Dispositivo microfluídico bicapa para la producción de tapones combinatorios

Summary

Aquí se presenta la fabricación de un dispositivo bicapa basado en polidimetilsiloxano (PDMS) para la producción de bibliotecas combinatorias en emulsiones de agua en aceite (tapones). El hardware y el software necesarios para automatizar la producción de enchufes se detallan en el protocolo, y también se demuestra la producción de una biblioteca cuantitativa de enchufes fluorescentes.

Abstract

La microfluídica de gotas es una herramienta versátil que permite la ejecución de un gran número de reacciones en compartimentos de nanolitros químicamente distintos. Estos sistemas se han utilizado para encapsular una variedad de reacciones bioquímicas, desde la incubación de células individuales hasta la implementación de reacciones de PCR, desde la genómica hasta la síntesis química. El acoplamiento de los canales microfluídicos con válvulas reguladoras permite controlar su apertura y cierre, lo que permite la rápida producción de bibliotecas combinatorias a gran escala que consisten en una población de gotas con composiciones únicas. En este artículo, se presentan los protocolos para la fabricación y operación de un dispositivo microfluídico bicapa basado en PDMS impulsado por presión que se puede utilizar para generar bibliotecas combinatorias de emulsiones de agua en aceite llamadas tapones. Mediante la incorporación de programas de software y hardware microfluídico, el flujo de fluidos deseados en el dispositivo se puede controlar y manipular para generar bibliotecas de tapones combinatorios y para controlar la composición y cantidad de poblaciones de tapones constituyentes. Estos protocolos acelerarán el proceso de generación de cribados combinatorios, en particular para estudiar la respuesta a fármacos en células de biopsias de pacientes con cáncer.

Introduction

La microfluídica permite la manipulación de pequeñas cantidades de fluidos en microcanales¹. La escala de funcionamiento de los dispositivos microfluídicos típicos es de decenas a cientos de micrómetros, lo que permite la miniaturización de las reacciones químicas y biológicas, lo que permite que dichas reacciones se lleven a cabo con cantidades relativamente pequeñas de reactivos. Inicialmente, los dispositivos microfluídicos se fabricaban con materiales como el silicio² y el vidrio³. A pesar de que todavía están en uso⁴, plantean ciertos problemas, como la compatibilidad con solventes, el alto costo de fabricación y las dificultades en la integración de controles para el flujo de fluidos ^5,6. Las metodologías de fabricación basadas en PDMS, denominadas litografía blanda, ofrecen una alternativa económica para la creación rápida de prototipos de dispositivos⁷ y una vía para fabricar dispositivos complejos de múltiples capas⁸. La adición de válvulas y bombas a los dispositivos PDMS permite controlar el enrutamiento y la velocidad de los fluidos en los dispositivos ^9,10. Se han desarrollado varios métodos para diseñar y accionar microválvulas de manera reversible o irreversible, por ejemplo, válvulas bimetálicas hechas de silicio y aluminio, que se accionan térmicamente¹¹ o utilizan gas generado a partir de una reacción electroquímica para desviar una membrana de nitruro de silicio¹². Gu et al. demuestran el uso de los pines mecánicos de una pantalla Braille para aplicar presión sobre los microcanales para regular el flujo¹³. Un conjunto de microválvulas que ha ganado popularidad son las válvulas neumáticas basadas en PDMS iniciadas por el grupo de Stephen Quake¹⁴. Por lo general, dichas válvulas se componen de dos microcanales ortogonales: un canal de flujo y un canal de control. Tras la presurización del canal de control, una delgada membrana PDMS se desvía hacia el canal de flujo, cerrándolo y, por lo tanto, interrumpiendo el flujo de fluido. Una vez despresurizada, la membrana se relaja, abriendo así el canal de flujo y permitiendo la reanudación del flujo de fluido. De este modo, las válvulas PDMS permiten la regulación del caudal de forma robusta y reversible, ya que el canal de control puede presurizarse y despresurizarse varias veces¹⁵. Además, dado que estas válvulas pueden accionarse mediante la aplicación de presión, abren vías para el control digital y la automatización¹⁶. Además, al ser del mismo material, pueden integrarse sin problemas en la fabricación de dispositivos basados en PDMS utilizando técnicas de litografía blanda ^8,17,18. Estas características hacen que las válvulas PDMS sean una opción atractiva para la regulación de flujo en dispositivos microfluídicos. Thorsen et al. utilizaron el principio de tales válvulas para diseñar un multiplexor fluídico (una matriz combinatoria de válvulas neumáticas) para abordar casi mil canales de flujo de entrada con veinte canales de control¹⁹. Este principio se ha extendido para dirigir selectivamente los fluidos a los quimiostatos microfluídicos en el chip, de modo que se puedan llevar a cabo reacciones únicas simultáneamente en cada reactor 20,21,22,23. Sin embargo, estos microrreactores, si bien son útiles para optimizar el uso de reactivos limitados, no pueden paralelizar múltiples reacciones y no son suficientes para estudios de alto rendimiento.

La microfluídica de gotas es una subcategoría de la microfluídica que implica la producción de gotas a través de la manipulación de un flujo de líquido multifásico inmiscible en dispositivos microfluídicos²⁴. La formación de gotas implica la ruptura de un fluido continuo mediante la introducción de un fluido inmiscible, lo que resulta en un pellizco debido a la inestabilidad en la energía interfacial y en la formación de una emulsión²⁵. Los tensioactivos ayudan en la formación de gotas redondeadas cuando las emulsiones abandonan el microcanal estabilizando las energías interfaciales²⁶. Las gotas más grandes, llamadas tapones, son menos estables y pueden recogerse en un compartimento de retención (como un trozo de tubo) como una serie de compartimentos acuosos espaciados a ambos lados por uno o más líquidos inmiscibles²⁷. Además de la miniaturización y la compartimentación, la microfluídica de gotas también ofrece un mayor rendimiento de las reacciones biológicas, ya que se puede producir un gran número de gotas monodispersas, cada una de las cuales sirve como nanorreactor²⁸. Las gotas, una vez generadas, también pueden ser sometidas a manipulaciones adicionales, como la división ^29,30, la fusión^31,32, la clasificación^33,34 y el ensamblaje en estructuras de orden superior ^35,36. La microfluídica de gotas ha revolucionado varios campos científicos y tecnologías, desde la PCR³⁷ hasta la transcriptómica unicelular³⁸, desde el descubrimiento de fármacos^39,40 hasta la virología⁴¹, desde la secuenciación de próxima generación⁴² hasta la síntesis química⁴³.

La integración de la litografía blanda basada en PDMS y las microválvulas con la tecnología de gotas es una potente combinación que permite la regulación del flujo de fluido en los microcanales y el posterior control del contenido de las gotas. Dependiendo de la apertura y cierre de los canales, es posible producir distintas poblaciones de gotas, cada una con una composición específica. Dicha plataforma podría miniaturizar, compartimentar y paralelizar reacciones bioquímicas y, por lo tanto, ser una técnica útil para el cribado combinatorio⁴⁴. El cribado combinatorio es un método de alto rendimiento para generar decenas de miles de combinaciones de reactivos seleccionados y producir bibliotecas que constan de poblaciones individuales de composición conocida. El cribado combinatorio se ha utilizado para descubrir efectos sinérgicos entre fármacos y antibióticos para la inhibición del crecimiento bacteriano⁴⁵. En el campo de la terapia oncológica, el cribado combinatorio se ha utilizado para probar combinaciones de fármacos anticancerígenos en un paciente determinado, avanzando así en la terapia personalizada^46,47. Mathur et al. se han basado en esta tecnología mediante la integración de un enfoque combinatorio de código de barras de ADN para evaluar los cambios en el transcriptoma en el cribado de fármacos de alto rendimiento⁴⁸. Por lo tanto, el cribado combinatorio es una tecnología potente pero incipiente, y existe la necesidad de desarrollar diversas tecnologías microfluídicas para ejecutar y facilitar dichos procedimientos de cribado.

El objetivo de este manuscrito es presentar un conjunto completo de protocolos para la fabricación de un dispositivo microfluídico bicapa capaz de generar una biblioteca combinatoria de tapones de agua en aceite y describir el hardware y software necesarios para el funcionamiento de dicho dispositivo. El flujo de fluido se regula mediante válvulas neumáticas basadas en PDMS controladas por presión, que a su vez son controladas por un programa LabVIEW personalizado. El flujo de reactivos en el dispositivo se logra utilizando bombas de presión disponibles en el mercado. Se presenta un prototipo de ocho entradas en el que se forma un tapón con el contenido de tres entradas, cada una de las cuales contiene un reactivo acuoso. La fase acuosa se encuentra con una fase oleosa continua y los tapones se producen en una unión en T con una frecuencia de 0,33 Hz. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante la producción de una biblioteca cuantitativa que contiene tres poblaciones distintas de tapones fluorescentes. Esta tecnología y conjunto de protocolos ayudarán a acelerar la producción de bibliotecas combinatorias para fines de cribado de alto rendimiento.

Protocol

1. Litografía blanda

NOTA: El dispositivo microfluídico se compone de dos capas, capa de flujo y capa de control (Figura 1A), y cada capa se moldea a partir de obleas con patrones individuales utilizando una fotorresistencia positiva y negativa respectivamente (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de la fotorresistencia y los reveladores).

1. Realice la fabricación de obleas para la capa de flujo como se describe a continuación.
   1. Deshidratar una oblea de silicona (100 mm de diámetro, orientada a <1-0-0>, 525) durante la noche (12-16 h) a 250 °C.
   2. Deje que la oblea se enfríe antes de proceder a la centrifugación. Aplique 3-4 mL de fotorresistencia positiva en el centro de la oblea.
   3. Centrifugar durante 40 s a 1400 rpm (344 rpm/s) para obtener una altura de característica de 45 μm.
   4. Horneado suave en una placa calefactora utilizando una rampa de temperatura, aumentando a razón de 450 °C /h, de 35 °C a 105 °C. Este paso también se puede llevar a cabo en tejidos de microfibra para evitar el contacto directo y minimizar el burbujeo de la fotorresistencia. Retire la oblea de la placa calefactora y deje que se enfríe sobre pañuelos de microfibra.
   5. Coloque la fotomáscara (producida comercialmente) correspondiente a la capa de flujo (con la emulsión hacia abajo) sobre la oblea de silicona recubierta de resistencia y expóngala bajo una lámpara UV, a 10 mW/^cm2, hasta alcanzar una exposición total de 200 mJ/^cm2 .
   6. Utilice dos placas calefactoras, una a 65 °C y otra a 95 °C, para realizar un horneado posterior a la exposición, durante 1 min y 7 min respectivamente, en las placas.
   7. Revele la oblea transfiriéndola a una placa de Petri llena de revelador para obtener una fotorresistencia positiva. Agite la placa de Petri agitándola en un agitador de sobremesa con la oblea completamente sumergida y refresque la solución reveladora periódicamente hasta que la oblea esté completamente desarrollada y se puedan ver claramente las características.
   8. Use agua desmineralizada para enjuagar la resistencia residual de la oblea y verifique bajo un microscopio estereoscópico si hay residuos dentro de los canales. Elimine los residuos devolviendo la oblea a la solución de revelador o añadiéndolo con cuidado a la oblea con una micropipeta. Una vez completado, seque la oblea con una pistola rociadora de nitrógeno.
   9. Vuelva a fluir la oblea colocándola en una placa calefactora a 110 °C durante 25 minutos. Este proceso da como resultado entidades redondeadas.
   10. Proceda a la silanización de la oblea como se detalla en el paso 1.3.
       NOTA: La deposición de vapor de hexametildisilazano (HMDS) también se puede llevar a cabo en las obleas de silicio antes de la aplicación de la resistencia para mejorar la adhesión entre la resistencia y la oblea.
2. Realice la fabricación de obleas para la capa de control como se describe a continuación.
   1. Tome otra oblea de silicona y deshidrátela colocándola en una placa calefactora a 110 °C durante 15 minutos.
   2. Retire la oblea y deje que se enfríe a temperatura ambiente antes de continuar con el recubrimiento giratorio.
   3. Aplique 5 mL de la fotorresistencia negativa en el centro de la oblea.
   4. Utilice el siguiente protocolo de centrifugado para obtener una altura de característica de 40 μm: 5 s a 500 rpm (aceleración de 100 rpm/s), 33 s a 1400 rpm (300 rpm/s) y, finalmente, desacelere a 0 rpm durante 5 s a 300 rpm/s.
   5. Hornee suavemente con dos placas calefactoras separadas ajustadas a 65 °C y 95 °C durante 1 min y 15 min respectivamente. Retire la oblea de la placa calefactora y deje que se enfríe sobre pañuelos de microfibra.
   6. Coloque la fotomáscara (producida comercialmente) correspondiente a la capa de control (con la emulsión hacia abajo) sobre la oblea recubierta de resistencia y exponga la oblea bajo una lámpara UV, ajustada a 15 mW/^cm2, hasta alcanzar una exposición total de 250 mJ/^cm2 .
   7. Utilice dos placas calefactoras, una a 65 °C y otra a 95 °C, y realice una cocción posterior a la exposición de la oblea durante 2 minutos y luego 5 minutos respectivamente. Retire la oblea de la placa calefactora y deje que se enfríe sobre pañuelos de microfibra.
   8. Revele la oblea transfiriéndola a una placa de Petri llena de revelador para fotorresistencia negativa durante 4 minutos. Actualice el desarrollador y continúe el proceso durante 4 minutos más.
   9. Enjuague la oblea con isopropanol para eliminar la fotorresistencia residual y use un microscopio estereoscópico para verificar si hay algún residuo dentro de los canales.
   10. Elimine los residuos devolviendo la oblea a la solución de revelador o añadiéndolo con cuidado a la oblea con una micropipeta. Una vez completado, seque la oblea con una pistola rociadora de nitrógeno.
   11. Una vez que esté completamente desarrollado, hornee la fotorresistencia colocando la oblea en una placa calefactora a 95 °C durante 10 minutos.
   12. Proceda a la silanización como se detalla en el paso 1.3.
3. Lleve a cabo la silanización como se describe a continuación.
   1. Coloque la oblea en un desecador. Coloque un frasco de vidrio en el desecador y agregue 4-5 gotas de 1,1,3,3 tetrametildisiloxano.
      PRECAUCIÓN: El 1,1,3,3 tetrametildisiloxano no es tóxico pero es inflamable. Se pueden usar otros silanos, pero pueden ser tóxicos. Se recomienda llevar a cabo la silanización en una campana extractora mientras se usa el equipo de protección personal (EPP) necesario, como bata de laboratorio, anteojos y guantes de nitrilo.
   2. Tire del vacío durante 15 minutos y selle el desecador durante 12-16 h para permitir que el silano se deposite en la oblea.
   3. Abra el desecador y deseche la botella de vidrio. Coloque la oblea en una placa de Petri limpia.
4. Realice la fabricación de dispositivos microfluídicos como se describe a continuación.
   NOTA: El siguiente protocolo ha sido adaptado de trabajos anteriores²³.
   1. Prepare dos soluciones PDMS separadas: una para la capa de flujo y otra para la capa de control. Para cada solución, mezcle el agente base y el agente de curado del kit PDMS en un vaso de precipitados y revuelva con una varilla mezcladora. La capa de control requiere 10 g de agente base y 0,5 g de agente de curado (proporción 20:1), mientras que la capa de flujo requiere 40 g del agente base y 8 g del agente de curado (proporción 5:1).
   2. Desgasifique las soluciones de PDMS en un desecador hasta que las soluciones estén libres de gas.
   3. Coloque la oblea de capa de flujo silanizada en una placa de Petri cubierta con papel de aluminio y vierta la solución de PDMS correspondiente sobre la oblea. Vuelva a colocar la placa de Petri en el desecador y tire de la aspiradora para desgasificar aún más (durante aproximadamente 20 minutos).
   4. Recubre la oblea de la capa de control silanizada con su correspondiente solución PDMS. Vierta 3-4 ml de la solución en el centro de la oblea y gire durante 20 s a 1500 rpm a 408 rpm/s. Coloque la oblea sobre una superficie nivelada en una placa de Petri cerrada durante 20 minutos.
   5. Coloque las capas de flujo y control en un horno a 80 °C durante 18-20 min. Monitoree periódicamente las dos capas para verificar si están curadas. Las capas están listas cuando son lo suficientemente resistentes como para ser maleables pero ligeramente pegajosas, ya que esto mejora la unión entre las dos capas.
   6. Recorta el PDMS alrededor de cada uno de los dispositivos de la oblea de la capa de flujo con un bisturí. Asegúrese de no cortar demasiado cerca de las características y deje aproximadamente 2 cm de espacio entre la característica y los bordes del PDMS. Una vez separado de la oblea de silicona, cubra el bloque PDMS con cinta adhesiva en el lado de la función para evitar cualquier contaminación por polvo.
   7. Una vez que se hayan cortado todos los bloques de PDMS, colóquelos uno a uno en la oblea de la capa de control correspondiente realizando una alineación aproximada a ojo.
   8. Después de que todos los bloques se hayan colocado en sus áreas correspondientes en la capa de control, ajuste la posición de cada uno de los bloques de modo que las válvulas de control se superpongan sobre los canales de flujo correspondientes para completar la alineación. Esto también se puede llevar a cabo con la ayuda de un microscopio estereoscópico.
   9. Elimine las bolsas de aire entre las dos capas aplicando presión. Si la bolsa de aire está en o cerca de una característica, tenga cuidado de no colapsar los canales mientras aplica presión.
   10. Coloque los dispositivos en el horno a 80 °C y déjelos unir durante 12-16 h. Coloque pesos de 100 g en cada uno de los dispositivos para mejorar la unión entre las dos capas.
   11. Saca la oblea y recorta cada dispositivo individualmente. Despegue los dispositivos de la oblea de la capa de control y cubra el lado de la función con cinta adhesiva.
   12. Coloque cada dispositivo individual en una estera de corte con el lado de la característica hacia arriba y perfore un orificio para cada una de las ocho entradas de la capa de flujo, las ocho entradas del canal de la capa de control, las entradas de aceite y la salida con un punzón de biopsia de 0,75 mm con el lado de la característica hacia arriba.
   13. Cargue el asher de plasma con un portaobjetos de microscopio y un solo dispositivo con la cinta retirada y el lado de la característica hacia arriba. Realice la incineración de plasma de oxígeno con una potencia de 30 W durante una duración de 20 s.
   14. Tome el dispositivo y la corredera de vidrio hacia afuera tan pronto como se complete la incineración y coloque el dispositivo con el lado de la característica hacia abajo en el portaobjetos. La adherencia entre el PDMS y el vidrio debe ser inmediatamente visible a simple vista. Aplique presión a cualquier región con bolsas de aire para exprimir el aire.
   15. Coloque los dispositivos en una placa calefactora ajustada a 110 °C durante 60 minutos con un peso encima para mejorar la unión del PDMS al vidrio.

2. Configuración de hardware

NOTA: En la Figura 1B se muestra un esquema de las conexiones al dispositivo microfluídico y en la Figura 2 se muestra una realización de dicho esquema utilizando el hardware necesario.

1. Configure las válvulas neumáticas como se describe a continuación.
   NOTA: Cada canal de control, que regula una válvula PDMS en el chip, está a su vez controlado por una sola válvula solenoide. El prototipo presentado aquí consta de ocho canales de control (Figura 1A) y, por lo tanto, se requieren ocho electroválvulas.
   1. Las válvulas solenoides se controlan mediante un programa de software LabVIEW personalizado (Programa de interfaz principal; Figura 3 y Legajo Complementario 1, Legajo Complementario 2, Legajo Complementario 3, Legajo Complementario 4). Este programa envía comandos MODBUS a través de una conexión TCP (Archivo Suplementario 5, Archivo Suplementario 6) a un controlador WAGO. Conecte el dispositivo WAGO a la computadora con el programa LabVIEW usando un cable Ethernet. Proceda a conectar las electroválvulas secuencialmente a los puertos del controlador WAGO. Para una descripción más detallada, consulte los protocolos descritos anteriormente²³.
   2. Conecte el conjunto de válvulas solenoide a una fuente de aire comprimido utilizando un tubo de 1/4 de pulgada y ajuste la presión del conjunto de válvulas a 3,5 bar. En este sistema, se utilizaron las ocho válvulas marcadas con el 9 al 16.
2. Configure los reguladores de presión como se describe a continuación.
   NOTA: Se utiliza una bomba de presión disponible en el mercado para controlar el flujo de fluido (Figura 2). Se utilizaron un conjunto de bombas de ocho y cuatro puertos para acomodar ocho entradas acuosas y dos entradas de aceite en el dispositivo. La presión de cada puerto se regula a través de un software proporcionado por los fabricantes.
   1. Conecte la bomba de presión a una fuente de aire comprimido asegurándose de que la presión suministrada no supere la presión máxima permitida por la bomba (2,2 bar para los controladores de ocho y cuatro puertos).
   2. Conecte las bombas de presión a un ordenador mediante un conector USB.
   3. Una vez que las bombas están encendidas, deben estar visibles en el software correspondiente. Ajuste las presiones a cero mientras configura las bombas.
   4. Conecte un luer macho al conector de lengüeta de 3/32 pulgadas a cada uno de los 12 puertos de salida de bloqueo luer hembra de los controladores.
   5. Conecte un trozo de tubo blando (diámetro exterior: 3 mm, diámetro interior: 1 mm, largo: 15 cm) a la lengüeta. Conecte otro luer macho al conector de lengüeta de 3/32 de pulgada al otro extremo del tubo blando.
   6. Conecte un muñón luer (23 G, 0,5 pulgadas) al conector de lengüeta. En este punto, el regulador de presión está configurado y listo para ser utilizado.

3. Configuración del dispositivo microfluídico

1. Conecte el tubo del canal de control como se describe a continuación (Figura 2).
   1. Para cada canal de control, corte un trozo de tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) (OD: 0,042 pulgadas, ID: 0,022 pulgadas). Inserte el pin de un muñón luer de 23 G, 0,5 pulgadas en un extremo.
   2. Conecte el muñón luer a un luer macho a un conector de nailon con lengüeta de 3/32 pulgada. Inserte la lengüeta del conector en un trozo de tubo de poliuretano (diámetro exterior: 4 mm, diámetro interior: 2,5 mm). Conecte el otro extremo del tubo de poliuretano directamente a una válvula solenoide.
   3. Llene una jeringa con agua y conecte un tubo luer de 23 g y 0,5 pulgadas en el extremo.
   4. Conecte el extremo libre del tubo de PTFE a esta jeringa e inyecte agua hasta aproximadamente la mitad del tubo.
   5. Desconecte el tubo de la jeringa e inserte el extremo libre del tubo en un orificio perforado del canal de control correspondiente (Figura 1A-C _1-8). Repita hasta que cada canal de control se haya conectado a su válvula solenoide correspondiente.
      NOTA: En este trabajo, las electroválvulas 9-16 se conectaron a los canales de control correspondientes a C₁ a C_8, respectivamente. Si bien estos se pueden conectar de cualquier manera, es importante recordar el orden y la secuencia de las conexiones, especialmente mientras se opera el programa de interfaz principal.
   6. Utilice el programa de interfaz principal (Figura 3) para abrir todas las válvulas solenoides (Presurizar todos los canales de control). Esto empujará el fluido desde el tubo hacia los canales de control del dispositivo microfluídico y, por lo tanto, lo llenará. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de válvulas presurizadas y despresurizadas.
2. Conecte los reactivos y cebe el dispositivo como se describe a continuación.
   1. Asegúrese de que todos los canales de control estén presurizados presionando el botón Presurizar todos los canales de control en el programa de interfaz principal (Figura 3).
   2. Para cada uno de los reactivos acuosos, corte un segmento de tubo de PTFE (OD: 0,042 pulgadas, ID: 0,022 pulgadas) lo suficientemente largo como para conectar las bombas a las entradas de los dispositivos microfluídicos. Conecte uno de los tubos al muñón luer del paso 2.2.6.
   3. Llene una jeringa con el reactivo requerido y conecte un talón Luer de 23 G y 0,5 pulgadas en el extremo.
   4. Inyecte el reactivo en el tubo de PTFE correspondiente hasta que el tubo esté lleno. Tenga cuidado de que el reactivo no entre en el puerto de salida del conjunto de bombas.
   5. Inserte el extremo libre del tubo en una entrada correspondiente en el chip microfluídico.
   6. Aplique una presión de 400 mbar a cada uno de los reactivos acuosos de entrada utilizando el software proporcionado.
   7. Despresurice secuencialmente los canales de control individualmente utilizando el programa de interfaz principal (Figura 3) para asegurarse de que todos los reactivos hayan alcanzado la unión T del dispositivo. Accione las válvulas individuales, si es necesario, presionando los botones correspondientes en el programa en la caja Canales de control Presurización manual.
   8. Repita los pasos 3.2.3 a 3.2.5 para los reactivos de aceite. Aplique una presión de 400 mbar a cada uno de los reactivos de aceite de entrada.
   9. Despresurice simultáneamente todos los canales de control presionando Despresurizar todos los canales de control (Figura 3) hasta que se haya eliminado todo el aire del dispositivo. Esto se puede observar a simple vista o bajo un microscopio.
   10. Presurice todos los canales de control presionando el botón Presurizar todos los canales de control (Figura 3). En esta etapa, todos los reactivos se han conectado y el dispositivo está preparado y listo para usar.
3. Programe y ejecute el experimento como se describe a continuación.
   1. Codifique la composición, la secuencia y las réplicas de cada población de enchufes que se producirán en un archivo .csv como se muestra en el Archivo Suplementario 7 que sirve como entrada para el Experimento Automático en el programa de interfaz principal (Figura 3). Marque los canales de control necesarios con un 0 si corresponde a una entrada que debe estar abierta y un 1 si debe cerrarse. Cada fila del archivo .csv corresponde a una población de enchufes distinta.
   2. Cargue el .csv en el programa de interfaz principal haciendo clic en el botón Carpeta en la pestaña Archivo de experimento .
   3. Ingrese los campos relevantes en el programa, como Iteraciones del experimento (para determinar cuántas veces se produce la secuencia dada de tapones), Tiempo de despresurización (para determinar cuánto tiempo deben estar abiertos los canales de entrada y el canal de control correspondiente debe despresurizarse en milisegundos), Tiempo de presurización (para determinar cuánto tiempo deben cerrarse las entradas entre secuencias de población de enchufes en milisegundos).
   4. Seleccione los canales de entrada correspondientes a la producción de códigos de barras en la sección Entradas de códigos de barras (hasta 3 canales) junto con el tiempo durante el cual deben estar abiertos (Tiempo para códigos de barras (ms)). Alternativamente, estos códigos de barras también se pueden codificar de forma rígida en el archivo de .csv de entrada, como se muestra en el archivo complementario 7.
   5. Reduzca la presión de los reactivos de aceite de entrada a 200 mbar.
   6. Conecte un tubo de PTFE (diámetro exterior: 0,042 pulgadas, diámetro interior: 0,022 pulgadas) de la longitud deseada en la salida para recoger los tapones. Con el fin de garantizar una producción uniforme de tapones, utilice tubos de aproximadamente 100 cm precargados con tapones para la recolección. Esto es para neutralizar la diferencia de presión en la salida que se ejerce por la recolección de tapones en la tubería.
   7. Presione Run Experiment para iniciar el programa y conectar la producción.
4. Realice el registro y análisis de datos como se describe a continuación (consulte la Figura 5).
   NOTA: Esta sección describe específicamente un método para analizar tapones fluorescentes. Dependiendo de la naturaleza de los tapones generados, esta sección se puede modificar según sea necesario.
   1. Llene una jeringa con aceite (ya sea aceite mineral o aceite fluorado) y conecte un trozo luer de 23 G 0,5 in en el extremo. Sujete la jeringa a una bomba.
   2. Conecte uno de los extremos del tubo de recolección lleno al talón luer de la jeringa. Fije el otro extremo del tubo de recolección lleno por encima de la lente del objetivo de un microscopio.
   3. Coloque un depósito de desechos debajo del extremo de la tubería cerca del objetivo.
   4. Enfoque el microscopio en una región determinada del tubo y configúrelo para registrar la fluorescencia en los canales deseados.
   5. Ajuste la bomba a un caudal de 50 μL/min.
   6. Grabe el video del canal fluorescente como un archivo .avi.
   7. Analice el archivo .avi utilizando el script de Python proporcionado (Archivo complementario 8) para extraer la fluorescencia promedio en una región de interés (ROI) predefinida por fotograma del archivo .avi (un ejemplo del cual se da en el archivo complementario 9).
   8. Utilice el script de R personalizado proporcionado (archivo complementario 10) para extraer las condiciones y trazar los datos sin procesar y las alturas de los picos.
      NOTA: El script R en el Archivo Suplementario 10 se utilizó para el análisis en este documento. Las funciones R personalizadas que se utilizan en este script para cortar datos, detectar condiciones mediante códigos de barras y analizar las alturas de los picos para enchufes individuales y el trazado se proporcionan en el Archivo complementario 11.

Results

Una de las características cruciales del chip microfluídico son las válvulas PDMS y su capacidad para regular el flujo de fluido se caracterizó ya que influye en el paradigma operativo del dispositivo. Para ello, se registró el caudal de agua destilada (medido mediante un sensor de caudal comercial) a través de los canales de entrada en función de diferentes presiones de entrada, mientras se presurizaban periódicamente (3,5 bar durante 2000 ms) y se despresurizaban (1000 ms) las válvulas PDMS (Figura 6A). Se observó que las válvulas fueron capaces de regular el flujo de fluido hasta aproximadamente 800 mbar de presión de entrada, como lo indica la caída del caudal a cero cuando se accionan las válvulas (Figura 6 B-D). Esto valida el uso de dichas válvulas basadas en PDMS para regular el flujo de reactivos dentro de los canales. Además, a 1200 mbar, la presión de entrada es demasiado alta para que las válvulas regulen el flujo, como lo demuestra el hecho de que el caudal no se reduce a cero (Figura 6E). Si bien la duración de la presurización y despresurización de las válvulas PDMS se puede modificar, se calculó la tasa de cambio del flujo de fluido en las condiciones actuales de presurización (2000 ms) y despresurización (1000 ms). Para una presión de entrada de 400 mbar, el flujo se puede conectar y apagar a una velocidad de 1,26 Hz y 1,44 Hz respectivamente (Figura 6C).

Las iteraciones anteriores de un dispositivo microfluídico combinatorio de alto rendimiento similar también incorporaron un canal de residuos acoplado a cada canal de flujo^46,47. Estos dispositivos funcionaban en un régimen de caudal constante (en el que los reactivos se inyectaban en el dispositivo a caudales constantes en lugar de a presión constante), y los canales de residuos estaban programados para abrirse cuando se cerraban sus correspondientes canales de entrada para aliviar cualquier acumulación de presión. Dichos canales, si bien son útiles, dan como resultado una pérdida de reactivos, ya que el contenido del canal de desechos no contribuye a la formación de tapones. Además, también se requieren canales de control adicionales y, por lo tanto, bombas adicionales, para regular la apertura y el cierre de los canales de desechos. En el prototipo presentado aquí, se eliminaron los canales de residuos y se estableció un paradigma operativo que permite reducir el desperdicio de reactivos y reducir la complejidad operativa y del diseño. Esto implica inyectar los reactivos acuosos en modo de presión constante en lugar de en modo de caudal constante. Para comprender mejor los dos regímenes, se evaluó la relación entre la presión y el caudal en los canales durante el accionamiento de la válvula en cada caso (utilizando la misma configuración que se muestra en la Figura 6A), cuyos resultados se muestran en la Figura 7. En la Figura 7A, se midió el caudal de agua destilada mientras se inyectaba a una presión constante (300 mbar) y se observó que durante el accionamiento de la válvula, el caudal cae a cero y tras la despresurización de la válvula, el caudal se recupera a niveles previos al accionamiento. Sin embargo, en un régimen de caudal constante, en el que la presión en los canales se registró mientras se inyectaba el agua destilada a un caudal constante (2,5 μL/min; Figura 7B), el accionamiento de la válvula no dio lugar a un cierre completo de la entrada, lo que se evidenció en el hecho de que el caudal no cayó a cero, y se observó una acumulación de presión en el canal. Esta es la presión que se alivia con la apertura de canales de desechos. Dado que un régimen de presión de entrada constante permite el funcionamiento del dispositivo sin contrapresión al accionar la válvula, lo que elimina la necesidad de canales de desecho, se adoptó este régimen para el funcionamiento del chip microfluídico.

Para demostrar la funcionalidad del dispositivo microfluídico, se generó una biblioteca combinatoria cuantitativa de tapones fluorescentes. A las ocho entradas del dispositivo, tres reactivos acuosos: fluoresceína (50 μM) en cuatro entradas (I₁Yo_3, Yo_5, Yo₇), agua destilada en tres entradas (I₄Yo_6, Yo₈), una entrada con un tinte de color azul (I₂; para actuar como código de barras) - y dos reactivos de aceite - aceite fluorado (FC-40) y aceite mineral (MO) en entradas O₁ y O₂, respectivamente, se conectaron (Figura 1A, Figura 8A). El aceite fluorado sirve como fase portadora en la que se dispersan los tapones acuosos, y el aceite mineral ayuda a la estabilidad del tapón y minimiza la adhesión del contenido del tapón a las paredes, minimizando así la contaminación cruzada entre los tapones⁴⁶. Con tres entradas que contribuyen a la composición de una sola población de tapón, esta configuración puede generar tres poblaciones fluorescentes distintas: FFF, compuesta de fluoresceína de tres canales, FFW, compuesta de fluoresceína de dos canales y agua de un canal, y FWW, compuesta de fluoresceína de un canal y agua de dos canales. Con esta configuración, hay 12 condiciones distintas (poblaciones de enchufes producidas con una combinación distinta de tres entradas) que pueden producir enchufes FWW, 18 condiciones distintas que pueden producir enchufes FFW y cuatro condiciones distintas que pueden producir enchufes FFF. Por lo tanto, el chip se programó para producir estas 34 condiciones diferentes con cinco enchufes replicados diferentes cada uno, junto con cinco réplicas de enchufes de códigos de barras que los separan. Se recomienda intercalar las poblaciones de tapones fluorescentes con una población de código de barras, es decir, un conjunto de tapones de colores (idealmente no fluorescentes) (en este caso formados abriendo los canales de entrada correspondientes al tinte azul y dos canales de agua destilada) que sean visibles a simple vista. Permite al usuario monitorear la producción de enchufes para detectar problemas como la ruptura o fusión de enchufes y ayuda en el análisis posterior de los enchufes. Por lo tanto, se generaron y recogieron un total de 340 enchufes - 170 enchufes experimentales y 170 enchufes de código de barras que separan las diferentes condiciones - en tubería de PTFE, una muestra de los cuales se muestra en Figura 8B. El tiempo de despresurización y el tiempo de presurización se fijaron en 1000 ms y 2000 ms, respectivamente. Se analizó la fluorescencia de los tapones y su variabilidad dentro y a través de las diferentes condiciones experimentales, cuyos resultados se muestran en Figura 8C,D. Figura 8C muestra la fluorescencia por fotograma del fichero de .avi generado en el paso 3.4.6, que pone de relieve las 34 condiciones experimentales consideradas (demarcadas por una línea azul). El valor fluorescente medio de los picos dentro de una condición se muestra en rojo, y las líneas discontinuas indican el error estándar dentro de esa condición. Las alturas de los picos de todos los tapones de cada población, obtenidas restando la fluorescencia basal de la fluorescencia máxima detectada en cada pico, se graficaron en Figura 8D. El último pico en cada condición se tuvo en cuenta para los cálculos, ya que era un tapón contaminado debido a la mezcla de reactivos en la unión T (dado que la fluorescencia de los tapones se registró en orden inverso a la producción del tapón, el primer tapón en una población durante la producción es el último tapón en una población durante el análisis). Se evidenció que la altura de los enchufes FWW es de aproximadamente un tercio (media = 40,9, desviación estándar = 3,1) y la de los enchufes FFW es de aproximadamente dos tercios (media = 78,4, desviación estándar = 5) de la altura de los enchufes FFF (media = 117, desviación estándar = 10). Estos resultados coinciden con las proporciones esperadas de fluorescencia en diferentes poblaciones de tapones FFF/FFW/FWW, lo que pone de manifiesto la robustez del dispositivo y su funcionamiento.

Figura 1: Esquema del diseño del dispositivo y la configuración microfluídica. (A) La capa de flujo del chip se muestra en azul y la capa de control se muestra en rojo. Un total de ocho reactivos acuosos únicos pueden fluir a través de las entradas (I_1-8) hacia la unión en T, donde se encuentran con las fases oleosas de las entradas de aceite (O_1-2) para formar tapones que se recogen en la salida. Cada canal de flujo de entrada está bajo el control de un canal de control único (C_1-8). (B) Se muestra el esquema del chip microfluídico junto con las conexiones de los tubos a las entradas, los canales de control y los reactivos de aceite junto con los tubos de salida. Las flechas indican la dirección del flujo de fluido en la tubería. El recuadro muestra el principio de funcionamiento de las válvulas PDMS. Las líneas discontinuas indican que la capa de control está debajo de la capa de flujo. Esta cifra ha sido modificada con respecto a Dubuc et al⁴⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Esquema de la configuración de hardware para la producción de enchufes. Las bombas de presión controlan el flujo de reactivos (tanto acuosos como de aceite) en los canales de entrada, y las válvulas solenoides controlan el accionamiento de las válvulas PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El programa de interfaz principal para controlar el dispositivo microfluídico. Este programa a medida permite la presurización manual de válvulas neumáticas individuales (panel blanco). También permite la ejecución de un experimento completo (panel azul) donde acepta un archivo de .csv con las poblaciones de enchufes deseadas y los parámetros necesarios, como los tiempos de presurización y despresurización de la válvula, y muestra el estado de la ejecución del experimento, incluyendo qué canales de control están presurizados y cuáles no, en tiempo real. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Accionamiento de la válvula accionada por presión. Imágenes de microscopía de campo claro de (A) la válvula PDMS (horizontal) despresurizada y el canal de entrada (vertical) abierto y (B) la válvula PDMS presurizada y cerrando el canal de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Esquema de la configuración de grabación de datos. El tubo de recolección está conectado a una jeringa con aceite, que se fija a una bomba. Los tapones se vuelan a través del tubo de recolección y las imágenes y videos se capturan con un microscopio de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Efecto del accionamiento de la válvula en el caudal a una presión de entrada dada. (A) Esquema de la configuración de hardware utilizada para monitorear el caudal en los canales microfluídicos. La respuesta del caudal en los canales cuando se opera a diferentes presiones de entrada de (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar y (E) 1200 mbar. La duración del accionamiento de la válvula se muestra en la región sombreada en rojo. Se utilizó agua destilada para todos los experimentos. La desviación estándar de tres mediciones independientes se muestra mediante la región sombreada en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Relación entre la presión y el caudal de los reactivos en los canales de entrada tras el accionamiento de la válvula. (A) En una válvula de régimen de presión de entrada constante (300 mbar), el caudal se reduce a cero al accionar la válvula. (B) En un régimen de caudal constante (2,5 μL / min), el accionamiento de la válvula da como resultado una rápida acumulación de presión en el canal hasta que la válvula se despresuriza. La duración del accionamiento de la válvula se muestra en la región sombreada en rojo. Se utilizó agua destilada para todos los experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Producción de poblaciones de tapones fluorescentes. (A) Esquema de la configuración experimental que representa la conexión de los diferentes reactivos al dispositivo. Abreviaturas: F = fluoresceína, W = agua destilada, B = colorante alimentario azul, FC-40 = aceite fluorado y MO = aceite mineral. (B) Imagen de muestra de la tubería de recolección que contiene tapones. (C) Los datos brutos obtenidos del análisis muestran la intensidad de fluorescencia media medida en una región de interés (ROI) especificada frente al número de fotogramas del archivo de vídeo. Las líneas rojas muestran la media de la fluorescencia máxima para cada condición (población de tapones producidos con una combinación específica de tres entradas), y las líneas discontinuas muestran el error estándar correspondiente. (D) Diagramas de caja de la altura de los picos en las diferentes condiciones. Los puntos corresponden a picos individuales, las cajas para cada condición van desde el primer al tercer cuartil de la distribución de los picos correspondientes, y la línea gruesa se utiliza para el valor mediano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: El programa de interfaz principal para el funcionamiento del dispositivo. La interfaz de control para la presurización manual de los canales de control y la ejecución de un experimento automático en el dispositivo de ocho entradas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Programa de interfaz principal alternativo para el funcionamiento del dispositivo. La interfaz de control para hacer funcionar un dispositivo de ocho entradas sin función de código de barras. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Subprograma de LabVIEW con variables globales. SubVI del programa de interfaz principal que enumera y muestra el estado de las variables globales en el programa de interfaz principal, es decir, los canales de control. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Programa LabVIEW para guardar valores de variables globales. SubVI del programa de interfaz principal que guarda el estado actual de las válvulas como una matriz, que se utilizará para mantener el mismo estado de las válvulas en caso de que el usuario esté inactivo durante más de 30 segundos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 5: Programa LabVIEW del Protocolo de Control de Transmisión (TCP). SubVI para mantener la conexión TCP entre el programa de interfaz principal y el controlador WAGO. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6: Subprograma LabVIEW de variable global TCP. Programa para almacenar la variable de salida TCP. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero complementario 7: Insumo para la realización de experimentos automáticos. El archivo .csv que codifica la composición, secuencia y réplicas de las poblaciones de tapones para llevar a cabo experimentos para producir tapones fluorescentes cuantitativos, como se detalla en este artículo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 8: Script de Python para el análisis de la población de tapones fluorescentes. Script de python personalizado para leer los valores de fluorescencia de la grabación de enchufes (archivo .avi). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 9: Salida del análisis de fluorescencia de tapones. Salida del script de Python que contiene valores de fluorescencia para un ROI de 5x5 a partir de la grabación de los enchufes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 10: Programa R para leer el archivo de salida. Programa personalizado utilizado en este trabajo para leer los valores fluorescentes de salida y trazar datos brutos, alturas de picos y desviaciones estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 11: Funciones de R para analizar y trazar datos fluorescentes. Las funciones de R personalizadas que se utilizan para 1. Cortar los datos brutos de los valores fluorescentes, 2. definir diferentes condiciones experimentales, 3. Identificar los picos de las condiciones dadas, 4. Graficar los datos brutos y las condiciones detectadas superpuestas, y 5. Trace los picos identificados y los datos brutos superpuestos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

En este artículo, se ha presentado un conjunto de protocolos para la fabricación y operación de un dispositivo microfluídico basado en PDMS para la generación automatizada de bibliotecas combinatorias en compartimentos de agua en aceite llamados tapones. La combinación de la microfluídica con la tecnología de gotas proporciona una técnica potente para encapsular una pequeña cantidad de reactivos en un gran número de compartimentos, lo que abre vías para el cribado combinatorio a gran escala.

Anteriormente, se han descrito varias tecnologías para generar compartimentos químicamente distintos utilizando microfluídica, cada una con sus ventajas y limitaciones. Kulesa et ^al.50, describieron una estrategia para encapsular células con códigos de barras en gotas utilizando placas de microtitulación y fusionar estas gotas utilizando un campo eléctrico para crear una biblioteca combinatoria. Si bien este enfoque puede generar muchas combinaciones de gotas, está limitado por la necesidad de pasos de manipulación manual en el flujo de trabajo. Tomasi et ^al.51 desarrollaron una plataforma microfluídica para fusionar una gota que contiene esferoide (agregados celulares flotantes libres) con una gota de estímulo, permitiendo así la manipulación del microambiente esferoide. Este método permite el estudio de fenómenos importantes como las interacciones célula-célula y el efecto de los fármacos, pero su rendimiento es relativamente bajo. Eduati et ^al.46 y Utharala et ^al.47 desarrollaron una plataforma basada en válvulas microfluídicas que puede generar bibliotecas combinatorias de alto rendimiento de forma automatizada. Sin embargo, en estos estudios, las válvulas se operan utilizando un dispositivo Braille, lo que requiere engorrosos pasos de alineación entre la microválvula y el chip microfluídico. Una característica clave del sistema descrito en este documento es la implementación de válvulas neumáticas PDMS para regular el flujo de fluido en los canales de entrada. Dado que estas válvulas están basadas en PDMS, se pueden incorporar sin problemas en los pasos de fabricación del chip microfluídico. Además, son una opción relativamente sencilla para controlar el flujo de líquidos en los canales de entrada, ya que pueden accionarse aplicando presión a través de una fuente de gas externa. Finalmente, se puede programar la duración y la secuencia de presurización y despresurización de estas válvulas, automatizando así la producción de distintas poblaciones de tapones de una manera de alto rendimiento. Otra característica importante es el uso de regímenes de presión constante para la inyección de reactivos a través de la entrada, lo que permite optar por no incorporar canales de residuos para aliviar cualquier acumulación de presión que surja en un régimen de caudal constante. Esto simplifica el diseño del dispositivo, reduce la necesidad de válvulas y hardware adicionales para controlar las válvulas del canal de residuos y minimiza el desperdicio de reactivos.

Si bien la fabricación de dispositivos con PDMS es relativamente sencilla, la implementación de dichos dispositivos requiere el uso de una amplia parafernalia de hardware, como las válvulas solenoides neumáticas (para controlar el accionamiento de las válvulas PDMS), bombas de presión (para controlar el flujo de reactivos de entrada y aceite) y programas de software (para regular las válvulas solenoides). Si bien representan una inversión significativa, dicha configuración proporciona consistencia y confiabilidad para el funcionamiento exitoso del dispositivo. Además, los componentes de hardware y la arquitectura descritos en este protocolo se configuran de forma modular. Por lo tanto, se pueden utilizar alternativas para algunos módulos para reducir costos o para adaptarlos a una necesidad específica. Por ejemplo, existe una variedad de bombas que se pueden utilizar en función de la utilidad, el presupuesto, la disponibilidad y la conveniencia 52,53,54. Se pueden incorporar componentes adicionales, como depósitos de fluidos y reguladores de temperatura, para reactivos de entrada sensibles²³. Además, este diseño puede ampliarse o reducirse para abordar necesidades científicas específicas. Por ejemplo, en este artículo, se describe un prototipo de ocho entradas que permite combinar ocho reactivos únicos para producir tapones. Esto se puede escalar a un dispositivo de 16 entradas que permite un mayor número de entradas y combinaciones más grandes de las mismas. En consecuencia, necesitará canales de control adicionales y válvulas solenoides para abordar las entradas, pero un prototipo de este tipo permite generar bibliotecas combinatorias más grandes y diversas. Finalmente, en este artículo, cada población de tapones se produce por la apertura de tres de las ocho entradas acuosas del dispositivo microfluídico. Se observó que, para tal configuración, una presión de aproximadamente 200 mbar para los reactivos de aceite y de 400 mbar para los reactivos acuosos correspondía a un régimen de producción de tapones, que es impulsado únicamente por el accionamiento de la válvula. Cuando se aplicaron presiones más altas a los aceites, se observó una ruptura de los tapones, y la aplicación de presiones más bajas condujo a una fusión de los tapones. El régimen de presión óptimo para la producción de tapones depende de una amplia gama de factores, como el número de entradas que contribuyen a la formación de un tapón, la naturaleza y la viscosidad de los fluidos y las dimensiones de los canales, y debe optimizarse cuando sea necesario.

Uno de los inconvenientes de operar en un régimen de presión constante es que los fluidos con diferentes viscosidades tienen diferentes caudales bajo presión constante. Por lo tanto, debe asegurarse de que los reactivos acuosos que fluyen a través de las entradas sean de viscosidades comparables. El uso de fluidos de diferentes viscosidades afectará no solo el flujo de fluido en los canales de entrada, sino también la formación de tapones en la unión en T, comprometiendo así la composición de las poblaciones de tapones. Otro inconveniente es la contaminación de una población de tapones a partir de reactivos residuales en la unión en T. Cuando el dispositivo cambia entre la producción de diferentes poblaciones de enchufes, el primer/último enchufe en la secuencia de cada población tiende a ser contaminado por la población anterior o la siguiente. Esto se puede superar produciendo réplicas adicionales de cada población y descontando el tapón contaminado durante el análisis. Por último, también existe la posibilidad de variación entre dispositivos individuales que surge de inconsistencias en la fabricación y/o fuentes externas (fluctuaciones de presión). Este problema se puede mitigar reutilizando un solo chip microfluídico varias veces y asegurándose de que se realice una ejecución completa de una biblioteca combinatoria en un solo chip para minimizar el efecto de estas inconsistencias.

El dispositivo microfluídico y el conjunto de protocolos operativos que lo acompañan presentados en este artículo se han utilizado para demostrar la producción de una biblioteca combinatoria cuantitativa de tapones. Por lo tanto, esta plataforma puede generar rápidamente bibliotecas combinatorias de distintas poblaciones de enchufes de una manera de alto rendimiento. Como resultado, estas tecnologías se pueden utilizar para una variedad de propósitos de detección, incluidos, entre otros, el cribado combinatorio de fármacos en muestras de biopsias de pacientes, en el que un pequeño número de células recuperadas de una biopsia puede distribuirse en un gran número de gotas y tratarse con una gran combinación del fármaco anticancerígeno para optimizar la terapia individual para una muestra de paciente determinada y, por lo tanto, acelerar la terapia personalizada contra el cáncer^{46. 48,55}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,3,3 tetrametildisiloxano	Merck Life Science NV	MFCD00008256
módulo de entrada/salida digital de 4 canales	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-504
Acetona	Boom Labs	BOOMSKEUZW3
software de análisis	Universidad Tecnológica de Eindhoven	https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11D	Merck Ciencias de la Vida NV	212299	Fotorreprotección positiva
Revelador AZ 726 MIF	Merck Life Science NV		10055824960 Revelador para fotorresistencia positiva
Biopsy Punch, Rapid Core	World Precision Instruments Germany, GMBH	504529	0.75 mm ID, W/Plunge
Blue colorante alimentario	PME	FC1036
Módulo final del controlador	WAGO Kontakttechnik GmbH	Ethernet 750-600
	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-881
FC-40	Merck Millipore	F9755-100ML
Unidad de flujo	Fluigent Sistema de presión Fluigent	FLU-S-D
 	Fluigent	MFCS-EZ	0 - 2 bar
Fluoresceína	Merck Life Science NV	MFCD00005050
Placa caliente	Torrey Pines Scientific	HP61
	Instrumentos Nikon	Eclipse Ti-E
Isopropanol	Boom Labs	BOOMSKEUZE3
LabVIEW (versión de software 20)	Universidad Tecnológica de Eindhoven	https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1	Todos los archivos han sido guardados para LabVIEW versión 20. Se recomienda utilizar esta versión o superior para abrir los archivos.
Talones Luer	Laboratorios Instech, Inc.	LS23	calibre 23, conectores
Luer a lengüeta macho de 0,5"	Cole Parmer	45505-32 y nbsp;	3/32" de diámetro interior
Tubo de PTFE MasterFlex	Avator/VWR	48634
Portaobjetos de microscopio	VWR	470150-480
Portaobjetos de microscopio,  Aceite	Corning	2947-75X50
Merck	Millipore	330760-1L
mr DEV 600	Micro resist Technology	R815100	Revelador para horno fotorresistente negativo
	Thermo Scientific	Heraeus T6P 50045757
Plasma de oxígeno asher	Quorum Technologies	K1050X
Photomask	CAD/Art Services, Inc.
Diseño de fotomáscara	Universidad Tecnológica de Eindhoven (Adaptado de Merten Lab, EPFL)	https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Conjunto de válvulas neumáticas	FESTO		1x 8 conjuntos de válvulas, Válvulas normalmente cerradas
Obleas de	silicio Materiales		< 1-0-0>, 100 mm de diámetro, 525 μ m de espesor
Cuchillas de un solo filo	GEM Scientific
Tubo blando	Fluigent		1 mm de diámetro interior, 3 mm de diámetro exterior
Recubrimiento giratorio	Corporación de Tecnologías Laurell	WS-650MZ-23NPPB
Microscopio estereoscópico	Corporación Olympus	SZ61
SU-8 3050	Kayakli Advanced Materials	Y311075 1000L1GL	Fotorresistencia negativa
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)	Dow	1317318
Jeringa	B Braun Injekt - F Jeringa de dosificación fina	10303002
Sistema de exposición UV-LED	Idonus	Bomba de vacío UV-EXP150S-SYS
	Vacuumbrand GmbH	MD1C
Básculas de pesaje	Sartorius	M-prueba