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Monitorización de la glucosa en sangre en crías de ratón después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides

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DOI:

10.3791/66212

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17 de mayo de 2024

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo de ratón de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y transferencia de embriones (ET), lo que nos permite observar cambios relacionados con la edad en el metabolismo de la glucosa que pueden atribuirse a ICSI, proporcionando información sobre sus posibles impactos a largo plazo en el desarrollo humano.

Resumen

La esperanza de vida humana es considerablemente larga, mientras que los modelos de ratón pueden simular toda la vida humana en un período relativamente corto, con un año de vida del ratón aproximadamente equivalente a 40 años humanos. La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) es una tecnología de reproducción asistida comúnmente utilizada en la práctica clínica. Sin embargo, dada su aparición relativamente reciente hace unos 30 años, los efectos a largo plazo de esta técnica en el desarrollo humano siguen sin estar claros. En este estudio, establecimos el método ICSI combinado con el método de transferencia embrionaria (ET) utilizando un modelo de ratón. Los resultados demostraron que los espermatozoides normales de ratón, después de someterse a un cultivo in vitro y a una ICSI posterior, mostraron una tasa de fertilización del 89,57% y una tasa de dos células del 87,38%. Después de la ET, la tasa de natalidad de la descendencia fue de aproximadamente el 42,50%. Además, a medida que los ratones envejecían, se observaron fluctuaciones en los niveles de metabolismo de la glucosa, que pueden estar asociadas con la aplicación de la técnica ICSI. Estos hallazgos significan que la técnica ICSI-ET de ratón proporciona una plataforma valiosa para evaluar el impacto de las anomalías de los espermatozoides en el desarrollo embrionario y sus efectos a largo plazo en la salud de la descendencia, particularmente en lo que respecta al metabolismo de la glucosa. Este estudio proporciona información importante para futuras investigaciones sobre los efectos potenciales de la técnica ICSI en el desarrollo humano, haciendo hincapié en la necesidad de una investigación en profundidad sobre las implicaciones a largo plazo de esta tecnología.

Introducción

Las cuestiones de fecundidad se han convertido en uno de los principales focos de preocupación médica y sociológica, especialmente en la sociedad moderna, donde la disminución de las tasas de fecundidad y la creciente gravedad de la prevalencia y gravedad de la infertilidad han cobrado importancia. La tecnología de reproducción asistida (TRA) ofrece una amplia gama de posibilidades para abordar estos desafíos, con la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) comúnmente utilizada como intervención terapéutica.

Desde que Palermo reportó el primer embarazo exitoso logrado a través de la Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) en 1992, la ICSI se ha convertido en una técnica fundamental en las Tecnologías de Reproducción Asistida (TRA)1. Sin embargo, teniendo en cuenta que la ICSI se ha utilizado en entornos clínicos durante solo 30 años, un período relativamente breve en comparación con la esperanza de vida humana, los efectos a largo plazo de la ICSI, especialmente en el desarrollo de la descendencia, no se han investigado ni dilucidado ampliamente. En la actualidad, los ratones, caracterizados por su origen genético uniforme y su menor esperanza de vida, han surgido como un modelo alternativo ampliamente utilizado en la investigación médica. Además, el modelo de ratón puede recapitular toda la vida humana dentro de un marco de tiempo comprimido, donde un año en ratones corresponde aproximadamente a 40 años en humanos2.

Durante la última década, varios estudios a pequeña escala han informado que las personas concebidas a través de ICSI pueden tener un mayor riesgo de desarrollar síndromes metabólicos, como niveles anormales de azúcar en la sangre, más adelante en la vida 3,4. Aunque la evidencia no es definitiva, este hallazgo ha suscitado serias preocupaciones dentro de la comunidad científica con respecto a las implicaciones a largo plazo para la salud de la ICSI. Esta situación pone de relieve la necesidad apremiante de realizar evaluaciones más rigurosas de la terapia antirretroviral y de sus consecuencias para la salud a largo plazo. Particularmente a la luz de las limitaciones y consideraciones éticas de los estudios en humanos, el desarrollo de modelos animales que puedan recapitular con precisión el desarrollo de la descendencia humana después de la ICSI se ha vuelto cada vez más crucial. En este contexto, el modelo de ratón ICSI-ET (Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides-Transferencia de Embriones), debido a su capacidad para imitar el ICSI humano y facilitar el seguimiento a largo plazo de los resultados de salud de la descendencia, se ha convertido en una herramienta eficaz para evaluar los riesgos potenciales para la salud de la tecnología ICSI en la descendencia5.

Este estudio tiene como objetivo investigar el impacto de la tecnología ICSI-ET en un fenotipo metabólico prevalente, a saber, la salud metabólica de la glucosa en la descendencia, mediante el empleo de monitoreo aleatorio de glucosa en sangre, pruebas de glucosa en sangre en ayunas y pruebas de tolerancia a la glucosa para evaluar el estado metabólico de la glucosa de ratones. El monitoreo aleatorio de la glucosa en sangre se utiliza para capturar las fluctuaciones naturales en el metabolismo de la glucosa durante las actividades fisiológicas normales, mientras que las pruebas de glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa se emplean para evaluar posibles estados prediabéticos.

Protocolo

El protocolo de ICSI-ET que se describe a continuación sigue las pautas y ha sido aprobado por la investigación Animal Ethical Review del Instituto de Planificación Familiar de Shanghai. Procedimientos de seguridad: Siempre use equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando manipule productos químicos o materiales biológicos. Uso de campanas: Realice todos los procedimientos que involucren productos químicos volátiles o generación de aerosoles dentro de una campana extractora certificada o un gabinete de bioseguridad. Utilice ratones hembra (cepa B6D2F1 de 6-8 semanas de edad) para el procedimiento de superovulación.

1. ICSI en ratones

  1. Superovulación de ratones
    1. Administrar una inyección intraperitoneal de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) a una dosis de 7,5 UI por ratón alrededor de las 20:00 del primer día.
    2. Administrar una inyección intraperitoneal de gonadotropina coriónica humana (HCG) a una dosis de 7,5 UI por ratón alrededor de las 20:00 (48 horas después de la inyección de PMSG) al tercer día.
  2. Prepare el medio HTF en alícuotas de 1 mL y déjelas al descubierto para su equilibrio durante la noche a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% el mismo día de la inyección de HCG en ratones hembra.
  3. Preparación de gotitas de fertilización ICSI
    1. El mismo día de la inyección de HCG en ratones hembra, divida la tapa de una placa de cultivo celular de 50 x 9 mm en mitades superior e inferior. Use la mitad superior para crear 4-6 gotas de 5 μL cada una, usando un 10% de polivinilpirrolidona (PVP) para la colocación de espermatozoides. Utilice la mitad inferior para crear de 8 a 10 gotas de 5 μL cada una, utilizando medio M2 para el procedimiento ICSI.
    2. Cubra las gotas medianas PVP y M2 con aproximadamente 3 mL de aceite mineral (Figura 1).
  4. Elaboración de platos de cultivo
    1. El mismo día de la inyección de HCG en ratones hembra, dispensar 12 gotas de medio KSOM (MR-020P-D) de 20 μL de manera uniforme en una placa de cultivo celular de 35 x 10 mm. Cubre las gotas con aproximadamente 3 mL de aceite mineral.
  5. Recolección de espermatozoides:
    1. Eutanasia de ratones machos por luxación cervical aproximadamente a las 9:00 a.m. del cuarto día (13 h después de la inyección de HCG).
    2. Aísle la cola del epidídimo y límpiela a fondo para eliminar cualquier tejido adiposo y restos de sangre secando suavemente con gasa estéril y enjuagando con un medio HTF precalentado.
    3. Abra la cola del epidídimo para permitir que los espermatozoides naden libremente hacia el medio HTF. Exprima suavemente la cola con pinzas para liberar los espermatozoides, recójalos en tubos HTF preequilibrados y manténgalos descubiertos en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 para la capacitación de los espermatozoides para su uso posterior.
  6. Extracción de ovocitos
    1. Eutanasia de ratones hembra estimulados para la recuperación de ovocitos por luxación cervical alrededor de las 9:30 a.m. del cuarto día. Haga una incisión con cuidado a lo largo de la línea media de la piel abdominal y la capa muscular para exponer la cavidad abdominal.
    2. Use pinzas finas para aislar suavemente el tejido de ambos lados de los oviductos, especialmente las regiones de ampollas inflamadas, y transfiéralo al medio M2 en una placa de cultivo esterilizada. Repita este procedimiento hasta que se recojan los oviductos de todos los ratones designados.
    3. Bajo un microscopio de disección, utilice una aguja de jeringa de 1 mL para perforar suavemente la sección transparente de la ampolla hinchada del oviducto, facilitando la liberación de complejos cúmulo-ovocito (COC) en el medio.
    4. Con la misma jeringa, recoja y transfiera con cuidado los AOC a una nueva placa que contenga 100 μL de medio M2 fresco. Repita este paso hasta que todos los AOC se transfieran con éxito desde los segmentos de oviducto originales.
    5. Limpie la sangre y los fluidos tisulares y, bajo un microscopio de disección, abra la ampolla del oviducto con una aguja de 25 G, lo que resulta en la liberación de numerosos AOC.
    6. Retire el oviducto y los fragmentos de tejido, transfiera los AOC a gotas de medio M2 que contenga hialuronidasa (HY) y precaliéntelos a 37 °C.
    7. Después de la incubación durante aproximadamente 5 min, realice un pipeteo suave para facilitar la separación de las células del cúmulo y los ovocitos. Transfiera los ovocitos de la metafase II (MII) de la solución que contiene HY a un medio M2 fresco; luego, realice la transferencia secuencial en múltiples gotas de medio M2.
    8. Después de 2-3 rondas de lavados, transfiera los ovocitos a gotitas de medio de cultivo KSOM y manténgalos en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 para su uso posterior.
  7. Alrededor de las 10:00 a.m. del cuarto día, sonique 100 μL de los espermatozoides capacitados (ver paso 1.5.2.) durante 5 s para separar las cabezas de las colas a una frecuencia de 46 kHz, con un ajuste de potencia de 50 vatios.
    NOTA: Al sonicar esperma para truncar la cola, tenga cuidado de controlar el tiempo, que no debe exceder los 5 s. Unos segundos después de la sonicación, los espermatozoides pueden observarse bajo un microscopio invertido; Deja de sonicar cuando aproximadamente la mitad de los espermatozoides muestran colas truncadas.
  8. Procedimiento ICSI
    1. Para la inyección, utilice una aguja de micromanipulación disponible en el mercado con una punta plana y un diámetro interior de 6 μm, colocada en un ángulo de 25°. Llene la aguja con el líquido quirúrgico con la porción llena que mida una longitud de 0,5 cm dentro de la aguja. Asegúrese de que el nivel del líquido alcance ~0,5 cm.
      NOTA: Mantener la temperatura ambiente a 19 °C durante la inyección para evitar altas temperaturas que puedan reducir la tasa de supervivencia de los ovocitos fecundados. La precisión para garantizar que el nivel de líquido alcance los 0,5 cm es crucial para mantener la integridad del proceso de inyección y garantizar la viabilidad de los ovocitos.
    2. Instale la aguja de inyección en el brazo derecho del micromanipulador, fijada de forma segura apretando la tapa de sujeción. Instale una pipeta de sujeción de micromanipulación de punta plana disponible en el mercado diseñada para ovocitos de ratón en el brazo izquierdo del micromanipulador, y coloque la aguja de inyección y la pipeta de sujeción en el campo de visión del microscopio.
    3. Añadir 1 μL de esperma sonicado a una gota de solución de PVP con una pipeta.
    4. Colocar 20 ovocitos MII en una gotita de medio M2.
    5. Utilice la aguja de inyección para aspirar de 10 a 20 cabezas de esperma en una solución PVP. A continuación, introduzca la aguja de inyección en la gota que contiene los ovocitos.
    6. Determine directamente la posición del huso de la metafase dentro del ovocito bajo un microscopio de polarización para asegurarse de que el aparato del huso no esté en el lado de la inyección, con el cuerpo polar típicamente ubicado en la posición de las 12 en punto o las 6 en punto en relación con la orientación del ovocito.
    7. Mantenga el ovocito en contacto con el fondo de la placa de cultivo. Ajustar el plano focal para que la zona pelúcida del ovocito y la aguja de inyección estén en el mismo plano.
    8. Al entrar en contacto de la aguja de inyección con la zona pelúcida, aplique una ligera presión negativa a la aguja de inyección, extrayendo una parte de la zona pelúcida.
    9. Activa simultáneamente pulsos piezoeléctricos con un ajuste de intensidad de 5 y una frecuencia de 1, creando efectivamente una perforación en la zona pelúcida y permitiendo el paso de la aguja de inyección.
    10. Haga avanzar la aguja de inyección en el espacio perivitelino, empujando la cabeza del espermatozoide hacia la punta de la aguja. Inserte la aguja de inyección en el ovocito hasta que llegue al lado opuesto de la zona pelúcida.
    11. Utilice pulsos piezoeléctricos ajustados a una intensidad de 1 y una frecuencia de 1 para crear un pequeño poro en la membrana plasmática, asegurando que la cabeza del espermatozoide se inyecte en el ooplasma con una entrada mínima de PVP y una preservación óptima de la integridad del ovocito.
    12. Repetir el paso 1.8.11 hasta inyectar los 20 ovocitos, seguido de una incubación de 15 min a 19 °C.
    13. Transfiera los ovocitos supervivientes al medio KSOM y colóquelos en la incubadora. Observe las tasas de formación de 2 células, 4 células, mórulas y blastocistos.
      NOTA: Se debe controlar el momento de la inyección intracitoplasmática de un solo espermatozoide (ICSI) en el ovocito, con el objetivo de completar el procedimiento dentro de las 14-18 horas posteriores a la inyección de HCG.

2. Trasplante uterino de blastocistos de ratón

  1. Preparación de ratones machos vasectomizados
    NOTA: Utilice ratones machos ICR de 6 a 8 semanas de edad para el estudio.
    1. Inducir la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2,2-tribromoetanol al 1,25% a una dosis de 0,2 mL/10 g de peso corporal. La ausencia de cualquier respuesta al dolor indica un éxito de la anestesia.
      NOTA: Si bien el protocolo actual no incluye la aplicación de ungüento veterinario en los ojos de los animales anestesiados, se recomienda como una mejor práctica para prevenir la sequedad ocular y garantizar la salud y la comodidad de los animales durante los procedimientos. A lo largo del proceso quirúrgico y de recuperación, todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron antes de su uso, y el área quirúrgica se preparó con soluciones antisépticas para garantizar un entorno quirúrgico limpio.
    2. Para protegerse contra posibles tensiones o lesiones, aloje a los ratones que se han sometido a la cirugía individualmente durante la fase inicial de recuperación.
    3. Administrar buprenorfina a una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal para garantizar un alivio óptimo del dolor.
      NOTA: Para garantizar el bienestar de los ratones, vigile de cerca a los ratones durante el período de recuperación y no los deje desatendidos hasta que recuperen la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal.
    4. Preparar el sitio quirúrgico en la región abdominal inferior, superior a los testículos. Retirar el pelaje y desinfectar con povidona yodada. Con unas tijeras estériles, haga una incisión longitudinal de 1 cm a lo largo de la línea alba. Retire suavemente la sangre con papel estéril y libre de polvo y proceda a diseccionar sin rodeos los músculos abdominales a lo largo de la línea alba y acceder a la cavidad abdominal.
    5. Con pinzas curvas, agarre y exponga suavemente el testículo izquierdo y su almohadilla de grasa asociada. Identifique el conducto deferente y aíslelo cuidadosamente con pinzas puntiagudas, creando un segmento de 10 mm para su manipulación.
    6. Esterilice las pinzas curvas sosteniéndolas en la llama exterior de una lámpara de alcohol durante varios segundos. Agarre suavemente el conducto deferente, haciendo que se aplane y blanquee debido a la cauterización. Cree un segundo punto de cauterización de 3-5 mm distal al primero. Con unas tijeras quirúrgicas estériles, extirpe el segmento de los conductos deferentes entre los dos puntos de cauterización.
    7. Inspeccione cuidadosamente los extremos cauterizados de los conductos deferentes, asegurándose de que quede un segmento corto, aplanado y blanqueado. Con pinzas curvas, regrese suavemente el testículo y su almohadilla de grasa asociada a la cavidad abdominal.
    8. Repita el procedimiento descrito en el paso 2.1.6 en el lado contralateral (derecho).
    9. Cierre el sitio quirúrgico con suturas, generalmente colocando un punto en la capa muscular y tres puntos en la piel. Asegurar la correcta alineación de la incisión quirúrgica y desinfectar con povidona yodada. Transfiera al animal a una almohadilla térmica para su observación, monitoreando durante 10-15 minutos hasta que el animal recupere la conciencia. Una vez recuperado, devuelva el animal a su jaula de alojamiento.
      NOTA: Después de la cirugía de vasectomía, los ratones requieren un período de recuperación de 14 días, seguido de un experimento de apareamiento de prueba de 1 semana.
    10. Durante esta semana, aparear continuamente a los machos vasectomizados con las hembras y observar el estado de embarazo de todas las hembras que presenten tapones copulatorios. El apareamiento exitoso está indicado por la presencia de un tapón vaginal en bloque de color blanco amarillento en el orificio vaginal de la hembra de ratón.
      1. Empareje a los ratones entre las 4:00 p.m. y las 6:00 p.m. el primer día y revise los tapones vaginales entre las 7:00 a.m. y las 9:00 a.m. el segundo día. Considere que las hembras con tapones vaginales están en un estado de pseudoembarazo a los 0,5 días y utilícelos para experimentos posteriores de transferencia de embriones. Devuelva las hembras sin tapones vaginales al grupo receptor.
        NOTA: Estas hembras sin tapones vaginales pueden seguir siendo utilizadas para el apareamiento y preparar a las hembras pseudopreñadas. Asegurarse de que todas las hembras taponadas no queden embarazadas; Solo entonces se puede utilizar a los machos vasectomizados para experimentos formales.
      2. Si bien los machos vasectomizados pueden aparearse a diario, permita 1 día de descanso entre las sesiones de apareamiento.
        NOTA: Según nuestra experiencia, los hombres vasectomizados pueden mantener una alta tasa de tapón copulatorio durante más de un año. Sin embargo, los machos vasectomizados que no logran producir tapones copulatorios en las hembras en apareamiento durante 4-6 intentos consecutivos deben ser retirados del estudio.
  2. Preparación de hembras pseudopreñadas
    1. Genere ratones hembra pseudopreñados mediante el apareamiento de ratones hembra ICR (de 7 a 10 semanas, con un peso superior a 25 g) con ratones machos vasectomizados (de 3 a 6 meses de edad) en una proporción de 1:1.
      NOTA: Los machos vasectomizados se utilizaron para estimular el cuello uterino de los ratones hembra, lo que resultó en la activación de los cuerpos lúteos.
  3. Preparación de la pipeta para la transferencia de blastocistos
    1. Sacar los embriones a trasplantar de la incubadora y transferirlos a una gota de medio M2 a una temperatura de 37 °C.
    2. Utilice una pipeta de transferencia para aspirar un pequeño volumen de líquido, aspirar una pequeña cantidad de aire y aspirar de 6 a 10 embriones. Por último, aspire otro pequeño volumen de aire para sellar la pipeta.
      NOTA: La longitud del fluido en la pipeta de transferencia no debe exceder los 0,5 cm.
  4. Trasplante uterino (blastocistos)
    1. Pesar a los ratones hembra pseudopreñados (2,5 días después del apareamiento) y anestesiarlos mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2,2-tribromoetanol al 1,25% a una dosis de 0,2 mL/10 g de peso corporal. Presione suavemente la oreja con pinzas.
    2. Después de administrar la anestesia a los ratones y asegurar la asepsia a través de la desinfección con alcohol, realice una incisión longitudinal en la línea media del abdomen ventral. Aprovechando el tejido subcutáneo suelto, desplace la incisión hacia el lado izquierdo o derecho, según sea necesario para el trasplante. Utilice unas tijeras pequeñas para realizar una disección roma de la capa muscular de la pared abdominal a ~0,5 cm lateral de la columna lumbar para acceder a la cavidad peritoneal.
    3. Con pinzas atraumáticas, exteriorice cuidadosamente los ovarios, los oviductos y el útero.
    4. Con la punta de una aguja de jeringa, haga una pequeña incisión en ángulo ascendente en la pared uterina por debajo de la unión útero-tubárica, evitando los vasos sanguíneos. Esta incisión proporciona acceso a la cavidad uterina; Inserte suavemente el oviducto 2-3 mm a través del orificio pequeño.
    5. Expulse con cuidado la pequeña burbuja de aire al final de la pipeta de transferencia mientras observa atentamente la pipeta de transferencia durante la inyección lenta de los embriones. Una vez que se haya confirmado la expulsión de la parte central del medio de cultivo, detenga el procedimiento y retire suavemente la pipeta de transferencia.
    6. Reposicione los ovarios, los oviductos y el útero de nuevo en la cavidad abdominal. Sutura la capa muscular y la piel por separado. Coloque a los ratones en una almohadilla térmica hasta que se recuperen de la anestesia. Para garantizar el bienestar de los ratones, vigile de cerca a los ratones durante el período de recuperación y no los deje desatendidos hasta que recuperen la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
  5. Observación del embarazo
    1. Después de la cirugía, observe a los ratones durante 18-21 días para controlar el número de crías nacidas. En caso de distocia (parto difícil), realizar una cesárea. Permitir que los ratones recién nacidos sean acogidos por madres lactantes del mismo grupo de edad.

3. Prueba aleatoria de glucosa en sangre, glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa

  1. Seguimiento aleatorio de los niveles de glucosa en sangre durante el crecimiento del ratón
    1. Desde el nacimiento de los ratones, controle el nivel aleatorio de glucosa en sangre cada 4 semanas a las 9 am después de una buena noche de alimentación y diversión.
      1. Perfora la punta de la cola del ratón para obtener sangre de las venas de la cola.
      2. La primera gota de sangre tiene un valor de medición de azúcar más alto debido a la presencia del líquido tisular mezclado con ella. Por lo tanto, limpie suavemente la primera gota de sangre con papel absorbente limpio.
      3. Mida la glucosa en sangre de la segunda gota (~4 μL) de la vena de cola con un glucómetro de mano.
  2. Seguimiento de los cambios en la glucosa en sangre en ayunas y la tolerancia a la glucosa durante el desarrollo de los ratones
    NOTA: Teniendo en cuenta que el primer punto de tiempo de muestreo de sangre es de 15 minutos, todos los ratones deben inyectarse dentro de los 15 minutos. Dado que cada inyección de ratón tardó entre 20 y 30 segundos, para garantizar que las inyecciones se completen dentro de este período de tiempo, el número máximo de ratones que se pueden utilizar en cada prueba no puede superar los 30.
    1. Realice las pruebas de glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa cada 4 semanas después del nacimiento en ratones que ayunan durante la noche.
      1. El primer día, prepare ropa de cama de virutas frescas irradiadas, jaulas limpias, tapas y botellas de agua. Transfiera los ratones a una jaula nueva sin comida. Agregue etiquetas de no alimentación a las jaulas.
      2. Prepare suficiente inyección de glucosa al 10% (estéril y sin pirógenos) y jeringas de 1 mL.
      3. Asegúrese de que los ratones de cada grupo ayunen durante 16 h, desde las 17:00 horas del día 1 hasta las 9:00 horas del día 2, pero permita el libre acceso al agua. Mida los niveles de glucosa en sangre en ayunas como se describe en los pasos 3.1.1.1-3.1.1.3 usando un medidor de glucosa.
    2. Pesa a los ratones y marca sus colas para facilitar una rápida identificación. Prepare jeringas de glucosa con 10 μL/g de peso de ratón.
    3. A intervalos de 30 s, inyectar 10 μL/g de glucosa en la cavidad intraperitoneal del ratón.
      NOTA: Se debe prestar especial atención a las técnicas de inyección aquí para evitar un volumen de inyección de líquido inexacto. Los puntos clave de operación son los siguientes:
      1. Inmoviliza al ratón y sujeta la cola con una mano. Mantenga la cabeza ligeramente más baja que los glúteos para que los órganos de la cavidad abdominal se desplacen hacia la cabeza, dejando suficiente espacio para la inyección.
      2. Coloque la aguja entre la línea media y el hueso de la cadera, insértela a través de la piel en un ángulo de 45 grados, luego guíe suavemente la aguja más profundamente en la cavidad abdominal mientras la mantiene alineada paralela a la superficie de la piel durante ~ 0,5 cm.
        NOTA: Preste atención a cualquier resistencia durante la inyección para determinar si los órganos internos se perforan accidentalmente.
      3. Expulse la jeringa en la cavidad abdominal.
      4. Registre la hora en que comenzó la inyección y use un temporizador para controlar la velocidad de inyección. Configure el temporizador a 90 segundos para tres ratones para evitar perder tiempo en el manejo del temporizador.
    4. Tome la medición de glucosa en sangre de la vena de cola a los intervalos deseados (0 antes de la administración de glucosa, 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la carga de glucosa).
      NOTA: Las pruebas posteriores de glucosa en sangre también deben tomar 20-30 s para cada ratón.
    5. Regrese a los ratones a sus jaulas domésticas equipadas con comida y agua después del experimento.

Resultados

En nuestro laboratorio, hemos conseguido una tasa de fecundación del 89,57% y una tasa de 2 células del 87,38% utilizando ICSI con espermatozoides caudales del epidídimo en ratones. La tasa de natalidad de las crías después de la ET es de aproximadamente el 42,50%. Sorprendentemente, todas las tasas de fertilización, las tasas de 2 células y las tasas de nacimiento de descendientes son comparables a los niveles alcanzados en la TAR humana, lo que permite una simulación completa de las diferentes etapas de las técnicas de TAR humanas en ratones. En los cuadros 1 y 2 se ofrecen más detalles. No hubo fluctuaciones significativas en los niveles aleatorios de glucosa en sangre entre los ratones nacidos de forma natural y los ratones ICSI durante el proceso de crecimiento y desarrollo (Figura 2). Sin embargo, los ratones machos ICSI mostraron niveles continuamente altos de glucosa en sangre en ayunas durante todo el experimento (Figura 3), lo que indica una alteración de la homeostasis de la glucosa en sangre en ayunas. Curiosamente, los ratones hembra ICSI no mostraron cambios en comparación con el grupo de control. En el GTT, el nivel de glucosa en sangre mostró un cambio significativo entre los ratones machos ICSI y el grupo control (Figura 4), y no hubo tal diferencia en los ratones hembra. Estos resultados sugirieron que la descendencia obtenida mediante la tecnología ICSI podría padecer diabetes, y el resultado estaba relacionado con el sexo. Aunque los ratones hembra no mostraron el fenotipo de diabetes, el fenotipo de sobrepeso de los ratones ICSI machos y hembras fue consistente (Figura 5).

Utilizando el protocolo de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) descrito aquí, logramos altas tasas de fertilización y desarrollo embrionario en ratones. En un experimento representativo, el 89,57% de los ovocitos fueron fecundados después de la ICSI, como lo demuestra la formación de dos pronúcleos. A las 24 h después de la ICSI, el 87,38% de los cigotos evolucionaron hasta el estadio embrionario de 2 células. Después de la transferencia embrionaria a las hembras receptoras, la tasa de natalidad de las crías vivas fue del 42,50% (resultados positivos). Utilizando el protocolo optimizado de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) descrito aquí, generamos descendencia de manera eficiente a partir de ovocitos y espermatozoides de ratón. Es importante destacar que una caracterización exhaustiva de los animales derivados de ICSI reveló perturbaciones metabólicas en ausencia de defectos graves del desarrollo.

En comparación con los controles criados de forma natural, los ratones machos, pero no hembras, mostraron una homeostasis de la glucosa alterada, evidenciada por un aumento de la glucosa en sangre en ayunas (Figura 3) y una tolerancia reducida a la glucosa en las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (Figura 4). Estas alteraciones pueden deberse a deficiencias de reprogramación durante la fertilización mediada por ICSI o a sutiles anomalías genéticas/epigenéticas incurridas durante la manipulación de espermatozoides.

Además, tanto los ratones machos como las hembras mostraron un aumento de peso corporal en comparación con los controles (Figura 5), lo que sugiere una propensión a la obesidad. Si bien la técnica ICSI en ratones modela de manera confiable los resultados humanos de ICSI, los fenotipos metabólicos observados subrayan la necesidad de interpretar con cautela los resultados de los modelos animales de ICSI. La evaluación exhaustiva del crecimiento, la salud y el comportamiento es imprescindible para determinar la idoneidad de los ratones ICSI para aplicaciones posteriores.

En conjunto, estos datos ilustran la utilidad del protocolo ICSI de ratón para generar descendencia de manera eficiente para los estudios, al tiempo que destacan la importancia de evaluar exhaustivamente los resultados fenotípicos en animales derivados de ICSI. Las anomalías metabólicas específicas del sexo observadas en este ejemplo subrayan la necesidad de una interpretación cuidadosa de los resultados de los modelos de ratón ICSI.

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Figura 1: Diagrama de la preparación de la placa para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides en ratones. La tapa de la placa de cultivo celular se dividió en mitades superior e inferior. La mitad superior contenía gotas de solución de polivinilpirrolidona al 10% para la colocación de espermatozoides. La mitad inferior contenía gotas de medio M2 para llevar a cabo el procedimiento ICSI. Todas las gotas se cubrieron con aceite mineral para evitar la evaporación. Esta configuración de la placa permitió la transferencia secuencial de espermatozoides y ovocitos entre PVP y gotas M2 para permitir el proceso ICSI. Las áreas separadas evitaron la mezcla de medios durante el procedimiento. Abreviaturas: ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides; PVP = polivinilpirrolidona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Niveles aleatorios semanales de glucosa en sangre en ratones control (n = 5) e ICSI (n = 5) criados naturalmente durante el desarrollo postnatal. Los niveles de glucosa en sangre se midieron semanalmente después del ayuno nocturno desde la vena de cola de los ratones control e ICSI utilizando un glucómetro. Los datos se presentan como media ± SEM. La significación estadística se evaluó mediante un ANOVA de dos vías, ns, P > 0,05. Abreviaturas: SEM = Error estándar de la media; ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides; ns = no significativo; NM = apareamiento natural. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Niveles semanales de glucosa en sangre en ayunas en ratones de control criados naturalmente (n = 7 para machos, n = 7 para hembras) y tratados con ICSI (n = 7 para machos, n = 7 para hembras) durante el desarrollo postnatal. Después del ayuno nocturno, los niveles de glucosa en sangre se midieron semanalmente desde la vena de la cola de los ratones de control en ayunas y tratados con ICSI utilizando un glucómetro. Se observó que los ratones machos tratados con ICSI, pero no las hembras, exhibieron niveles significativamente elevados de glucosa en sangre en ayunas en comparación con sus controles emparejados por sexo a partir de las 8 semanas de edad. Los datos se presentan como media ± SEM. La significación estadística se evaluó mediante un ANOVA de dos factores, ns, P > 0,05, ***P < 0,001,****P < 0,0001). Abreviaturas: SEM = Error estándar de la media; ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides; ns = no significativo; NM = apareamiento natural. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en ratones control criados naturalmente (n = 5) y ratones machos tratados con ICSI (n = 5) a las 16 semanas de edad. Después de un ayuno nocturno, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de glucosa (2 g/kg de peso corporal). A continuación, se midieron los niveles de glucosa en sangre a los 0, 30, 60 y 120 minutos después de la inyección. Los ratones machos tratados con ICSI mostraron niveles de glucosa en sangre significativamente más altos a los 30, 60 y 120 minutos durante la IPGTT en comparación con el control criado de forma natural. Los datos se presentan como media ± SEM y los análisis se realizaron mediante ANOVA de dos vías. ns, P > 0,05. *P < 0,05. Abreviaturas: IPGTT = Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal; SEM = error estándar de la media; ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides; ns = no significativo; NM = apareamiento natural. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Seguimiento del peso corporal de ratones de control criados naturalmente (n = 5 machos, n = 5 hembras) y tratados con ICSI (n = 5 machos, n = 5 hembras) de 4 a 20 semanas de edad. Las mediciones semanales revelaron que tanto los ratones machos como las hembras tratados con ICSI exhibieron un aumento significativo del peso corporal en comparación con sus controles emparejados con el género, a partir de las 8 semanas de edad. Los datos se presentan como media ± SEM y los análisis se realizaron mediante ANOVA de dos vías. P < 0,001. P < 0,0001. Abreviaturas: SEM = Error estándar de la media; ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides; ns = no significativo; NM = apareamiento natural. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

OvocitosCigotosTasa de fertilización (%)2 celdasTasa de 2 celdas (%)4-8 celdasTasa de 4-8 celdas (%)MórulaTasa de mórulaBlastocistosTasa de blastocistos
Esperma de cauda ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
Cauda esperma ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
Cauda espermática ICSI3605083.334284377432642856
Total23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

Tabla 1: Resultados del desarrollo después de la ICSI en ratones. Abreviatura: ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides.

No.No. de embriones transferidosNo. de nacimiento (%)MasculinoHembraTasa de natalidad (%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
Total401710742.5

Tabla 2: Resultados del parto tras el trasplante uterino de embriones de ratón ICSI. Abreviatura: ICSI = inyección intracitoplasmática de espermatozoides.

Discusión

Este estudio integró técnicas de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y transferencia de embriones (ET) para recapitular de manera integral la tecnología de reproducción asistida humana (ART) y examinar el impacto de la ICSI junto con la ET en el desarrollo de la descendencia. La aplicación de la técnica ICSI con esperma normal de ratón produjo altas tasas de fecundación (86,76%) y 2 células (88,48%). Después de ET, la tasa de natalidad de ratones descendientes fue de aproximadamente 42,50%, lo que indica la solidez de la plataforma técnica. El hallazgo más notable de este estudio fue la fluctuación relacionada con la edad en los niveles de metabolismo de la glucosa en la descendencia de la ICSI, que puede atribuirse a la aplicación de la técnica de la ICSI6.

Las fluctuaciones observadas en los niveles del metabolismo de la glucosa constituyen un hallazgo notable en este estudio. Este hallazgo implica potenciales implicaciones a largo plazo de la técnica ICSI en la salud de la descendencia, específicamente en lo que respecta al metabolismo de la glucosa7. Para dilucidar las razones detrás de este fenómeno, llevamos a cabo un examen exhaustivo de los pasos técnicos fundamentales incluidos en el procedimiento ICSI. Encontramos que el control de la temperatura de microinyección (19 °C), la duración del corte por ultrasonido (dentro de los 5 s) y el volumen del líquido de transferencia (<0,5 cm) fueron importantes para mantener la viabilidad del embrión y las tasas de implantación elevadas. El control del efecto de succión de la pipeta de transferencia surgió como un paso crítico para una transferencia precisa de embriones. Al preparar la pipeta de transferencia, garantizar la uniformidad en el diámetro del tubo es clave para mitigar el efecto de sifón y controlar mejor el movimiento del líquido dentro del tubo. Esta medida es fundamental para mejorar la tasa de éxito y la precisión de la transferencia de embriones. Además, evitar el cultivo in vitro prolongado y el hacinamiento durante la transferencia embrionaria también ayudó a mejorar la competencia en el desarrollo. Empleando protocolos optimizados, alcanzamos una tasa de fertilización del 86,76% y una tasa de natalidad del 42,50% después de la ET, lo que sugiere que el procedimiento de ICSI en sí mismo no perjudicó inherentemente la viabilidad. Por lo tanto, las fluctuaciones en el metabolismo de la glucosa se asociaron más plausiblemente con cambios intracelulares sutiles inducidos por el proceso de TAR en lugar de con daño embrionario manifiesto.

Si bien la TRA es ampliamente considerada como segura, cada vez hay más evidencia que indica que incluso la descendencia aparentemente normal de la TRA puede presentar diversos riesgos para la salud más adelante en la vida debido a las características reproductivas antinaturales y los períodos críticos de intervención durante el desarrollo de gametos y embriones 5,8,9,10,11,12,13 . Nuestros hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre los posibles efectos metabólicos de la TRA y ponen de manifiesto la necesidad de realizar más estudios sobre los impactos a largo plazo de la TRA en la salud de la descendencia14.

Es esencial reconocer que en este estudio se empleó un modelo murino; En consecuencia, los resultados pueden no ser directamente transferibles a los sujetos humanos. Sin embargo, dados los importantes paralelismos biológicos entre ratones y humanos, estos hallazgos conservan una considerable significación referencial15. Además, es importante reconocer que los pacientes que se someten a ICSI en la práctica clínica a menudo tienen anomalías en los espermatozoides. Por el contrario, este estudio utilizó ratones normales para los procedimientos de ICSI, por lo que careció de datos sobre la descendencia de ICSI de ratones con anomalías en los espermatozoides. Sin embargo, es razonable anticipar que las anomalías de los espermatozoides tendrían un impacto más profundo en los efectos a largo plazo de la técnica ICSI. De ahí que los resultados de este estudio mantengan un notable mérito referencial.

Otra limitación de nuestro estudio es la discrepancia metodológica entre nuestro modelo de ratón y las prácticas clínicas humanas en la inmovilización de espermatozoides. En la aplicación clínica de la ICSI, es una práctica común inmovilizar el esperma humano mediante la interrupción física de la cola con una micropipeta. Sin embargo, en nuestros experimentos con modelos de ratón, empleamos el corte ultrasónico de la cola para preparar el esperma, un método utilizado habitualmente en la manipulación embrionaria de ratones. Reconocemos que este enfoque puede introducir inadvertidamente variabilidad y sesgos potenciales en el modelo, especialmente teniendo en cuenta el posible daño a la integridad y función de los espermatozoides que puede causar la ecografía. Esta diferencia metodológica puede limitar la traducibilidad directa de nuestros hallazgos. En nuestro trabajo futuro, planeamos explorar el uso de micropipetas para alterar las colas de los espermatozoides de ratón. Este ajuste tiene como objetivo minimizar cualquier efecto no deseado en los espermatozoides y replicar mejor las condiciones y resultados observados en los procedimientos de ICSI humanos. Estamos comprometidos a mejorar continuamente nuestras prácticas de investigación para aumentar la relevancia clínica de nuestros hallazgos.

A partir de la plataforma tecnológica mencionada, en futuras investigaciones profundizaremos en el impacto de la técnica ICSI en otros aspectos de la salud de la descendencia, como la salud cardiovascular y el sistema inmune. Además, los estudios de seguimiento a más largo plazo también son imprescindibles para comprender de manera integral los efectos a largo plazo de la ICSI.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo del Plan de Proyecto Principal del Fondo Especial de Desarrollo para la Zona Nacional de Demostración de Innovación Independiente de Shanghái Zhangjiang (ZJ2022-ZD-006), el Proyecto de Financiación Específica de la Comisión Municipal de Ciencia y Tecnología de Shanghái (22DX1900400), el Programa Juvenil de la Comisión Municipal de Salud de Shanghái (20204Y0276). la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070849).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,25% avertin (2,2,2-tribromoetanol)Nanjing AibeiM2960para anestesia
Placas de Petri bacteriológicas Estilo de 35 x 10 mm con tapa hermética, poliestireno virgen de grado cristalino,estéril BD353001
Placas de Petri bacteriológicas Estilo de 50 x 9 mm con tapa hermética, poliestireno virgen de grado cristalino, estérilBD351006
Gabinete de bioseguridadESCOclass figure-materials-1 BSCOperaciones asépticas, fabricación de placas de cultivo, reactivos alícuotas, etc.
Incubadora de CO2Thermo8000DHCultivo de embriones
Microscopio de disecciónOlympusSZX16Uso en la transferencia de embriones de ratón
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 es un líquido totalmente fluorado térmicamente estable con alta rigidez dieléctrica y resistividad, utilizado como fluido de funcionamiento
glucómetro de manoRocheAccuChek performaBlood medición de glucosa
HTFMerckMR-070-DEl EmbryoMax Human Tubal Fluid (HTF) (1x), líquido diseñado para su uso con FIV en ratones, está disponible en un formato de 50 mL y ha sido optimizado y validado para el cultivo de embriones.
Microinyector hidráulicoEppendorfCellTram 4r Aceite, 5196000030para inyección de esperma
Microscopio invertidoNikonTI2-U Anfitrión deobservación de micromanipulación
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Polvo, sin Rojo Fenol, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medio (1x), Líquido, con Micromanipulador de Rojo Fenol
NARISHIGENTX-N4Aceite mineral del brazo
de micromanipulación SIGMAM8410es adecuado para su uso como capa de cobertura para controlar la evaporación y la contaminación cruzada en diversas aplicaciones de biología molecular.
Cortador de agujasNanjing AibeiSutter MF-800Uso para la fabricación de agujas de micromanipulación
Tirador de agujasNanjing AibeiSutter modelo p-100Uso para la fabricación de agujas de micromanipulación
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Aplicación de aguja de inyección ICSI.
Micromanipulador piezoeléctrico (rompedor de membranas)EppendorfEppendorf PiezoXpertUso de micropulsos para romper la zona pelúcida y el oolema del ovocito
Microinyector neumáticoEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Para la fijación del ovocito
Gonadotropina coriónica humana (Hcg) lista parausarNanjing AibeiM2520Reactivo de esterilización, inyección intraperitoneal. 50 UI/mL
Gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG)Nanjing AibeiM2620Reactivo de esterilización, inyección intraperitoneal. 50 UI/mL
Microscopio estereoscópicoOlympusSZX7Extracción de ovocitos y observación del desarrollo embrionario
El aceite mineral

Referencias

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  3. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
  4. Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
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