Artículo de método

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

DOI:

10.3791/66169

⸱

5 de enero de 2024

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los condensados biomoleculares formados a través de la separación de fases líquido-líquido (LLPS) se han considerado críticos en la organización celular y en un número creciente de funciones celulares. La caracterización de la LLPS en células vivas también es importante porque la condensación aberrante se ha relacionado con numerosas enfermedades, incluidos cánceres y trastornos neurodegenerativos. La LLPS a menudo es impulsada por interacciones selectivas, transitorias y multivalentes entre proteínas intrínsecamente desordenadas. De gran interés son las dinámicas de interacción de las proteínas que participan en LLPS, que se resumen bien mediante mediciones de su tiempo de residencia de unión (RT), es decir, la cantidad de tiempo que pasan unidas dentro de los condensados. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de células vivas de una sola molécula que nos permite medir el RT medio de una proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultáneamente las moléculas de proteína individuales y los condensados con los que se asocian, utilizamos el seguimiento de una sola partícula (SPT) para trazar trayectorias de una sola molécula y, a continuación, ajustamos las trayectorias a un modelo de unión proteína-gota para extraer la RT media de la proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos donde se aplicó este método de imagen de una sola molécula para comparar los RT medios de una proteína en sus condensados de LLPS cuando se fusiona y no se fusiona con un dominio oligomerizante. Este protocolo es ampliamente aplicable a la medición de la dinámica de interacción de cualquier proteína que participe en LLPS.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un creciente cuerpo de trabajo sugiere que los condensados biomoleculares juegan un papel importante en la organización celular y numerosas funciones celulares, por ejemplo, la regulación transcripcional 1,2,3,4,5, la reparación del daño del ADN 6,7,8, la organización de la cromatina 9,10,11,12, el cromosoma X inactivación 13,14,15 y señalización intracelular 16,17,18. Además, la desregulación de los condensados biomoleculares está implicada en muchas enfermedades, incluyendo cánceres 19,20,21 y trastornos neurodegenerativos 22,23,24,25,26. La formación de condensado a menudo es impulsada por interacciones transitorias, selectivas y multivalentes proteína-proteína, proteína-ácido nucleico o ácido nucleico-ácido nucleico27. Bajo ciertas condiciones, estas interacciones pueden conducir a la separación de fase líquido-líquido (LLPS), una transición de densidad que enriquece localmente biomoléculas específicas en gotas sin membrana. Tales interacciones multivalentes a menudo están mediadas por las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) de las proteínas 1,28,29. La caracterización biofísica de estas interacciones a nivel molecular es fundamental para nuestra comprensión de numerosas funciones celulares sanas y aberrantes, dada la omnipresencia de condensados a través de ellas. Aunque las técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia confocal, por ejemplo, la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)30,31,32, se han utilizado ampliamente para demostrar cualitativamente que los intercambios moleculares entre los condensados y el entorno celular circundante son dinámicos, la cuantificación de la dinámica de interacción de biomoléculas específicas dentro de los condensados generalmente no es posible utilizando la microscopía confocal convencional o de una sola molécula Microscopía sin métodos especializados de análisis de datos. La técnica de seguimiento de una sola partícula (SPT) descrita en este protocolo se basa en la microscopía de molécula única de célula viva33 y proporciona una herramienta excepcionalmente poderosa para cuantificar la dinámica de interacción entre proteínas específicas dentro de condensados. La lectura de SPT para dicha medición es el tiempo medio de residencia de una proteína de interés en los condensados.

El protocolo se puede dividir en dos partes: adquisición de datos y análisis de datos. El primer paso de la adquisición de datos de imagen es expresar en las células una proteína de interés que se fusiona con un HaloTag34. Esto permite el marcaje de la proteína de interés con dos fluoróforos, donde la mayoría de las moléculas de proteína deben marcarse con un fluoróforo no fotoactivable (por ejemplo, el ligando35 de Halo JFX549) y una pequeña fracción de ellas se marcará con un fluoróforo fotoactivable espectralmente distinto (por ejemplo, el ligando36 de Halo PA-JF646). Esto permite la adquisición simultánea de todas las ubicaciones de condensado en la celda y la adquisición de películas de una sola molécula de la proteína de interés que se unen y desunen a los condensados. Mientras tanto, el mismo tipo de células se modifican para expresar de manera estable H2B marcada con Halo, una histona que es en gran parte inmóvil en la cromatina. A continuación, las células se tiñen con el ligando PA-JF646 Halo para permitir la obtención de imágenes de H2B de una sola molécula. Como se discutirá en detalle a continuación, este experimento tiene en cuenta la contribución del fotoblanqueo para permitir una cuantificación precisa de la dinámica de interacción de la proteína de interés. A continuación, las células para experimentos de obtención de imágenes deben cultivarse en cubreobjetos limpios, teñirse con ligandos HaloTag y ensamblarse en una cámara de obtención de imágenes de células vivas. A partir de ahí, se obtienen imágenes de la muestra bajo iluminación de lámina óptica laminada y altamente inclinada (HILO) en un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) capaz de obtener imágenes de dos canales y detección de una sola molécula. A continuación, la emisión se divide en dos cámaras, una que rastrea las posiciones del condensado y otra que rastrea moléculas individuales. La adquisición se realiza con un largo tiempo de integración (del orden de cientos de ms) para difuminar las proteínas que se difunden libremente y capturar solo las proteínas que son menos móviles debido a la unión a estructuras estables en la célula37.

El primer paso del análisis de datos es utilizar un algoritmo establecido de seguimiento de una sola partícula (SPT)38,39 para localizar moléculas de proteína individuales en cada fotograma de la película y ensamblar las localizaciones en una trayectoria para cada molécula a lo largo de su vida útil detectable. A continuación, las trayectorias se clasifican en las que representan moléculas dentro y las que representan moléculas fuera de los condensados comparando las localizaciones de las moléculas a lo largo de sus trayectorias con las localizaciones de todos los condensados en los tiempos correspondientes1.

A continuación, se genera una curva de supervivencia (1 - CDF) utilizando las longitudes de todas las trayectorias en condensado. A continuación, se extrae el tiempo medio de residencia aparente de las moléculas ajustando la curva de supervivencia al siguiente modelo exponencial de unión a proteínas de dos componentes,

figure-introduction-1,

con A como la fracción de moléculas no unidas específicamente y con kobs,ns y kobs,s como las tasas de disociación observadas de las moléculas no unidas específicamente y específicamente unidas, respectivamente. A partir de aquí en adelante, solo se considera kobs,s. La dinámica tanto de la disociación deproteínas, k true,s, como del fotoblanqueo del fluoróforo, kpb, contribuyen a k obs,s como

figure-introduction-2;

así, para aislar los efectos de la disociación de proteínas, se mide la tasa de disociación específica de H2B-Halo en la línea celular mencionada anteriormente.

figure-introduction-3

H2B es una proteína que se integra de forma estable en la cromatina y que experimenta una disociación mínima en la escala de tiempo de la adquisición de una película de una sola molécula37. Su tasa de disociación específica es entonces igual a la tasa de fotoblanqueo del ligando PA-JF646 Halo, o

figure-introduction-4.

El tiempo medio de residencia en condensado de la proteína de interés, figure-introduction-5, es entonces

figure-introduction-6.

Se muestran resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40 , donde se aplicó este protocolo para demostrar que la fusión de un dominio de oligomerización con IDR da como resultado tiempos de residencia más largos de la IDR en sus condensados. Este resultado sugiere que el dominio de oligomerización añadido estabiliza las interacciones homotípicas de la IDR que impulsa la LLPS. En principio, se puede aplicar el mismo método con protocolos ligeramente modificados para caracterizar las interacciones homotípicas o heterotípicas de cualquier proteína que participe en la formación de cualquier tipo de condensados.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Marcaje de proteínas en células

  1. Exprese la proteína de interés fusionada a HaloTag en la línea celular deseada.
  2. Exprese de manera estable H2B marcado con Halo en el mismo tipo de células que en 1.1 utilizando transposones o transducción viral.

2. Preparación de cubreobjetos

  1. Antes de usar cubreobjetos para cultivos celulares, límpielos para eliminar los contaminantes autofluorescentes.
    1. Monte los cubreobjetos #1.5 de 25 mm de diámetro en una rejilla de tinción de cerámica y colóquelos en un recipiente de polipropileno.
    2. Sumerja completamente los cubreobjetos en una solución 1 M de KOH y sonique durante 1 h.
    3. Enjuague los cubreobjetos tres veces con agua bidestilada (ddH2O).
    4. Sumergir completamente los cubreobjetos en etanol al 100% y sonicar durante 1 h.
    5. Sumergir completamente los cubreobjetos en etanol al 20% diluido con ddH2O y conservar a 4 °C hasta su uso.

3. Preparación de células para microscopía

NOTA: Realice los pasos de esta sección en una cabina de bioseguridad para evitar la contaminación de las células.

  1. Coloque las celdas en cubreobjetos limpios. Realice 2 días antes de la obtención de imágenes si la proteína marcada con Halo se va a expresar transitoriamente. Realizar 1 día antes de la obtención de imágenes si la proteína marcada con Halo se expresa de forma estable o endógena.
    1. Use pinzas estériles para colocar cubreobjetos en una placa de 6 pocillos (un cubreobjetos/pocillo por muestra de célula) y deje que el etanol residual se evapore.
    2. Coloque una placa en cada pocillo con un número adecuado de células para lograr una confluencia del 70 % en el momento de la obtención de imágenes. Coloque un pocillo adicional con células que expresen H2B-Halo de forma estable con la misma confluencia objetivo.
    3. Siga este paso solo si expresa transitoriamente la proteína marcada con Halo de interés. Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2. A continuación, transfecte las células con el plásmido que codifica la proteína marcada de interés utilizando los reactivos de transfección adecuados y siguiendo las directrices del fabricante.
    4. Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2.
  2. Tiñir las células que expresan la proteína marcada con Halo de interés con un ligando Halo no fotoactivable (p. ej., JFX549) y un ligando Halo fotoactivable (p. ej., PA-JF646). Tiñe las células que expresan H2B-Halo solo con el ligando Halo fotoactivable.
    NOTA: Las concentraciones de ligandos de Halo enumeradas aquí deben usarse como punto de partida; La concentración óptima dependerá del nivel de expresión y de la concentración local en condensado de la proteína de interés.
    1. Para cada muestra de célula que exprese la proteína marcada con Halo de interés, diluir 100 nM JFX549 Haloligando 35 y 20 nM PA-JF646 Haloligando 36 en 500 μL de medio celular apropiado. Para cada muestra que exprese H2B-Halo, diluir solo 20 nM del ligando PA-JF646 Halo en 500 μL de medio celular apropiado.
    2. Para cada pocillo, aspire el medio existente, agregue 2 ml de PBS 1x, luego aspire PBS (esto se conoce como "enjuague" para el resto del protocolo) y reemplácelo con un medio que contenga los ligandos Halo apropiados.
    3. Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.
    4. Enjuague con PBS cuatro veces y reemplácelo con medios nuevos que no contengan ligandos Halo.
    5. Incubar durante 15 min a 37 °C y 5% de CO2.
    6. Repita los pasos 3.2.4 y 3.2.5 tres veces (cuatro ciclos de enjuague-incubación en total).
    7. Utilice pinzas estériles para transferir el cubreobjetos con células a una cámara de cubreobjetos de cultivo celular compatible con la platina del microscopio.
    8. Agregue medios libres de rojo de fenol a la cámara y proceda a la obtención de imágenes. Incubar las muestras que no se están fotografiando inmediatamente a 37 °C y 5% de CO2 hasta que se necesiten.

4. Imágenes de una sola molécula

NOTA: Los experimentos independientes que miden los tiempos de residencia tanto de H2B como de la proteína de interés deben realizarse a lo largo de varios días (≥3) para generar resultados estadísticamente significativos. Antes de obtener imágenes de muestras de células en el microscopio, alinee las dos cámaras utilizando microesferas teñidas de 0,1 μm (Tabla de materiales) o un estándar de calibración similar.

  1. Prepara el microscopio.
    1. Encienda el microscopio y la computadora que controla el microscopio.
    2. Encienda los componentes de incubación de células vivas (calentador y CO2) en el microscopio y ajústelo a 37 °C y 5% de CO2. Permita que el sistema se equilibre.
    3. Coloque una gota del aceite apropiado en un objetivo de inmersión en aceite TIRF 100x en el microscopio y cargue la muestra celular en la platina del microscopio.
  2. Identifique una celda para obtener una imagen.
    1. Obtenga una imagen de la muestra de celda bajo iluminación de campo claro y ajuste la posición z hasta que las celdas estén enfocadas.
    2. Identificar una célula que exhibe características morfológicas de células sanas.
    3. Recorte el campo de visión (FOV) para que solo capture el núcleo de la célula objetivo.
    4. Utilice la iluminación láser y ajuste el ángulo TIRF hasta que se logre la iluminación HILO41 con una relación señal-ruido óptima de moléculas individuales.
  3. Imagen H2B-Halo en células vivas.
    NOTA: Las potencias láser utilizadas en esta sección son específicas de este experimento y se incluyen como ejemplo. Las potencias láser apropiadas deben elegirse de acuerdo con los criterios enumerados en la discusión.
    1. Establezca una configuración de adquisición de la siguiente manera. Establezca el tiempo de exposición en 500 ms. Durante cada exposición de 500 ms, excite las moléculas de Halo H2B marcadas con PA-JF646 con un haz de 9,1 mW y 640 nm. Durante el tiempo muerto entre fotogramas (158,01 μs en el sistema de imágenes utilizado aquí), fotoactiva las moléculas con un haz de 111 μW y 405 nm.
    2. Capture 2000 fotogramas de forma continua con estos ajustes. Aumente gradualmente la potencia del haz de 405 nm en el transcurso de la adquisición cuando el número de moléculas fotoactivadas sea insuficiente.
  4. Imagen de la proteína marcada con Halo de interés en células vivas.
    1. Utilice un espejo dicroico de paso largo para dividir las longitudes de onda de emisión entre dos cámaras, una para detectar PA-JF646 y la otra para detectar JFX549. Utilice filtros de emisión apropiados frente a las cámaras.
    2. Utilice la misma configuración de adquisición descrita en 4.3.1 con la siguiente modificación. Agregue un canal JFX549 adicional para realizar un seguimiento de las ubicaciones de los condensados de proteínas marcados con Halo a lo largo del tiempo. Cada 10 s, adquiera una trama (500 ms, 2,1 mW, 561 nm de excitación) en el canal JFX549 mientras mantiene la adquisición del canal PA-JF646. Esto provocará una fuga en el canal PA-JF646, que se solucionará en el análisis de datos posterior a la adquisición.
    3. Capture 2000 fotogramas de forma continua con estos ajustes. Aumente gradualmente la potencia del haz de 405 nm en el transcurso de la adquisición cuando el número de moléculas fotoactivadas sea insuficiente.

5. Análisis de datos de imágenes de una sola molécula

NOTA: Los parámetros utilizados en la sección 5 son específicos de este experimento y se incluyen como ejemplo. Los parámetros apropiados deben elegirse de acuerdo con los criterios enumerados en la discusión.

  1. Prepare los datos de imágenes sin procesar para su procesamiento.
    1. Para los datos de la proteína de interés, convierta cada canal del archivo de datos de imágenes sin procesar en un archivo de .tif independiente utilizando ImageJ o un software de procesamiento de imágenes similar. Para los datos de H2B, convierta el canal único del archivo de datos de imágenes sin procesar en un archivo .tif de la misma manera.
      NOTA: Dependiendo del software de adquisición que se utilice, puede haber fotogramas vacíos en la película de condensado, ya que solo se toma un fotograma de seguimiento de condensado cada 10 s. Las tramas vacías deben rellenarse con la trama de condensado más reciente (algún software de adquisición lo hace automáticamente). Además, si hay un sangrado significativo desde el canal de condensado (JFX549) hacia el canal de una sola molécula (PA-JF646) durante esos marcos de seguimiento de condensado, los marcos de una sola molécula correspondientes deben reemplazarse con el marco de una sola molécula más reciente.
    2. Si hay fotogramas que deban reemplazarse en cualquiera de las películas debido a las razones anteriores, reemplácelos con el fotograma más reciente de esa película modificando (si es necesario) y ejecutando pretracking_comb.txt, una macro ImageJ disponible en Chong et al.1 y siguiendo las indicaciones.
  2. Genere trayectorias de una sola partícula utilizando un software SPT, por ejemplo, SLIMfast39, una implementación GUI del algoritmo MTT38 disponible en Teves et al.42.
    1. Cargue el archivo de 5.1.2 que contiene la película de una sola molécula en SLIMfast haciendo clic en Cargar > pila de imágenes.
    2. Ajuste los parámetros (tasa de error de localización: 10-6; bucles de deflación: 3) para la localización haciendo clic en OPT > Hoja: Localización.
    3. Ajuste los parámetros (pico de emisión: 664 nm; tiempo de retraso: 500 ms) para la adquisición haciendo clic en OPT > Hoja: Adquisición.
    4. Visualice las localizaciones de todas las moléculas en un solo fotograma para asegurarse de que los parámetros elegidos son los adecuados (TEST LOC). Si no es apropiado, modifique los parámetros de los pasos 5.2.2 y 5.2.3 y repita este paso.
    5. Genere un archivo que contenga las localizaciones de todas las moléculas en cada fotograma (LOC ALL).
    6. Cargue el archivo de 5.2.5 en SLIMfast haciendo clic en Cargar > datos de partículas > SLIMfast.
    7. Ajuste los parámetros (coeficiente de difusión máximo esperado: 0,1 μm2/s; número máximo de competidores: 5) para la generación de trayectorias haciendo clic en OPT > Hoja: Seguimiento.
    8. Generar un fichero que contenga las trayectorias de todas las moléculas (GEN TRAJ).
  3. Filtre las trayectorias que son más cortas que tmin, 2,5 s, utilizando evalSPT39, disponible en Drosopoulos et al.43, para tener en cuenta los errores de seguimiento que dan lugar a trayectorias artificialmente cortas.
    1. Cargue el archivo de 5.2.8 en evalSPT (+ > archivo de 5.2.8 > OK).
    2. Ajuste los parámetros (mín.: 5 fotogramas; max: longitud máxima de trayectoria para el archivo de 5.2.8) para filtrar las trayectorias inferiores a 2,5 s.
    3. Genere un archivo con todas las trayectorias filtradas (EXPORTAR DATOS).
  4. Siga este paso solo para las trayectorias de la proteína de interés. Clasifique las trayectorias en las de los condensados y las de los condensados, y luego extraiga el tiempo medio de residencia en el condensado.
    NOTA: Todos los códigos de esta sección están disponibles en Chong et al.1.
    1. Umbralice todos los fotogramas de la película adquiridos en el canal JFX549 para generar una película time-lapse rellenada con la máscara binaria de evolución temporal que resalta las ubicaciones de condensación ejecutando la macro, el núcleo y el clúster de ImageJ mask_v2.txt y siguiendo las indicaciones.
    2. Reformatear las trayectorias de una sola molécula generadas en 5.3.3. utilizando el script de MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, y ajustando los nombres de archivo, las rutas y los parámetros según sea necesario. ( Parámetros: Exposición, 0,5 s; Resolución, 0,16 μm/píxel).
    3. Ordene las trayectorias en función de la fracción de vida útil que una molécula determinada pasa en un condensado, F, utilizando el script de MATLAB, categorization_v4.m, y ajustando los nombres de archivo y las rutas según sea necesario.
    4. Proceda utilizando solo trayectorias en condensado.
  5. Extraiga kobs,s y kpb y calcule el tiempo medio de residencia corregido, figure-protocol-1.
    1. Extraiga kobs,s de las trayectorias de la proteína de interés en condensado utilizando el script de MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, y ajustando los nombres de archivo, las rutas y los parámetros según sea necesario.
      ( Parámetros: Exposición, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogramas).
    2. Extraiga kpb de las trayectorias H2B utilizando el script de MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, y ajustando los nombres de archivo, las rutas y los parámetros según sea necesario.
      ( Parámetros: Exposición, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 fotogramas).
    3. Calcule el tiempo medio de residencia corregido de la proteína de interés unida específicamente a sus condensados, figure-protocol-2, como
      figure-protocol-3
      NOTA: Se deben realizar controles para verificar que los diferentes tiempos de exposición que son lo suficientemente largos como para difuminar las partículas móviles, por ejemplo, 300 ms y 800 ms, siguen dando como resultado el mismo tiempo medio de residencia de la proteína de interés.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40, donde utilizamos este protocolo SPT para comparar la dinámica de interacción de dos proteínas en sus respectivos condensados de LLPS autoensamblados. TAF15 (factor 15 asociado a la proteína de unión a la caja TATA) contiene una IDR que puede sufrir LLPS tras la sobreexpresión en células humanas. Planteamos la hipótesis de que la fusión de TAF15 (IDR) con FTH1 (cadena pesada de ferritina 1), que forma un oligómero de 24 subunidades, conduciría a interacciones proteína-proteína homotípicas más estables que impulsan la LLPS. Para probar esta hipótesis, expresamos transitoriamente en células U2OS la fusión Halo-TAF15 (IDR) o TAF15 (IDR)-Halo-FTH1 y realizamos imágenes de una sola molécula a dos colores de cada proteína siguiendo el protocolo anterior. En la Figura 1A se muestra un fotograma representativo de una película TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Las moléculas detectadas en el canal PA-JF646 se localizaron y esas localizaciones se ensamblaron en trayectorias. Las trayectorias resultantes se clasificaron entre poblaciones dentro y fuera del condensado comparándolas con una máscara binaria que resalta las ubicaciones del condensado (Figura 1B). Si bien solo mostramos una pequeña fracción de las trayectorias para una buena visibilidad, existe una clara distinción entre las trayectorias de las moléculas unidas a los condensados y unidas fuera de los condensados. A continuación, se ajustó una curva de supervivencia de las longitudes de trayectoria en condensado contra el modelo exponencial de dos componentes (Figura 1C). Finalmente, se extrajeron y graficaron los tiempos medios de residencia después de la corrección para el fotoblanqueo para ambas proteínas (Figura 1D). Encontramos que el tiempo medio de residencia de Halo-TAF15(IDR) en sus condensados LLPS fue de 10,23 s ± 1,10 s, mientras que el de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 fue de 64,15 s ± 11,65 s. Este resultado sugiere que la adición del dominio oligomerizante a TAF15 (IDR) estabiliza la unión proteína-condensado.

figure-results-1
Figura 1: El método basado en SPT resuelve las diferencias en los tiempos de residencia de las proteínas en sus condensados. Fotogramas representativos de una película de una sola molécula de dos colores de TAF15(IDR)-Halo-FTH1. Las proteínas se marcaron con una combinación de una mayor concentración de colorante no fotoactivable (100 nM JFX549, amarillo) para visualizar las ubicaciones de los condensados, y una concentración más baja de colorante fotoactivable (20 nM PA-JF646, magenta) para visualizar proteínas individuales, lo que permitió SPT. Se adquirieron películas en las mismas condiciones de imagen para Halo-TAF15 (IDR) y películas de un solo canal, PA-JF646 para H2B-Halo. Una línea discontinua blanca delinea el núcleo. B. Imagen combinada representativa superpuesta a una máscara binaria de posición de condensado (gris) y trayectorias (multicolor). C. Curva de supervivencia representativa de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 ajustada con el modelo exponencial de dos componentes. D. El tiempo medio de residencia de Halo-TAF15 fue significativamente más corto que el de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 en sus respectivos condensados. El valor de cada proteína se promedió a partir de 20 células medidas en experimentos independientes realizados durante tres días. El error se propagó como error estándar de la media y el asterisco representa una diferencia significativa en el tiempo de residencia de las dos proteínas (p<0.05, prueba de suma de rangos de Wilcoxon). Esta figura ha sido adaptada con permiso de Irgen-Gioro et al.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para sistemas como los investigados en Irgen-Gioro et al.40. Dependiendo de la aplicación, se pueden modificar algunos componentes del protocolo, por ejemplo, el método para generar líneas celulares marcadas con fluorescencia, el sistema de etiquetado fluorescente y el estilo de cubreobjetos utilizado. El marcaje con halo de una proteína en una célula se puede realizar utilizando dos estrategias, dependiendo de cuál sea más adecuada para un experimento determinado. 1) Expresión exógena: fusión de la proteína de interés a un HaloTag y expresión de la fusión en una línea celular diana, ya sea de forma transitoria mediante transfección o de forma estable mediante transposones o transducción viral. 2) Edición del genoma: golpear un HaloTag en el locus del gen que codifica la proteína endógena de interés en una línea celular diana utilizando técnicas de edición del genoma, por ejemplo, CRISPR44. Los beneficios y desventajas de cada uno de ellos se discuten en otro lugar45, pero brevemente, la estrategia de expresión exógena requiere menos tiempo, pero produce una población de células con una amplia gama de niveles de expresión que a menudo no son fisiológicos. La estrategia de edición del genoma lleva mucho más tiempo, pero etiqueta las proteínas de interés expresadas endógenamente en sus niveles de expresión nativos.

Además, este protocolo no requiere específicamente el uso de un HaloTag; más bien, es compatible con cualquier etiqueta que permita el etiquetado simultáneo de una sola molécula y de conjunto de la misma proteína en la célula. Por lo tanto, el protocolo se puede modificar para su uso con otras etiquetas de autoetiquetado como SNAP-tag46. Por último, se pueden utilizar placas comerciales prelimpiadas con fondo de vidrio para cultivos celulares, como las placas MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), en lugar de las cámaras de cubreobjetos, siempre que sean compatibles con el objetivo del microscopio y el aceite de inmersión; Sin embargo, los cubreobjetos se pueden limpiar más a fondo inmediatamente antes de su uso, por lo que son preferibles.

Si bien las modificaciones anteriores al protocolo son opcionales, hay parámetros experimentales y de análisis que deben optimizarse, a saber, las concentraciones de ligandos HaloTag, las potencias del láser, los parámetros de localización y seguimiento, y tmin. La concentración del ligando HaloTag no fotoactivable debe elegirse de manera que el condensado esté marcado lo suficientemente densamente como para permitir la generación de máscaras. La concentración del ligando HaloTag fotoactivable y la potencia del láser de fotoactivación deben elegirse de tal manera que las moléculas de proteína estén marcadas y fotoactivadas lo suficientemente escasamente como para generar trayectorias de una sola partícula de calidad, ya que un exceso de localizaciones en cada fotograma dará lugar a una generación de trayectorias inexacta. Para los experimentos mostrados en los resultados representativos, generalmente hubo menos de cinco localizaciones por fotograma. La potencia del láser de excitación debe mantenerse lo suficientemente baja como para minimizar el fotoblanqueo rápido, pero lo suficientemente alta como para localizar moléculas individuales con precisión. Los parámetros de localización y seguimiento de una sola molécula deben ajustarse en función de la densidad de excitaciones y la dinámica de difusión esperada de la proteína de interés. Por último, los valores de figure-discussion-1 deben calcularse en un intervalo de tmin (a partir de 0 s y aumentando en incrementos de tiempo de exposición). Los valores de figure-discussion-2 deben converger por encima de un umbral de tmin; este tmin debe utilizarse en el paso 5.3.

El método aquí descrito cuantifica la dinámica de interacción de las proteínas dentro de los condensados con una precisión que es inaccesible para las técnicas convencionales. Además, puede hacerlo en células vivas con una perturbación mínima de la muestra. Esto es fundamental, ya que los comportamientos de interacción de los IDR, incluida su formación de condensado, dependen en gran medida de su entorno local40.

Los resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40 demuestran la capacidad de este método para extraer los tiempos de residencia de las proteínas que se unen a sus condensados de LLPS autoensamblados. Es importante destacar que este método se puede expandir fácilmente a cualquier proteína que se una a cualquier tipo de condensado a través de interacciones homotípicas o heterotípicas. Además, no se limita a medir la dinámica de interacción de las proteínas sometidas a LLPS. Se ha demostrado que la oncoproteína de fusión EWS::FLI1, que se sabe que causa sarcoma de Ewing, forma centros locales de alta concentración que desempeñan un papel esencial en sus funciones de activación transcripcional y transformación oncogénica 1,2. Si bien la formación de estos centros está impulsada por interacciones IDR-IDR transitorias, selectivas y multivalentes de EWS::FLI1, hasta ahora, todavía no hay evidencia convincente de que sean condensados de LLPS 1,2 de buena fe. Aun así, utilizamos el método presentado aquí para medir el tiempo medio de residencia de EWS::FLI1 en sus hubs y demostramos que la mutación de residuos específicos y la deleción de su IDR desestabilizaron significativamente la unión de EWS::FLI1 a sus hubs1.

A pesar de la versatilidad de este método para caracterizar la dinámica de unión de proteínas dentro de condensados, se debe tener precaución al elegir el modelo para la unión de proteínas en contextos específicos. Los datos bioquímicos existentes apoyan la idea de que una distribución exponencial de dos componentes es a menudo un modelo apropiado para muchos sistemas 1,37,40,42, pero también se ha demostrado que la misma distribución es una representación inapropiada de la unión a proteínas en otros sistemas donde los modelos alternativos como la exponencial de tres componentes 47,48,49 y las distribuciones de ley de potencia 50 coincidir mejor con las observaciones experimentales. Para evitar sacar conclusiones inexactas, se debe elegir y motivar cuidadosamente un modelo, verificar que la calidad del ajuste respalde el uso del modelo e interpretar juiciosamente los resultados.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. DGE-1745301 (S.Y.), Premio Académico Pew-Stewart (Carolina del Sur), Premio Académico Searle (Carolina del Sur), Beca de Investigación de la Fundación Shurl y Kay Curci (Carolina del Sur), Beca Semilla de Innovación Merkin (Carolina del Sur), Beca de Investigación Mallinckrodt (Carolina del Sur) y la Beca de Investigación Margaret E. Subvención Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. también cuenta con el apoyo de los NIH/NCI bajo la Adjudicación Número P30CA016042.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,1 y micro; m Microesfera TetraSpeckInvitrogenT7279Imagen de una sola molécula
25 mm de diámetro, #1.5 CubreobjetosMarienfeld Superior111650Preparación de cubrecubreobjetos
593/40 nm filtro de paso de bandaSemrockFF01-593/40-25Imagen de molécula única
676/37 nm filtro de paso de bandaSemrockFF01-676/37-25Imagen de una sola molécula
6 pocillos TC PlateGenesee25-105MPPreparación de células para microscopía
Línea celular: U-2 OSATCCHTB-96Marcaje de proteínas en células
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Análisis de datos de imágenes de una sola molécula: Disponible en Chong et al., 2018
Cubreobjetos Staining RackThomas24957Preparación de cubreobjetos
Janelia Fluor 549 (JFX549)Investigación JaneliaPreparación de células para microscopía
DMEM, baja glucosaGibco10-567-022Marcaje de proteínas en células: Medios de crecimiento utilizados: DMEM con 5% de suero fetal bovino, 1% penstrep
Microscopio invertido Eclipse Ti2-ENikonImágenes de molécula única
Etanol 200 ProofLab AlleyEAP200-1GALPreparación de cubreobjetos
evalSPTAnálisis de datos de imágenes de una sola molécula: Disponible en Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Marcaje de proteínas en células: Medios de crecimiento utilizados: DMEM con 5% de suero fetal bovino, 1%
penstrep FijiAnálisis de datos de imágenes de una sola molécula
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Imagen de una sola molécula
Dichroico dicroico Divisor de hazSemrockDi02-R635-25x36Imagen de una sola molécula: Divisor de haz rojo/rojo lejano
Unidad láser LUN-F NikonImagen de una sola molécula: 405/488/561/640
Placa de fondo de vidrio MatTekMatTekP35G-1.5-20-CPreparación de células para microscopía: 35 mm, placa de cubreobjetos #1.5 para cultivo celular.
NIS-ElementsNikonImágenes de molécula única: software de adquisición de microscopio
núcleos y clústeresAnálisis de datos de imágenes de una sola molécula: Disponible en Chong et al., 2018
Penicilina-estreptomicinaGibco15-140-122Marcaje de proteínas en células: Medios de crecimiento utilizados: DMEM con 5% de suero fetal bovino, 1% de penstrep
Solución salina tamponada confosfatoThermo Fisher Scientific18912014Marcaje de proteínas en células
Fotoactivable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparación de células para microscopía
PLOT_ResidenceHist_css.mAnálisis de datos de imágenes de una sola molécula: Disponible en Chong et al., 2018
Hidróxido de potasioMallinckrodt Chemicals6984-06Preparación de cubreobjetos
pretracking_comb.txtAnálisis de datos de imágenes de una sola molécula: Disponible en Chong et al., 2018
SLIMfastAnálisis de datos de imágenes de una sola molécula: Disponible en Teves et al., 2016
Sistema de incubación de etapa superiorTokai HitImágenes de una sola molécula: para imágenes de células vivas
Divisor de imágenes de doble emisión TwinCamCairn Researchde imagen de molécula
única Branson5800Preparación de cubreobjetos
Campus de mask_v2.txt de Limpiador ultrasónico

Referencias

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