El artículo presenta métodos para el cultivo larvario del gasterópodo Crepidula fornicata en un sistema a escala de laboratorio de pequeño volumen y en un sistema de mesocosmos de agua de mar ambiental que se puede implementar en el campo.
Artículo de método
Cultivo en Laboratorio y Campo de Larvas de la Lapa Zapatilla, Crepidula fornicata
En este artículo
Resumen
Resumen
El molusco gasterópodo caliptídico, Crepidula fornicata, ha sido ampliamente utilizado para estudios de biología, fisiología y ecología del desarrollo de las larvas. Las larvas veliger incubadas de esta especie se recolectaron mediante sifón en un tamiz después de la liberación natural por parte de los adultos, se distribuyeron en el cultivo a una densidad de 200/L y se alimentaron con Isochrysis galbana (cepa T-ISO) a 1 x 105 células/mL. Se documentó el crecimiento de la cáscara y la adquisición de competencia para la metamorfosis en larvas hermanas criadas en cultivos ventilados de 800 mL diseñados para el equilibrio con el aire ambiente o con mezclas de gases atmosféricos definidas. Contrastando con estas condiciones de cultivo de laboratorio; También se recogieron datos de crecimiento y competencia de larvas criadas en un mesocosmos de agua de mar ambiental de 15 L situado en una población de campo de adultos reproductivos. Las tasas de crecimiento y el momento de la competencia metamórfica en los cultivos de laboratorio fueron similares a los reportados en estudios publicados anteriormente. Las larvas criadas en el mesocosmos de campo crecieron mucho más rápido y se metamorfosearon antes de lo reportado en cualquier estudio de laboratorio. En conjunto, estos métodos son adecuados para explorar el desarrollo larvario en condiciones controladas predeterminadas en el laboratorio, así como en condiciones naturales en el campo.
Introducción
La lapa zapatilla, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), está bien representada en la literatura de investigación actual e histórica debido a su utilidad como modelo de desarrollo y debido a sus impactos generalizados como especie invasora. Sirvió como un ejemplo fundamental del desarrollo espiraliano en la era clásica de la embriología experimental1 y ha experimentado un renacimiento del interés con la aplicación de imágenes modernas y herramientas genómicas para diseccionar los mecanismos del desarrollo temprano de los lofototocozoos 2,3. En el otro extremo de su historia de vida, otras investigaciones se han centrado en los impactos de las poblaciones adultas de este ingeniero de ecosistemas en ambientes marinos costeros templados muy alejados de su distribución original en el este de América del Norte 4,5. Entre el embrión y el adulto, las larvas veliger de esta especie han sido objeto de numerosos estudios sobre el desarrollo y la ecología de las larvas, especialmente sobre los factores que influyen en el crecimiento y la adquisición de competencia para la metamorfosis, las señales internas y externas que median el asentamiento de las larvas y los efectos de la experiencia larvaria en el rendimiento de los juveniles 6,7,8,9,10,11 . Estudios recientes han revelado la resistencia de larvas y juveniles de C. fornicata a la acidificación de los océanos, una vía más para el uso productivo de este animal en la investigación 12,13,14,15,16.
Una ventaja de C. fornicata para los estudios de la biología de las larvas marinas es que es relativamente fácil de cultivar en el laboratorio en agua de mar natural o artificial con una dieta unialgal del flagelado Isochrysis galbana. Los métodos de cultivo han sido detallados por el autor en una publicación impresa anterior centrada en los métodos17. Las razones de la presente contribución son dos. En primer lugar, las maniobras físicas rutinarias involucradas en el establecimiento y cuidado de las culturas son conceptualmente muy simples, pero difíciles de realizar correctamente sin una demostración práctica o en video. En segundo lugar, se describen dos variaciones de los métodos de cultivo descritos anteriormente que son especialmente adecuados para los estudios de laboratorio y de campo de las respuestas a los factores de estrés ambiental como la acidificación de los océanos, la eutrofización y el agotamiento del oxígeno. El primero de ellos es un sistema de cultivo de bajo volumen (800 mL) adecuado para la manipulación del pH y el oxígeno disuelto en el agua de mar a través de pequeños volúmenes de gases burbujeados, y el segundo es un sistema de mesocosmos de mayor volumen (15 L) que se puede colocar en el campo y que permite el libre intercambio de agua de mar ambiental.
Protocolo
1. Maniobras rutinarias para el establecimiento y mantenimiento de cultivos larvarios de C. fornicata
NOTA: Este método comienza con un frasco de un galón (3.8 L) de agua de mar que contiene C. fornicata adulta que acaba de liberar larvas de veliger incubadas. Los adultos pueden ser recolectados en el campo u obtenidos de un proveedor que se indica en la Tabla de Materiales. Los adultos son hermafroditas protándricos que viven en pilas de apareamiento con hembras incubadoras sésiles en la parte inferior de la pila. No rompa las pilas de adultos. La estacionalidad de la reproducción y los métodos para acondicionar a los adultos para el desove fuera de temporada han sido descritos previamente17. Las larvas se recolectan mejor dentro de las 2-3 horas posteriores a la liberación, cuando son fuertemente geonegativas y se concentrarán cerca de la superficie del frasco.
- Haga un colador cortando la parte inferior de un vaso de plástico desechable de tres esquinas de 400 ml y pegando un panel de malla de nailon de 236 μm. Para este propósito y especialmente para la construcción del mesocosmos (abajo), use un pegamento termofusible que esté formulado para una buena adherencia al polietileno.
- Retire la aireación del frasco para adultos y déjelo reposar durante 15-20 minutos para que los desechos se asienten y las larvas puedan nadar fácilmente hacia la superficie.
- Sifón las larvas a través de un tubo de vidrio de 5 mm de longitud corta (15-20 cm) fijado al extremo de un tubo de acuario de plástico blando de 60-80 cm de longitud en el tamiz preparado como se ha indicado anteriormente, suspendido en un vaso de precipitados de vidrio de 600 mL de modo que el exceso de agua de mar desborde el vaso de vidrio mientras las larvas quedan retenidas en el tamiz. Mantenga el fondo del tamiz bajo el agua y evite varar las larvas.
- Levante brevemente el tamiz del vaso de precipitados y use una botella rociadora de agua de mar filtrada (FSW) para enjuagar las larvas en un recipiente de vidrio de FSW que sea de un tamaño conveniente para manipular bajo un microscopio de disección de baja potencia.
NOTA: Las larvas de C. fornicata prosperan en agua de mar natural filtrada con una salinidad cercana a los 30 ppt o en agua de mar artificial Instant Ocean con hasta 32 ppt de salinidad, a 20-25 °C17,18. La filtración a < 1 μm es suficiente para eliminar las incrustaciones de protistas epizoóticas que pueden causar problemas en los cultivos de laboratorio. - Transfiera y cuente manualmente el número deseado de larvas en un frasco de cultivo con una pipeta Pasteur. Para obtener los mejores resultados, use 1 larva/5 mL de volumen de cultivo para C. fornicata. Cuente las larvas y evite la tentación de estimar números.
- Alimente a las larvas con la ración deseada de microalgas cuando se inicie el cultivo y cada dos días reemplace las microalgas cuando se reemplace el agua de cultivo.
NOTA: Una dieta de 1 x 105 células/mL de Isochrysis galbana (cepa T-ISO) es una buena dieta estándar que produce tasas de crecimiento de laboratorio casi máximas. La ración de alimentos y los métodos para el cultivo de T-ISO se proporcionan en una publicación anterior17. - Cambie el agua de cultivo cada dos días vertiendo el contenido del cultivo en un colador dentro de un vaso de precipitados, como en el paso 1.3 anterior. Levante el tamiz y use una botella rociadora de FSW para enjuagar las larvas en un frasco de cultivo de FSW fresco con alimento nuevo.
NOTA: La mejor práctica es separar cualquier cristalería utilizada para el cultivo de larvas y evitar cualquier contacto de esa cristalería con fijadores, sales solubles de metales pesados o detergentes. La limpieza de rutina se realiza mejor con una pasta de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y una almohadilla de nailon, mientras que los depósitos minerales se pueden eliminar con un lavado ácido suave en vinagre blanco o HCl diluido.
2. Construcción de cultivos ventilados para larvas de C. fornicata
NOTA: El frasco de vidrio recomendado (Tabla de Materiales) tiene una tapa de polipropileno, que es inerte al agua de mar y tiene el grosor adecuado para sujetar las entradas de las lengüetas de los tubos para una corriente de gas de ventilación.
- Taladre dos agujeros de 5 mm en la tapa de cada frasco de cultivo (incluido el revestimiento interior de la tapa), cada uno a aproximadamente 1,5 cm del borde y uno frente al otro. (Una broca de maquinista imperial de 13/64 pulgadas o estándar ASME # 7 también hará un orificio de separación apropiado).
- Instale un adaptador de tubo de nylon roscado de 1/8 de pulgada x 10-32 en cada orificio, usando una tuerca de nylon 10-32, con la lengüeta del tubo en la superficie exterior de la tapa.
- Aplique un poco de sellador de acuario de caucho de silicona en la abertura de la parte interior roscada de uno de los adaptadores de tubo y empuje un tubo de polietileno de 20 cm de longitud de 2 mm (diámetro exterior) a través de la abertura desde el interior para que sobresalga unos mm más allá de la abertura exterior de la lengüeta del tubo.
- El tubo ahora tendrá un pequeño tapón de sellador de acuario en el extremo que sobresale a través de la lengüeta del tubo, pero el tubo transparente será visible justo más allá del extremo de la lengüeta. Deje que el sellador se seque, luego corte el extremo que sobresale del tubo de polietileno para que quede al ras con el extremo de la lengüeta del tubo.
- Llene el frasco de cultivo con FSW hasta 1 cm del hombro en la parte superior del frasco, atornille la tapa y conecte el suministro de aire de ventilación o mezcla de gases experimentales a la lengüeta del tubo que sostiene el tubo de ventilación de polietileno. Recorta la longitud del tubo de ventilación de modo que su extremo quede perfectamente en el fondo del frasco.
- Ajuste el flujo del aire de ventilación o la mezcla de gases para producir un flujo lento de burbujas (Figura 1). Utilice una bomba de aire de acuario con válvulas comunes de grupo de acuario para suministrar aire ambiente a la ventilación o utilice controladores de flujo másico para otras mezclas experimentales de gases atmosféricos14.
3. Construcción de un cultivo de mesocosmos desplegable en campo para larvas de C. fornicata
- Corte 4 aberturas rectangulares espaciadas uniformemente, cada una de 25 cm x 14.5 cm, en los lados de un balde de polietileno estándar de 7 galones. Coloque la parte inferior de cada abertura a unos 3,5 cm de la parte inferior interior del cubo (Figura 2A). Una sierra de sable eléctrica de mano con una hoja de dientes finos es ideal para este propósito. Guarde los trozos de desecho recortados y córtelos a lo largo en tiras de 2 cm de ancho con una sierra de mesa.
- Recorte 4 paneles de malla de nailon de 236 μm, cada uno de al menos 30 cm x 20 cm, para superponer cómodamente (al menos 2 cm) las aberturas recortadas en el cubo. Asegure temporalmente un borde de un panel de malla sobre un borde largo de su corte con pequeñas abrazaderas de resorte o pinzas para la ropa.
- Pegue el borde del panel de malla a la abertura del cubo con pegamento termofusible formulado para polietileno. Una vez que hayas fijado el primer borde, pega los otros bordes mientras mantienes la tensión para obtener una superficie tensa en el panel de malla.
- Recorte las longitudes de las tiras de las piezas de desecho del cubo del paso 3.1, para hacer tiras de refuerzo para cubrir cuidadosamente el área pegada donde los paneles de malla se superponen a las aberturas del cubo. Presione cada tira de cobertura en su lugar con una cantidad generosa de pegamento termofusible, trabajando rápidamente para colocar cada tira en su lugar antes de que el pegamento se endurezca.
- Asegure el extremo de cada tira con un remache ciego de nailon instalado desde el exterior del balde. Recorte el exceso de pegamento y malla de los bordes exteriores de las tiras de refuerzo con una navaja de afeitar.
NOTA: Cada remache requiere un orificio piloto de 15/64 pulgadas. Las partes interiores (ciegas) de los remaches son visibles en el interior del mesocosmos terminado en la Figura 2B. - Despliega el mesocosmos en un estante flotante que sostenga la parte superior del cubo muy por encima del agua (Figura 2C). El bastidor flotante que se muestra está hecho de segmentos de 30 cm de tubería de PVC Schedule 40 de 2 pulgadas, cementados entre sí con juntas en codo y T para hacer una estructura hermética que puede sostener una fila de 4 mesocosmos replicados.
- Dependiendo de las condiciones locales, los paneles de malla pueden ensuciarse en 1-2 días, de una manera que impide el intercambio de agua de mar a través del mesocosmos. En la medida en que esto ocurra, transfiera las larvas a un mesocosmos fresco y limpio sacando el mesocosmos sucio 2/3 del agua y sacándolo repetidamente de su fondo al mesocosmos fresco con una jarra de 2 L.
- Realice de 20 a 25 iteraciones para transferir la mayoría de las larvas, o hasta que ya no se observen larvas en el mesocosmos contaminado. Limpie el mesocosmos sucio frotando suavemente los paneles de malla con una esponja suave cargada con una pasta de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y enjuague con agua del grifo.
Resultados
El crecimiento larvario y la adquisición de competencia para la metamorfosis se midieron en 4 réplicas simultáneas de los cultivos ventilados de 800 mL, cada uno con 160 larvas, derivadas de un lote de larvas hermanas que eclosionaron de una sola masa de huevos y que fueron alimentadas con Isochrysis galbana a una densidad de 1 x 105 células/mL. El pH fue de 7.9-8.0, la temperatura de 20-21 °C y la salinidad de 30-31 ppt. También se determinó el crecimiento y la metamorfosis con un lote diferente de larvas hermanas en un solo ensayo del mesocosmos de 15 L que contenía 600 larvas, desplegado en Buzzards Bay, MA, EE.UU., en condiciones de pH, temperatura y salinidad similares a las de los cultivos de laboratorio, pero alimentados por fitoplancton natural en el agua de mar ambiental que fluía a través de los paneles de malla del mesocosmos. El pH medido fue de 7,8-8,3, la temperatura de 20-24 °C y la salinidad de 26-28 ppt. El crecimiento se determinó como un cambio en la longitud de la cáscara (Figura 3). Las larvas crecieron más rápido en el mesocosmos (71 μm/día) que en los cultivos de laboratorio (54 μm/día) durante los primeros 4-5 días después de la eclosión (Figura 4). Entre el5º y el6º día, las larvas del mesocosmos comenzaron a metamorfosearse espontáneamente, y las larvas que permanecieron en el mesocosmos en el día 6 eran, en promedio, 181 μm más grandes que en el día 5. No hubo más mediciones larvales del mesocosmos porque la mayoría de los individuos se habían metamorfoseado en el día 7. Las larvas en los cultivos de laboratorio crecieron a un ritmo mucho más lento desde el día 4 hasta el día 8 (41 μm/día) y desde el día 8 hasta el día 13 (31 μm/día). Estas larvas comenzaron a ser competentes para la metamorfosis en el día 8 y casi todas eran competentes en el día 12, según lo determinado por la estimulación de submuestras con [K+] elevado, descrito en8. Hubo poca metamorfosis espontánea en los cultivos de laboratorio (<10%) hasta el día 13, cuando se terminó el experimento. La supervivencia fue del 91%-100% en los cultivos de laboratorio y no se determinó en el mesocosmos debido a la dificultad de inspeccionar y recuperar a todos los individuos del volumen y las superficies del mesocosmos.
Figura 1: Configuración de cultivo ventilado. La figura muestra 800 mL de cultivos ventilados que contienen larvas de Crepidula fornicata, sembrados a una densidad de 1 larva/5 mL. Observe un fino chorro de burbujas, especialmente visible en los frascos 2 y 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de la cultura del mesocosmos desplegable en el campo. La figura muestra un mesocosmos de 15 L, (A) vista lateral, (B) vista superior y (C) configuración desplegada en un bastidor flotante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Larva Veliger de Crepidula fornicata a los 4 días después de la eclosión. La línea discontinua indica el eje de medición de la longitud del proyectil. Abreviaturas: s = concha; v = velum; f = pie; o = opérculo. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Crecimiento de larvas de Crepidula fornicata en cultivos de laboratorio y de campo. Crecimiento de larvas en cultivos de laboratorio de 800 mL (línea discontinua, círculos abiertos) y mesocosmos de campo de 15 L (línea continua, cuadrados rellenos). Cada punto representa la media de 15 larvas de cada uno de los 4 cultivos de laboratorio replicados o la media de 25 larvas de un solo mesocosmos. Las barras de error se ± 1 SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Aunque las larvas de C. fornicata son relativamente fáciles de cultivar en comparación con otras larvas marinas planctotróficas, la atención a los fundamentos de las buenas prácticas de cultivo sigue siendo esencial17,19. Las larvas sanas deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la eclosión. Esto se verifica fácilmente al día siguiente de la eclosión observando sus intestinos llenos, repletos de células de algas, utilizando un microscopio de disección con transiluminación. Las conchas de las larvas sanas deben permanecer limpias, brillantes y libres de incrustaciones visibles por protistas ciliados pedunculados o diatomeas pennadas sésiles, que se propagan rápidamente en cultivos abarrotados. La suciedad de la concha inhibe la natación y la alimentación, causa mortalidad y, por lo general, es una indicación de que la densidad de larvas en el cultivo es demasiado alta.
Las tasas de crecimiento larvario y el momento de la competencia documentados aquí en los cultivos de laboratorio ventilados son similares a los resultados publicados de experimentos de laboratorio que utilizaron una versión anterior de este método en condiciones similares de densidad larvaria, pH, temperatura, salinidad y ración de alimento 13,14,16. La única diferencia sustancial entre el método descrito aquí y el utilizado en los últimos estudios es que en el presente experimento, la corriente de gas de ventilación se introdujo a través de un tubo de 2 mm (diámetro exterior) que creó una corriente de burbujas desde el fondo del frasco de cultivo, en lugar de pasar a través del espacio de cabeza en la superficie del frasco. Por lo tanto, la circulación y la mezcla de agua creadas por la corriente de burbujas no son perjudiciales para el crecimiento de las larvas y la adquisición de competencia, y pueden tener ventajas para los experimentos que requieren un equilibrio rápido del agua de mar de cultivo con las mezclas de gases cambiantes, por ejemplo, para los experimentos que investigan los efectos de los ciclos de diel en las presiones parciales de CO2 yO2 disuelto, como los que se producen en los entornos marinos productivos cercanos a la costa20. Artículo 21.
Los resultados del mesocosmos arrojaron tasas de crecimiento larvario superiores a las que se han publicado en estudios de laboratorio, así como el menor tiempo para la adquisición de la competencia para la metamorfosis22,23. Aunque los resultados presentados se obtuvieron en condiciones de campo que fueron claramente muy favorables para el crecimiento y desarrollo de las larvas, el método debería ser más informativo para explorar el rendimiento de las larvas en sitios de campo que exhiben combinaciones naturales de factores de estrés ambiental, incluidos hábitats en riesgo y degradados que son de interés para fines de manejo y remediación24.
Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que denunciar.
Agradecimientos
El desarrollo inicial del sistema de cultivo ventilado de bajo volumen fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias (CRI-OA-1416690 a Dickinson College). La Dra. Lauren Mullineaux amablemente proporcionó instalaciones de laboratorio en la Institución Oceanográfica Woods Hole, donde se recopilaron los datos presentados para este sistema (Figura 4).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cucharón, Polietileno, 7 galones | US Plastic | 16916 | para mesocosmos |
| Crepidula fornicata | Laboratorio de Biología Marina, Centro de Recursos Marinos | 760 | reproductores adultos |
| Pegamento termofusible, Infinity Supertac 500 | Hotmelt.com | INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB | bueno para pegar polietileno |
| Tarro, vidrio, 32 oz, con tapa de polipropileno | Uline | S-19316P-W | para cultivos ventilados de 800 mL |
| malla Nitex, 236 y micro; m | Dynamic Aqua Supply Ltd. | NTX236-136 | para mesocosmos |
| Tuerca, hexagonal, nylon, rosca 10-32 | Home Depot | 1004554441 | para sujetar púas de tubos |
| Remaches, nylon, ciegos, 15/64" de diámetro, rango de agarre de 5/32"-5/16", paquete de 8 | autopartes NAPA | BK 6652844 | Se necesitan 4 paquetes por mesocosmos |
| Lengüeta de tubo de 1/8" x 10-32 rosca | US Plastic | 65593 | Se necesitan 2 por frasco |
| de cultivoTubería, polietileno, 2,08 mm de diámetro exterior | Fisher Scientific | 14-170-11G | para ventilar el flujo de gas dentro de un frasco de cultivo |
| Tubería, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32" | US Plastic | 57810 | se adapta a las lengüetas para ventilar cultivos |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
