque al aire el cubreobjetos durante varios minutos. Dibuja un anillo alrededor de la sección en el lado opuesto del cubreobjetos con un rotulador.

5. Imágenes de microscopía óptica

Recuperación de fluorescencia
NOTA: El flujo de trabajo se muestra en la Figura 3A.
1. Agregue 10 μL de tampón de montaje (consulte la tabla de materiales) en la sección ultradelgada del cubreobjetos. Coloque un nuevo cubreobjetos limpio en el tampón de montaje.
  NOTA: El componente clave del tampón de montaje es DABCO, que se utiliza para recuperar la fluorescencia de las proteínas fluorescentes. Esto es muy importante para la recuperación de la fluorescencia.
2. Coloque estos dos cubreobjetos junto con la sección ultradelgada en una cámara de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que el cubreobjetos con el anillo dibujado esté en la parte superior.
Recopile el mapa de navegación.
1. Encuentre la sección usando el anillo dibujado como marcador en el modo de imagen de campo claro de un microscopio de fluorescencia invertida (ver Tabla de Materiales). Muévase a una esquina de la sección. Encienda la luz blanca y tome la imagen de campo claro.
2. Apaga la luz blanca. Encienda el láser (561 nm) y tome imágenes fluorescentes del mismo campo de visión (FOV).
3. Apague el láser. Muévase al campo de visión adyacente, asegurándose de que estos dos campos de visión tengan una superposición del 10%. Tome la imagen de campo claro y la imagen fluorescente del segundo campo de visión.
4. Repita esta operación hasta cubrir toda la sección. Registre la ruta de imagen que se puede utilizar para unir el campo de visión.
  NOTA: Para una mayor calidad de la imagen, recomendamos utilizar el microscopio confocal.
Imágenes de celdas de interés.
1. Utilice el mapa de navegación para apuntar fácilmente a las celdas de interés. Encienda el láser (561 nm) y tome 300 fotogramas de imágenes fluorescentes de la célula de interés. Apague el láser.
2. Encienda la luz blanca y tome imágenes secuenciales de campo claro (~100 fotogramas).
3. Muévase a otra celda de interés.

6. Preparación para la obtención de imágenes electromagnéticas

NOTA: El flujo de trabajo se muestra en la Figura 3B.

Transfiera la sección ultrafina a la rejilla de la ranura.
1. Llene un frasco de vidrio con ddH₂O.
2. Retire los cubreobjetos de la cámara y separe los dos cubreobjetos con unas pinzas. Sujete el cubreobjetos en el que se encuentra la sección, lave el tampón de montaje y seque al aire.
3. Marque un # alrededor de la sección ultradelgada con una cuchilla de un solo lado y deje caer 10 μL de ácido fluorhídrico al 12% (consulte la Tabla de materiales) en cada esquina del #. Coloque el cubreobjetos lentamente en el agua.
  NOTA: El ácido fluorhídrico reacciona con el vidrio, lo que facilita la eliminación de la película de pioloformo del vidrio de la cubierta. El ácido fluorhídrico es tóxico. Úselo en una capucha química con guantes. El contacto con la piel requiere atención médica inmediata.
4. Haga flotar la película de pioloformo y la sección ultradelgada en la superficie del agua juntas. Coloque una cuadrícula de ranura sin recubrimiento en la sección para capturar la sección en el centro de la cuadrícula.
5. Cubra un portaobjetos de vidrio con parafilm (ver Tabla de materiales) y recoja la rejilla con la película pioloform. Seque la rejilla al aire a temperatura ambiente.
Tinción de secciones
1. Tiñe la sección con un 2% de UA y la triple ventaja de Sato. Para obtener más detalles, consulte el protocolo² publicado anteriormente.

7. Análisis de imágenes

Cose el mapa de navegación.
1. Busque la ubicación de los datos sin procesar. Abra el software ImageJ (consulte Tabla de materiales) para unir el mapa de navegación.
2. Haga clic en Plugins | Costura | Costuras de cuadrícula/colección | (Tipo) Cuadrícula: serpiente por columna | (Orden) Arriba e izquierda (según la secuencia de disparo) | Establecer el tamaño de la rebanada | Seleccionar ruta de datos | Establecer el nombre del archivo | Marque Fusión de pantalla. Observe el resultado, que es un mapa de navegación compuesto por varias imágenes de campo claro de diferentes campos de visión.
3. Utilice el mismo método para unir un mapa de navegación de fluorescencia.
Combine las imágenes de campo claro con las imágenes de fluorescencia.
1. En el software ImageJ, haga clic en Archivo | Importación | Secuencia de imágenes para importar las imágenes secuenciales de campo claro de la celda de interés.
2. Haga clic en la imagen | Pilas | Proyección Z | Suma de cortes para obtener la imagen de proyección de suma intensidad (SIP) de las imágenes secuenciales de campo claro.
3. Haga clic en Editar | Invertir para invertir la imagen SIP del campo claro de modo que las señales de las nanopartículas de oro se conviertan en puntos blancos brillantes.
4. En ImageJ, haga clic en Archivo | Importación | Secuencia de imágenes para importar las imágenes FM secuenciales.
5. Haga clic en la imagen | Pilas | Proyección Z | Suma de sectores para obtener la imagen SIP de las imágenes FM secuenciales.
6. Haga clic en la imagen | Color | Fusionar canales para fusionar la imagen de campo claro SIP con la imagen SIP FM como una imagen compuesta.
7. Las nanopartículas de oro son verdes y la proteína fluorescente es roja. Haga clic en la imagen | Tipo | Color RGB para convertir el formato de la imagen compuesta a RGB.

8. Imágenes EM

Coloque la rejilla en la retención de muestras, manteniendo el lado de la sección de la rejilla hacia arriba.
Utilice el mapa de navegación para identificar aproximadamente la posición de las células correspondientes bajo un microscopio electrónico a través de cuatro distancias relativas a las cuatro esquinas diferentes del trapecio derecho de la sección ultrafina.
Confirme las células usando las nanopartículas de oro.
Tome imágenes EM a diferentes aumentos (4.200x, 6.000x u 8.200x) con un microscopio electrónico de transmisión (TEM) (consulte la Tabla de materiales).

9. Registro de la imagen FM con la imagen EM

Abra el software de registro (consulte la Tabla de materiales). Escriba easyCLEMv0¹⁴en la ventana de búsqueda. Haga clic en easyCLEMv0 para abrir easyCLEMv0. Haga clic en Imagen/Secuencia | Ábralo para importar la imagen EM y la imagen compuesta en el panel del software.
En la ventana EasyCLEMv0, haga clic en 2D (x,y,[T]) para elegir no rígido (2D o 3D) como modo de alineación.
En la ventana EasyCLEMv0, haga clic en el cuadro desplegable a la derecha de Seleccionar imagen que se transformará y cambiará de tamaño (probablemente FM) para elegir Compuesto (RGB)color.tif. A continuación, haz clic en el cuadro desplegable a la derecha de Seleccionar imagen que no se modificará (probablemente EM) para elegir EMimage. tif.
Haga clic en Iniciar para comenzar el registro.
En la ventana de la imagen EM llamada EMimage. tif, haga clic en una nanopartícula de oro para poner el punto 1 en la nanopartícula de oro. En la ventana de imagen FM llamada Composite (RGB)color.tif, haga clic en la nanopartícula de oro correspondiente para colocar el Punto 1 en la nanopartícula de oro.
Haga clic en Actualizar transformación para confirmar la señal LM con la señal EM de las nanopartículas de oro.
Repita la operación anterior en la ventana de imagen EM llamada EMimage. tif y haga coincidir la señal LM con la señal EM de la misma nanopartícula de oro una por una.
Haga clic en Detener para finalizar el registro.
Después de la alineación de la imagen, haga clic en Imagen superpuesta y haga clic en Imagen/Secuencia | Guardar como para exportar una pila de imágenes que contenga imágenes de cuatro canales (rojo, verde, azul y gris).
Abra ImageJ y haga clic en Archivo | Ábralo para importar la imagen superpuesta . Haga clic en la imagen | Pilas | Apilar en imágenes para separar la imagen superpuesta en imágenes de cuatro canales.
Haga clic en la imagen | Color | Fusionar canales para combinar imágenes de tres canales (rojo, verde y gris) en una imagen compuesta.
Haga clic en la imagen | Tipo | Color RGB para convertir la imagen compuesta en una imagen CLEM.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informes anteriores demostraron que mScarlet puede atacar el lisosoma¹⁵. En este protocolo, se inyectó AAV que expresa mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) en el M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) del cerebro de ratón Vglut2-ires-cre utilizando instrumentos estereotáxicos. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, la imagen final correlacionada se muestra en la Figura 4A. La imagen FM se puede alinear con precisión con la imagen EM utilizando nanopartículas de oro (los puntos verdes) como marcadores de referencia. Como se muestra en la imagen EM (Figura 4C, F), mScarlet se dirigió al lisosoma, y el contenido dentro de los lisosomas es heterogéneo, que son las características típicas del lisosoma secundario.

figure-results-1
Figura 1: Resumen esquemático de la microscopía óptica y electrónica correlativa. (A) Preparación del cerebro del ratón. Se inyectaron virus adenoasociados en el cerebro del ratón. Después de 30 días, las regiones fluorescentes de las rebanadas de cerebro de ratón se cortaron en pequeños bloques para la preparación de la muestra EM. (B) Preparación de muestras EM. (C) Sección ultrafina con un cuchillo de diamante y el diagrama esquemático del cubreobjetos. (D) Imágenes FM e imágenes TEM. Abreviaturas: EM = microscopía electrónica; FM = microscopía de fluorescencia; TEM = microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Recubrimiento de cubreobjetos con nanopartículas de oro. (A) Cubra el cubreobjetos con pioloformo por centrifugación. (B) Incubar la superficie del cubreobjetos con poli-L-lisina. (C) Incubar la superficie del cubreobjetos con las nanopartículas de oro diluidas. (D) Diagrama esquemático del cubreobjetos revestido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: El cronograma de preparativos para las imágenes de FM y EM. (A) El flujo de trabajo de las preparaciones para las imágenes de FM consta de cinco pasos: (i) recoger la sección ultrafina, (ii) secado al aire, (iii) colocar un segundo cubreobjetos después de agregar el tampón, (iv) fijar ambos cubreobjetos en la cámara e imágenes de FM. (B) El flujo de trabajo de las preparaciones para la obtención de imágenes EM también consta de cinco pasos: (i) separar los dos cubreobjetos, (ii) flotar la sección ultrafina, (iii) recoger la sección ultrafina, (iv) mover la sección ultrafina a la rejilla de ranuras y (v) obtener imágenes EM. Abreviaturas: EM = microscopía electrónica; FM = microscopía de fluorescencia; TEM = microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Imagen CLEM representativa de mScarlet. (A) La imagen CLEM de toda la neurona. (B,E) Las imágenes CLEM del recuadro. (C,F) Las imágenes EM del recuadro. (D,G) Las imágenes de fluorescencia del recuadro. Los puntos verdes indican nanopartículas de oro. Barra de escala = 5 μm (A), 1 μm (imágenes insertadas). Abreviaturas: EM = microscopía electrónica; FM = microscopía de fluorescencia; CLEM = microscopía correlativa de luz y electrónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo que aquí se presenta es un método de imagen versátil, que puede combinar la información de localización de la proteína diana de la microscopía óptica (LM) y el contexto que rodea a la proteína diana de la microscopía electrónica (EM)⁶. Con las limitaciones de las proteínas fluorescentes actuales, el método ampliamente utilizado es la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM), lo que significa que la imagen de LM se realiza antes de la preparación de la muestra EM. Casi todas las proteínas fluorescentes existentes pueden ser examinadas en CLEM pre-incrustación. Sin embargo, debido a las inevitables distorsiones y encogimientos, la alineación precisa de la imagen final es imposible⁶. Por lo tanto, la información proporcionada por la pre-inclusión de CLEM es para comprobar las ultraestructuras de la misma célula fotografiada por LM en imágenes EM.

El método proporcionado por este estudio es el CLEM posterior a la inclusión, en el que se realizan imágenes de LM después de la preparación de la muestra EM. La contracción causada por la fijación química en la preparación de la muestra EM no afecta a la alineación precisa de la imagen final. Además, debido a que tanto las imágenes LM como las imágenes EM se realizan en la misma sección y con la ayuda de nanopartículas de oro, la alineación final de la imagen puede ser muy precisa. El CLEM posterior a la inclusión requiere que las proteínas fluorescentes conserven una señal fluorescente después de la preparación convencional de la muestra EM. Anteriormente, habíamos reportado la primera proteína fluorescente llamada mEosEM, que puede retener señales fluorescentes usando Epon como resina de inclusión⁸. En comparación con otras resinas como resinas de inclusión, Epon tiene propiedades superiores de conservación y seccionamiento de la ultraestructura. Después de mEosEM, se han reportado otras proteínas fluorescentes resistentes que incorporan Epon, como mKate2^11,16, mCherry2^10,17, mWasabi ^10,18, CoGFPv0^10,19, mEosEM-E⁸, mScarlet ^8,20, mScarlet-I^8,20, mScarlet-H ^8,20 y HfYFP⁹.

Según nuestra experiencia, mScarlet es superior a otras proteínas fluorescentes. La solución fijadora puede afectar la fluorescencia de las proteínas fluorescentes. En general, la velocidad del procedimiento de fijación del paraformaldehído (PFA) es mucho más lenta que la del glutaraldehído (GA); por el contrario, el PFA penetra en la muestra más rápidamente que el AG más grande. Una mezcla de PFA y GA proporciona un equilibrio entre la fijación de la muestra lo suficientemente rápido como para que se mantenga su calidad, pero lo suficientemente lento como para que no se produzcan daños en la muestra, como la oxidación. La mayor concentración de AG producirá una mayor autofluorescencia. Según nuestra experiencia, la fluorescencia de mScarlet en bloque de resina se puede detectar 6 meses después de la polimerización. Sin embargo, recomendamos realizar la obtención de imágenes CLEM inmediatamente después de la polimerización.

Otro factor clave en la posterior incrustación de CLEM es cómo registrar la imagen LM con la imagen EM con precisión. Con base^{en los métodos} ^6,21 previamente reportados, se realizaron algunas modificaciones en el protocolo. La primera es cómo encontrar la misma célula de la que LM ha obtenido imágenes en imágenes electromagnéticas. Tomamos diferentes puntos de vista para unir el mapa de navegación de toda la sección ultradelgada usando DIC y modo de imágenes de fluorescencia. Utilizando el mapa de navegación, las celdas de interés podrían identificarse fácilmente. Otra mejora es la alineación precisa de la imagen. Anteriormente, utilizamos la señal fluorescente en el modo de imagen de fluorescencia y una señal de alto contraste de electrones en el modo de imagen EM de las nanopartículas de oro como marcadores de alineación fiducial⁶. Sin embargo, cuando se usó mScarlet, la señal fluorescente de mScarlet era mucho más alta que la señal fluorescente de las nanopartículas de oro y era difícil detectar la señal fluorescente de las nanopartículas de oro. Para resolver este problema, utilizamos la señal de campo claro de las nanopartículas de oro para el registro en lugar de la señal fluorescente. Siguiendo este protocolo modificado, fue fácil realizar CLEM posterior a la incrustación.

Sin embargo, existen algunas limitaciones del protocolo actual, que deben tenerse en cuenta antes de utilizarlo. Aunque funciona bien en el sistema de sobreexpresión, la fluorescencia es bastante débil si las proteínas diana están bajo su promotor nativo²². Otra limitación es que, aunque mScarlet es la mejor proteína fluorescente (según nuestra experiencia) que puede retener suficientes señales de fluorescencia después de la preparación de la muestra EM y funciona bien en células de mamíferos, será un problema cuando se utilice mScarlet como marca fluorescente en las neuronas, lo que puede conducir a la ubicación errónea de las proteínas diana¹⁵. En estos casos, sugerimos usar oScarlet¹⁵, una mutación de mScarlet, que funciona bien en las neuronas.

Las aplicaciones potenciales de este protocolo modificado se pueden dividir en dos categorías. La primera es acercarse al nivel subcelular, lo que significa estudiar la proteína diana en el contexto subcelular. En nuestros informes publicados anteriormente, utilizamos CLEM posterior a la inclusión para examinar la formación de compartimentos de ensamblaje de viriones citoplasmáticos (cVAC) durante la infección por un γ-herpesvirus²³. En futuras aplicaciones, el CLEM posterior a la inclusión se puede combinar con la tomografía electrónica para obtener la distribución 3D de las proteínas diana y resolver la estructura 3D de forma nativa²⁴. El segundo tipo de aplicación potencial es alejarse al nivel celular, lo que se puede utilizar para dibujar y analizar circuitos neuronales. Debido a su capacidad de alta resolución, la electromagnética se ha convertido en un medio eficaz para mapear las conexiones cerebrales finas. Sin embargo, la EM no puede proporcionar con precisión las identidades de las neuronas, lo que limita el análisis en profundidad del circuito neuronal. El CLEM posterior a la incrustación de Epon tiene el potencial de llevar las identidades de las neuronas al circuito neuronal sin comprometer las ultraestructuras.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este proyecto contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32201235 a Zhifei Fu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian, China (2022J01287 a Zhifei Fu), la Fundación de Investigación para Talentos Avanzados de la Universidad Médica de Fujian, China (XRCZX2021013 a Zhifei Fu), la Fundación de Ciencias Especiales de Finanzas de la Provincia de Fujian, China (22SCZZX002 a Zhifei Fu), Fundación del NHC, Laboratorio Clave de Evaluación Técnica de la Regulación de la Fertilidad para Primates No Humanos y Hospital de Salud Materno-Infantil de Fujian (2022-NHP-04 a Zhifei Fu). Agradecemos a Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin y Yan Hu del Centro de Servicios Públicos de Tecnología de la Universidad Médica de Fujian por su apoyo en la preparación de muestras de EM y la obtención de imágenes de EM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,2 M Tampón de fosfato (PB)			NaH2PO₄· 2H2O+Na₂HPO₄· 12H₂O
0,2 M Tris-Cl (pH 8,5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehído (GA)	Alfa Aesar	A17876	Producto químico peligroso
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetona	SCR	10000418
Hidróxido de amonio J	& K Scientific	335213
BioPhotoMeter D30	eppendorf
Tampón de limpieza de cubreobjetos			50 mL Hidróxido de amonio, 50 mL Peróxido de hidrógeno, 250 mL H₂O
Cubreobjetos	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Producto químico peligroso
DDSA	SPI empresa	GS02827	Producto químico peligroso
Centrífuga de sobremesa	WIGGENS	MINICEN 10E
Cuchillo de diamante	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Producto químico peligroso
reactivo de transfección de ADN	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Kit de Transfección
Epon 812	Empresa SPI	GS02659	Producto químico peligroso
	Etanol SCR	10009218
Fiji image J	Institutos Nacionales de Salud
Solución fijadora			4% PFA+0.25% GA+0.02 M
PB Formvar	Sigma	9823
Glicerol	SCR	10010618
Nanopartículas de oro	Corpuscular	790120-010
Resina			Acetona a resina 3:1, 1:1, 1:3
Ácido fluorhídrico	SCR	10011118
Peróxido de	hidrógenoSCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Cámara de imagen	Thermo Fisher	A7816
Cápsulas de gelatina grandes	Electrónica Microscopy Sciences	70117
Tampón			Mowiol 4-88, Glicerol, 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO₄ ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO₄ ž2H2O	SCR	20040718
empresa NMA	SPI	GS02828	Producto químico peligroso
Cebadores de oligonucleótidos	Takara Biomedical Technology (Pekín)		Se utilizaron tres cebadores de oligonucleótidos para detectar Vglut2-ires-Cre y de tipo salvaje simultáneamente. Los cebadores 5^,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3^, y 5^,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^, tenían como objetivo detectar Vglut2-ires-Cre. Los cebadores 5^,-CGGTACCACCAAAATCTTACGG-3^, y 5^,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3^, destinadas a detectar el tipo salvaje.
Microtomo oscilante	Leica	VT1000S
Tetróxido de osmio	SCR	L01210302	Solución
		OsO₄	1% Tetróxido de osmio+1,5% K₄Fe (CN)₆· 3H₂O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehído (PFA)	SCR	80096618	Producto químico peligroso
Tampón			4% PFA+0,1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Producto químico peligroso
Poly-L-lisina	Sigma	25986-63-0
Ferrocianuro de potasio (K₄Fe (CN)₆· 3H₂O)	SCR	10016818
Hojas de bisturí Merck		S2771
Mangos de bisturí	Merck	S2896-1EA
Microscopio estereoscópico	OLYMPUS	MVX10
Ratones transgénicos	Laboratorio		(cepa: 129S6/SvEvTac) se alojaron en condiciones estándar (25 ° C, un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con agua y comida ad libitum. Se utilizaron ratones machos y hembras a las 2 – 3 meses de edad, rango de peso 20-30 g.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solución (2% UA)			Solución acuosa
Ultramicrótomo	Leica	LEICA EM UC6
Acetato de uranilo (UA)	TED PELLA	19481	Producto químico peligroso

de gradiente de montaje química peligrosa de perfusión Los ratones Vglut2-ires-Cre del Jackson

Referencias

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Correlative Light Microscopy Electron Microscopy Epon Embedding Fluorescence Preservation Sample Preparation Mouse Brain Tissue Ultra Thin Section Image Registration Gold Nanoparticles Fluorescence Imaging

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