Evaluación de la toxicidad de los productos químicos mediante un sistema de detección de la respuesta al sobresalto por vibración del pez cebra

En los últimos años, el pez cebra se ha convertido en un organismo modelo muy popular para la evaluación de los efectos de los compuestos químicos, abarcando áreas de investigación que van desde el desarrollo de fármacos hasta la^{toxicología ambiental}. Como vertebrados, el pez cebra comparte muchos aspectos de su composición genética y fisiología general con los humanos ^2,3. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este modelo a menudo son directamente relevantes para la salud humana. Varios candidatos a fármacos actualmente en ensayos clínicos han sido identificados en cribados compuestos utilizando pez cebra⁴.

La evaluación de la toxicidad es una de las principales aplicaciones en las que las pruebas con estadios embrionarios de pez cebra son de interés. Existen varias directrices de ensayo de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) para el uso del pez cebra en los ensayos de toxicidad ambiental ^5,6. El pequeño tamaño y el rápido desarrollo de los embriones de pez cebra los hacen muy adecuados para los enfoques de cribado en una escala de rendimiento medio a alto ^1,3,4. Los criterios de valoración toxicológicos a los que se dirigen estos cribados incluyen las malformaciones embrionarias y la letalidad⁷, la disrupción endocrina⁸, la toxicidad orgánica⁹ y las evaluaciones conductuales indicativas de toxicidad neuronal^10,11. Los ensayos conductuales son posibles porque los embriones de pez cebra muestran varios tipos de respuestas locomotoras a diferentes estímulos dependiendo de su etapa de desarrollo. Por ejemplo, los embriones 1 día después de la fecundación (dpf) muestran un enrollamiento espontáneo de la cola¹² y responden a una secuencia de pulsos de luz con una secuencia típica de movimientos, la llamada respuesta fotomotora (PMR)¹⁰. Después de la eclosión, que suele ocurrir alrededor de 48-72 horas después de la fertilización (hpf), los eleuteroembriones que nadan libremente¹³ desarrollan gradualmente respuestas de sobresalto y escape a los estímulos vibratorios a partir de alrededor de 4 dpf¹⁴. Estas respuestas se caracterizan por una curvatura distintiva hacia la dirección opuesta a la dirección del estímulo (la llamada curva C o inicio en C), que es seguida por una contracurva más pequeña y un comportamiento de natación 14,15,16,17. En particular, los comportamientos embrionarios están gobernados por circuitos neuronales que utilizan varios sistemas de neurotransmisores, lo que permite sondear los efectos de los compuestos químicos dirigidos a estos sistemas. Por ejemplo, el ensayo PMR reveló los efectos de compuestos que interfieren con la señalización colinérgica, adrenérgica y dopaminérgica¹⁰, mientras que la respuesta de sobresalto involucra a las neuronas colinérgicas, glutamatérgicas y glicinérgicas ^16,18. Además, los compuestos que dañan los músculos o la interfaz neuromuscular también afectarán estos comportamientos, al igual que los compuestos tóxicos para las células ciliadas del oído interno/línea lateral^19,20. Por lo tanto, observar el comportamiento locomotor del pez cebra en respuesta a un estímulo es un medio adecuado para evaluar no solo la neurotoxicidad, sino también la ototoxicidad y la miotoxicidad. La puntuación del comportamiento locomotor también sirve como un indicador para la evaluación general de la toxicidad/letalidad, ya que los embriones muertos no se mueven. Por lo tanto, los comportamientos de locomoción embrionaria representan una lectura integradora para un enfoque de detección de toxicidad de primer nivel, que indica efectos letales y compuestos neuromusculares en una sola configuración. Dado que los eleuteroembriones ya son capaces de metabolizar compuestos, el abordaje también puede detectar los efectos de los productos de transformación metabólica ^7,21,22. Es importante destacar que los embriones de pez cebra no se consideran una etapa de vida protegida según algunas legislaciones de protección animal hasta la etapa de alimentación libre después de 120 hpf¹³. Por lo tanto, se consideran una alternativa a los ensayos de toxicidad en animales.

Figura 1: Configuración del sistema de respuesta a sobresaltos por vibración. (A) Descripción general del sistema. Las placas con embriones expuestos a los compuestos de prueba se colocan en el conjunto de transductores electrodinámicos ("altavoces"). La cámara se mueve secuencialmente mediante el accionamiento lineal accionado por correa hasta la posición de grabación por encima del transductor de destino. (B) Vista detallada del transductor/altavoz con placa de cultivo de tejidos insertada en la parte superior. Las placas están iluminadas desde abajo por una lámina de luz LED a 4000-5000 lux. Una luz LED junto al altavoz se enciende mientras se administra el estímulo. (C) Imagen fija de video grabada por la cámara sobre la estimulación de los embriones. (D) Captura de pantalla del archivo de configuración. (E) Captura de pantalla de la interfaz del software de grabación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, describimos un protocolo de prueba para la evaluación de los efectos de los compuestos en la respuesta de sobresalto por vibración utilizando un dispositivo de prueba simple construido internamente basado en estímulos de vibración generados por transductores electrodinámicos junto con una grabación de video automatizada de varios embriones que se mueven libremente en una placa de cultivo de tejidos²³. El sistema es modular y permite el registro secuencial de varias placas de cultivo de tejidos en paralelo. En la configuración utilizada actualmente, cinco transductores electrodinámicos proporcionan un estímulo vibracional (500 Hz, duración 1 ms) a las placas de cultivo de tejidos que contienen 20 embriones colocados encima de ellas (Figura 1). Las placas se iluminan desde abajo a 4000-5000 lux con láminas de luz LED. Una luz LED al lado de cada transductor indica los períodos de aplicación del estímulo, y un osciloscopio indica las formas de onda y la frecuencia del estímulo aplicado (para más detalles, consulte la Ref. 23). El comportamiento de los embriones es registrado por una cámara de alta velocidad (Tabla de Materiales) a 1000 fotogramas por segundo (fps), que se mueve por encima del altavoz objetivo mediante un accionamiento lineal accionado por correa. Esta velocidad de grabación es necesaria para resolver de forma fiable la respuesta de sobresalto. El sistema proporciona una alternativa de bajo costo y adaptable individualmente a los sistemas comerciales actuales. El flujo de trabajo preciso que se detalla a continuación se realiza actualmente en el marco de la iniciativa de Toxicología de Precisión²⁴ con el fin de determinar las condiciones de exposición adecuadas para la adquisición de datos OMICS de embriones de pez cebra tratados con un conjunto seleccionado de sustancias tóxicas.

Toda la cría y manipulación del pez cebra se realizó de acuerdo con las normas alemanas de protección animal y fue aprobada por el Gobierno de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemania (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).

1. Preparación de soluciones madre de productos químicos que se van a probar

1. Etiquete el frasco de vidrio (o la alícuota química) con el nombre/abreviatura del compuesto, la concentración de existencias y la fecha de preparación. Por ejemplo, CdCl₂_2.5 g· ^L-1_210813.
2. Centrifugar la alícuota química a 2000 x g durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
3. Bajo una campana extractora, pesar el compuesto (si es necesario) en una báscula sensible a 0,001 g y transferirlo al vial etiquetado. Si el compuesto es líquido, agréguelo al vial con una pipeta y una punta de pipeta de plástico.
   NOTA: Por ejemplo, para el caldo de metanosulfonato de tricaína utilizado en el ejemplo resultante que se muestra en la Figura 2, se pesaron 400 mg en el vial etiquetado.
4. Añada disolvente (p. ej., agua pura estéril o dimetilsulfóxido (DMSO), dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de los compuestos) utilizando una pipeta y una punta de pipeta de plástico. Si es posible, el agua es el disolvente preferido.
   NOTA: Por ejemplo, para el stock de tricaína, se preparó una solución de 15,3 mM en 100 mL de agua.
5. Selle el vial, agite suavemente y verifique si hay precipitaciones.
6. Prepare soluciones madre diluidas (si es necesario) en viales de vidrio utilizando pipetas y puntas de pipeta de plástico.
   NOTA: Por ejemplo, no fue necesaria una dilución adicional para el stock de tricaína.
7. Almacenar la(s) solución(es) madre(s) a -20 °C hasta su uso.
8. Almacene la alícuota química restante en las mismas condiciones que antes.
9. Registre la información de las alícuotas de existencias en el cuaderno de laboratorio.

2. Recolección y cría de embriones de pez cebra

1. Recolecta embriones en etapas de escisión (etapa de 2-8 células) a partir del desove natural de apareamientos grupales en placas de cultivo de tejidos de 10 cm.
2. Seleccione un lote de calidad adecuada: menos del 10% de óvulos no fertilizados/muertos.
3. Limpie los platos (retire los huevos no fertilizados, los escombros, las escamas, etc.).
4. Colocar 60 embriones por placa de cultivo de tejidos de 10 cm en 15 mL de medio E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl₂, 0,33 mM de MgSO₄)²⁵.
5. Coloque los platos en una cámara humidificada preparada colocando toallas de papel empapadas en agua.
6. Criar embriones hasta 72 hpf en una incubadora a 28,5 °C.

3. Preparación de la dilución de trabajo de los productos químicos que se van a probar

1. Retire la solución madre del congelador a -20 °C y déjela descongelar.
2. Si la solubilidad del compuesto es lo suficientemente alta, prepare diluciones seriadas en medio E3 en frascos de vidrio, 1 mL por réplica por concentración. Asegúrese de que la concentración sea 10 veces mayor que la concentración de exposición deseada. Esto evita tener que cambiar todo el medio de los embriones al inicio de la exposición. En caso de baja solubilidad, preparar las diluciones seriadas directamente a las concentraciones de exposición deseadas, 10 mL por réplica por concentración.
3. Compruebe si hay precipitaciones (si es necesario). Si la solución se ha precipitado, registre esto y luego diluya aún más para lograr la siguiente concentración más alta. Compruebe de nuevo si hay precipitaciones. Repita hasta que no haya precipitaciones.
4. Compruebe el pH de la solución de exposición. Si está fuera del rango de pH 7.0-8.5, registre esto y prepare las soluciones en E3 que contengan 5 mM de HEPES/pH 7.4, ajustando el pH con HCl o NaOH.
5. Deseche los medios de exposición no utilizados de acuerdo con las regulaciones locales.

4. Exposición de los embriones a los productos químicos que se van a analizar

1. Revise las placas con los embriones viejos de 72 hpf en busca de embriones muertos/no eclosionados y retírelos. Si un lote de embriones contiene más del 5% de huevos sin eclosionar, retire el lote.
2. Colocar 10 embriones por placa de cultivo de tejidos de 6 cm en 9 mL de medio E3 (placa de exposición).
3. Etiquete las placas de exposición con el nombre del compuesto, la concentración de exposición y el número de réplica. Por ejemplo, "CdCl₂ 1 mg· ^L-1 01". Incluya suficientes placas E3 solamente y una placa de control de disolvente, si es necesario (ver sección 5).
4. Agregue 1 ml de solución de exposición a cada placa, comenzando con la concentración más baja, y agite la placa. Para compuestos con baja solubilidad, sustituya los 10 ml completos de la placa por la solución de exposición (véase el paso 3.2).
5. Registre el orden temporal en el que se agregaron soluciones compuestas a los embriones.
6. Incubar las placas en la cámara humidificada en una incubadora a 28,5 °C durante 48 h hasta que alcancen los 120 hpf.

5. Realización del ensayo de sobresalto por vibración

NOTA: Analice las placas en el mismo orden que se registró en el paso 4.5. Cada ejecución debe incluir una placa de control E3.

1. Encienda la computadora y el dispositivo de vibración (la luz LED azul debe estar encendida).
2. Prepare el archivo de configuración en una hoja de cálculo, como se ve en la Figura 1D y se adjunta como Archivo complementario 1. Registre la información de exposición para cada una de las 5 posiciones de la placa (compuesto, concentración, réplica).
3. Abra el programa de interfaz de usuario general (GUI) (disponible en https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , ID de proyecto 43215).
4. Compruebe el movimiento de la cámara seleccionando las diferentes posiciones en el programa GUI y observando el movimiento de la cámara.
5. Saque las placas de muestra que se van a medir de la incubadora. Coloque las placas de muestra en las 5 posiciones (ver Figura 1A, "altavoces") y deje que los embriones se asienten durante varios minutos.
6. Haga clic en Grabar; Se abrirá una ventana para seleccionar el archivo de configuración.
7. Seleccione el archivo de configuración adecuado preparado en el paso 5.2 para esta ejecución.
8. Compruebe que la descripción de la muestra se corresponde con las muestras de cada posición (1-5).
9. La medición se realizará automáticamente (10 s / posición). Cuando el programa aplica el pulso de sonido, se enciende un LED. El registro durante 10 s/posición permite adquirir datos suficientes para estimar la velocidad de natación y la distancia recorrida tanto antes como después de aplicar el estímulo y evita la habituación a estímulos posteriores.
10. Cuando se completa la grabación, la cámara vuelve a la posición 1 y el software comienza a comprimir los archivos. Durante este tiempo, reemplace las muestras con el siguiente conjunto que deba medirse.
11. Vaya al paso 5.2. para grabar la siguiente ejecución.
12. Cuando se hayan medido todas las placas, recoja las soluciones de exposición. Usa un colador para retener los embriones.
13. Sacrificar los embriones mediante enfriamiento rápido en un baño de hielo/isopropanol (5%).
14. Deseche las soluciones de exposición y los embriones muertos de acuerdo con las regulaciones locales.

6. Análisis de datos

1. Abra los datos de vídeo con VirtualDub (1.10.4).
2. Puntúe visualmente el número de embriones que responden al pulso de sonido (cuando el LED de control está encendido).
3. Introduce los datos en una hoja de cálculo. Registre el nombre del compuesto, la réplica, la concentración del compuesto y el porcentaje de embriones inmóviles de acuerdo con la plantilla proporcionada en el Archivo Suplementario 2, que incluye el conjunto de datos de ejemplo que se muestra en la Figura 2C.
   NOTA: La plantilla tiene una estructura flexible y permite principalmente la aplicación de datos de otros organismos y puntos finales. Describe las respuestas para cada concentración y también proporciona descripciones de los puntos finales, así como definiciones de los parámetros generados en el posterior modelado de concentración-respuesta.
4. Realice el análisis de concentración de referencia (BMC) utilizando un flujo de trabajo KNIME (KNIME analytics 4.6²⁶) con scripts de R integrados (R versión 3.6., paquetes de R plotrix, drc y bmd ^27,28).
   NOTA: En principio, la evaluación también podría realizarse directamente en R. Sin embargo, para mayor comodidad y para permitir la evaluación como un servicio basado en la web, el análisis se ha organizado en un flujo de trabajo compatible con el servidor KNIME. El resultado del flujo de trabajo de KNIME se proporciona en el archivo complementario 3. Para obtener más información sobre los parámetros estadísticos generados por el flujo de trabajo de KNIME, consulte esta plantilla. En la Tabla 1 se muestran los parámetros estadísticos para estimar la bondad de ajuste y los umbrales para aceptar los valores de CMO determinados. El flujo de trabajo de KNIME en sí está disponible a través de GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). La concentración-respuesta se modela utilizando un modelo log-logístico de 4 parámetros. Dos de los parámetros de ajuste de la curva se pueden fijar. Normalmente, se fijaría el máximo en 100 en el caso de los datos porcentuales. En caso de que no se observen efectos de fondo, el mínimo puede fijarse en 0%.

La Figura 2A muestra el porcentaje de embriones inmóviles en 48 nidadas de embriones salvajes no tratados (cepa AB2O2). En promedio, el 14,33% de los embriones de tipo salvaje no tratados no reaccionan al estímulo de vibración. En 4 nidadas, el porcentaje de larvas inmóviles alcanzó el 50%, pero el 75% de las nidadas tenían un porcentaje de larvas inmóviles por debajo del 20%.

La Figura 2B,C muestra un ejemplo de un cálculo típico de una concentración/dosis de referencia (BMC/BMD29,30) para los efectos de los compuestos sobre la motilidad con el flujo de trabajo del ensayo de sobresalto por vibración, tal como se realiza actualmente en el consorcio PrecisionTox24. Los valores de BMC10, BMC25 y BMC50 corresponden a las concentraciones en las que el 10%, 25% y 50% de los embriones presentan niveles de inmotilidad superiores a los de fondo, respectivamente. En este cálculo solo se incluyen los embriones que son completamente inmóviles, no los que todavía muestran respuestas parciales, como solo una flexión en C sin natación de escape posterior o solo movimientos de cola (Figura 2B). Los embriones fueron expuestos a 8 concentraciones del inhibidor de los canales de sodio metanosulfonato de tricaína, que se utiliza con frecuencia para la anestesia de peces31. Los datos indican un nivel de fondo de alrededor del 25% de inmovilidad en respuesta al estímulo de vibración. A partir del 1% de tricaína, la motilidad se reduce y luego cesa por encima del 2,5%. El flujo de trabajo de KNIME calcula el BMC50 como 164,9 μM, lo que corresponde a un 1,07 % de tricaína y un nivel de inmotilidad del 75 % (Figura 2C). Los pequeños intervalos de confianza del 95% (indicados por los tonos grises de la curva) indican una robusta reproducibilidad de los valores de motilidad en este ensayo.

La Figura 2D muestra un ejemplo de una ejecución de ensayo subóptima, cuyos datos no deben utilizarse para los cálculos de BMC. Se muestran cinco grupos control tratados con E3 con diferentes embriones derivados de la misma nidada (AB2O2 [cepa de tipo salvaje] se replica 1-5). Solo el primer grupo muestra una respuesta cercana a la normalidad, mostrando alrededor de un 25% de inmotilidad que es consistente con los valores de la literatura32 y los obtenidos en el ensayo aquí descrito, como se muestra en la Figura 2A, mientras que todos los demás grupos muestran respuestas conductuales reducidas y/o incompletas (p. ej., mostrando solo una flexión en C no seguida de actividad de natación, o motilidad sin una curva en C clara al principio). Tal respuesta puede ocurrir cuando los embriones no se desarrollan adecuadamente y se encuentran en un estado inmaduro debido a un retraso en el desarrollo, lo que afecta la robustez de la respuesta de sobresalto14,33.

Figura 2: Ejemplo de un resultado típico, incluido el cálculo de la dosis de referencia. (A) Porcentaje de embriones que no responden después del pulso de sonido para larvas de tipo salvaje no tratadas durante 48 nidadas (n = 10 por nidada). La media (14,33%) y la desviación estándar (±16,19%) se indican en rojo. (B) Evaluación del comportamiento de respuesta de sobresalto de embriones (n = 20 por condición) tratados con la concentración indicada de tricaína en medio E3 o con E3 solo como control. El comportamiento se clasifica de acuerdo con el esquema de colores y las caricaturas indicadas a la derecha del gráfico, con cada embrión asignado a una sola de las siguientes clases: "inmóvil": embrión no muestra ningún movimiento; "movimiento de la cola": el embrión muestra movimiento de la cola, pero no se dobla en C ni se comporta nadando; "móvil": el embrión muestra movimiento de natación, pero no una flexión en C en respuesta al estímulo vibratorio; "C-bend only": el embrión muestra C-bend, pero no escapa de la natación; "C-bend + móvil": el embrión muestra un comportamiento típico de C-bend seguido de natación de escape (la típica respuesta de sobresalto completo). Los diferentes comportamientos se muestran como un porcentaje del número total de embriones para cada tratamiento. (C) Gráfico de cálculo de BMC generado por el flujo de trabajo KNIME, que indica el porcentaje de embriones "inmóviles" para cada concentración de tratamiento. Las líneas azules, rojas y negras indican los valores de BMC10, BMC25 y BMC50, es decir, las concentraciones a las que el 10%, 25% y 50% de los embriones muestran niveles de inmotilidad superiores a los del fondo, respectivamente. (D) Ejemplo de una ejecución de ensayo descartada. Se muestran cinco series de control tratadas con E3 con diferentes embriones de tipo salvaje AB2O2 derivados de la misma nidada (replicación 1-5). Solo la réplica 1 muestra una respuesta casi normal, mientras que los embriones de las carreras restantes no muestran la respuesta típica de flexión en C + natación de escape. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Parámetros estadísticos para estimar la bondad de ajuste y umbrales para aceptar los valores de CMO determinados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Propiedades de una selección de sistemas de ensayo de respuesta vibracional a sobresaltos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Plantilla de Excel para el archivo de configuración. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Plantilla de entrada KNIME con un conjunto de datos de ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Ejemplo de archivo de salida KNIME. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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