Un conjunto de formatos de medios simulados informados in situ para el cultivo de microorganismos anaeróbicos adquiridos en el medio ambiente

La mayoría de los microorganismos permanecen sin cultivar; Esto se ve respaldado por la gran disparidad entre las células observadas a través de la microscopía contrastada con los pocos microorganismos cultivados con éxito utilizando placas de agar. Staley y Konopka llamaron a esta disparidad la "Gran Anomalía del Conteo de Placas"¹. La diversidad estimada no contabilizada está respaldada por datos metagenómicos y metatranscriptómicos que muestran muchos géneros nuevos distribuidos en curvas de abundancia de rangos de varios ambientes diferentes². Los microorganismos que se han observado (generalmente mediante secuenciación aleatoria de una comunidad microbiana) pero que no han sido cultivados se han denominado "materia oscura microbiana"^3,4.

En la era de las -ómicas, el cultivo de microorganismos sigue siendo imperativo para evaluar completamente los datos genómicos y verificar la función/fenotipo de los genes presentes. La secuenciación de microorganismos cultivados sigue siendo la única forma de obtener genomas completos con confianza hasta que tecnologías como la metagenómica de escopeta y los genomas ensamblados con metagenomas del medio ambiente se vuelvan admisiblemente^infalibles. Las evaluaciones genómicas junto con los microorganismos cultivados proporcionan fuertes inferencias para comprender la "materia oscura microbiana". Muchos miembros de la "materia oscura microbiana" realizan funciones cruciales que afectan el ciclo de nutrientes y otros elementos y la producción de productos naturales valiosos, apoyan los sistemas ecológicos y realizan servicios ecológicos. Desde el punto de vista médico, alrededor de la mitad de todos los productos farmacéuticos comercializados actualmente son productos y derivados de productos de bacterias, y se sospecha que el perfil de especies no cultivadas revelará los antibióticos del futuro. Para acceder a esta mayoría inculta, se debe aumentar una variedad de metodologías de cultivo⁶. Entre los miembros de la "materia oscura microbiana", los microorganismos oligotróficos anaeróbicos están en gran medida subestimados y probablemente contienen vías bioquímicas ecológica e industrialmente^valiosas, lo que los convierte en objetivos importantes de cultivo. Sin embargo, los microorganismos oligotróficos anaeróbicos son más difíciles de cultivar que sus homólogos aeróbicos y copiotróficos debido a los tiempos de incubación más largos que a menudo se requieren, las condiciones exigentes (por ejemplo, temperaturas in vitro particulares no estándar) y el uso de recetas de medios especializados.

Las técnicas actuales en desarrollo para cultivar miembros de la "materia oscura microbiana", incluidos nuevos microorganismos oligotróficos anaeróbicos, han mejorado en gran medida nuestra comprensión y han aumentado la representación de estos microorganismos dentro del árbol filogenético. Las técnicas actuales que utilizan medios informados para el cultivo de microorganismos novedosos (es decir, medios que se derivan utilizando el conocimiento de los microorganismos de interés) pueden dividirse en tres métodos distintos. El primero de los métodos consiste en la eliminación directa de una sección discreta del medio ambiente para transferirla a una cámara de crecimiento in vitro que ya contiene los microorganismos de interés dentro de una membrana. La sección discreta (por ejemplo, el agua de mar) actúa para proporcionar a los microorganismos de interés el hábitat geoquímico que utilizan in situ, mientras que la membrana detiene el movimiento de las células a través de él (las células de interés permanecerán dentro; las células extrañas que llegaron con la sección discreta permanecerán fuera). Al incluir compuestos naturalmente disponibles para atacar microorganismos en su hábitat natural, dichos microorganismos pueden cultivarse⁸. El segundo método utiliza la metatranscriptómica o genómica para dilucidar las capacidades metabólicas, proporcionando pistas sobre parámetros de cultivo estrechos para un diseño de medio dirigido. Este enfoque proporciona un perfil ecofisiológico que se puede utilizar para orientar el enriquecimiento de tipos específicos de microorganismos fuera de un medio ambiente. Las provisiones del medio se atienden a los genes identificados presentes que se presume que apoyan a los microorganismos objetivo para reducir la diversidad de enriquecimiento,9,10. Una advertencia es que la información genómica no infiere directamente la expresión de los genes, mientras que la información transcriptómica sí lo hace.

El tercer método engloba los medios de comunicación informados sobre el medio ambiente y los medios de comunicación, a diferencia del primer método, que no simula los medios de comunicación, sino que utiliza el medio ambiente directamente como fuente de medios. Este tercer método requiere el reconocimiento ambiental de la geoquímica de un sitio de campo que contiene microorganismos de interés. Con este conocimiento, se identifican los componentes primarios y los parámetros físicos para producir un medio simulado ambientalmente informado. Luego, el medio recibe una infusión directa de sedimento o líquido que contiene microorganismos del medio ambiente en el medio. Este método es de particular valor en los casos en que el microbiólogo de cultivo no tiene acceso a cantidades suficientes de ambiente de origen (como se necesita para el primer método) ni a datos metatranscriptómicos o genómicos apropiados (como se necesita para el segundo).

El siguiente protocolo es un ejemplo del tercer método; Se basa en entornos de interés y tiene como objetivo simularlos. En el protocolo se presentan en paralelo tres recetas ingenuas dirigidas a diferentes cultivos anaeróbicos de microorganismos adquiridos en el campo. Los tres cultivos representados son los cultivos mixtos que se originan en el suelo (en adelante, el cultivo mixto del suelo), los cultivos mixtos que se originan en el interior de un pozo (en adelante, el cultivo mixto del pozo) y un metanógeno aislado que se origina en el interior de un pozo (en adelante, metanógeno aislado del pozo). Las identidades compuestas y las cantidades en las recetas de los medios de comunicación compartidas aquí pretenden ser una guía inicial; Son capaces y se les anima a personalizarse según el entorno del lector y los microorganismos de interés.

1. Producción de medio líquido anaeróbico personalizable

1. Medio para frascos de cultivo (producción de 500 mL)
   1. Mida y agregue compuestos a una botella de 1 L y ajuste el pH utilizando la columna de la Tabla 1 correspondiente al cultivo de interés del lector (las cantidades en la Tabla 1 se registran para una producción de 1,000 mL, ajuste en consecuencia). Mezcle los compuestos hasta homogeneizarlos agitando la botella.
   2. Calienta el líquido hasta que hierva calentando la botella en el microondas durante 5-6 min. Abra el microondas con frecuencia y agite el líquido suavemente con un guante resistente al calor. Abra el microondas rápidamente si el líquido se queda quieto después de burbujear; De lo contrario, el líquido puede expandirse rápidamente y desbordar la botella.
   3. Conecte una pipeta de vidrio estéril de 10 ml a una configuración de colector de gas N₂ (basado en el diseño de Balch et ^al.11, aunque no requiere una columna de cobre calentada para gas N₂ de pureza; consulte el Archivo suplementario 1 para obtener más información sobre el colector de gas). Abra el colector para ventilar O₂ y permita que salga el gas N₂ .
   4. Coloque la punta de la pipeta en el líquido y ajuste el flujo de gas para que las burbujas sean moderadamente vigorosas. Enjuague el líquido con N₂ hasta que la botella ya no esté demasiado caliente para tocarla.
      NOTA: Esto depende del contenido de los medios, pero generalmente toma ~ 20 min.
   5. Mientras espera a que el frasco se enfríe, coloque 10 frascos de cultivo estériles de 100 ml; o si se preparan medios para la recolección de cultivos mixtos en suelo, coloque dos frascos estériles de 500 ml.
   6. Una vez que el frasco de medios esté frío al tacto, tire de la punta de la pipeta hacia arriba en el espacio de cabeza del frasco. Añadir 0,125 g de NaHCO₃ y 0,300 g de Na₂S∙9 H₂O y esperar hasta que la resazurina se vuelva incolora.
      PRECAUCIÓN: Na₂S∙9 H₂O es corrosivo, tóxico e irritante. Use equipo de protección personal cuando manipule y enjuague bien las herramientas metálicas después del contacto.
   7. Mientras espera que la resazurina cambie de color, coloque cánulas metálicas en la configuración del colector de gas y coloque las puntas de las cánulas en botellas de cultivo. Ajuste el flujo de N₂ en las botellas a una velocidad moderada, de modo que el líquido agregado en el paso siguiente no salpique debido al flujo de gas.
   8. Una vez que la resazurina sea incolora, alícuota 50 mL de líquido en cada frasco de cultivo o 250 mL de líquido en cada frasco de 500 mL.
   9. Tape cada botella con un tapón de goma del mismo tamaño inmediatamente después de quitar las cánulas. Asegure el tapón con un sello de aluminio (para botellas de cultivo) o una tapa de rosca abierta GL45 (para botellas de 500 ml).
   10. Coloque las botellas en un recipiente esterilizable en autoclave y llénelo con agua del grifo hasta que los niveles de agua coincidan con los de las botellas.
       NOTA: Esto asegurará que las botellas no se rompan debido a la tensión causada por los diferenciales de temperatura en el vidrio durante el autoclave.
   11. Autoclave las botellas a 121 °C durante 30 min.
2. Medio para biorreactor (producción de 8 L)
   1. Preparación de garrafa
      1. Abra la válvula de una válvula de bola de lengüeta de manguera de 1/4" (6,4 mm). Conecte dos tubos de silicona de 6 cm de longitud de 1/4" (6,4 mm) de diámetro interior (ID) y 1/2" (12,7 mm) de diámetro exterior (OD) en cada extremo de la válvula de bola de lengüeta de la manguera.
      2. Conecte a un extremo del conjunto un accesorio adaptador de lengüeta de manguera de 5/16"-1/4" (7,9 mm-6,4 mm). Conecte el otro extremo del conjunto a la lengüeta de la manguera de una garrafa de 8 L.
      3. Use una brida para asegurar la conexión entre la lengüeta de la manguera de la garrafa y el tubo, y la conexión entre el accesorio adaptador de la lengüeta de la manguera y el tubo.
      4. Autoclave de la garrafa con montaje a 121 °C durante 30 min.
   2. Producción media
      1. Cierre la válvula de la bola de la lengüeta de la manguera en el conjunto de garrafón de 8 L.
      2. Mida y agregue compuestos a la garrafa de 8 L y ajuste el pH utilizando la columna de la Tabla 1 correspondiente al cultivo de interés del lector (las cantidades en la Tabla 1 se registran para una producción de 1.000 mL, ajuste en consecuencia). Agregue una barra para revolver y use una placa caliente para mezclar los compuestos hasta obtener la homogeneidad.
      3. Caliente el líquido hasta que hierva con la placa caliente para revolver. Deja que el líquido hierva durante 30 min.
         NOTA: Calentar el líquido hasta que hierva depende del contenido del medio, pero puede llevar de 2 a 3 h.
      4. Conecte una pipeta de vidrio estéril de 10 ml a una configuración de colector de gas N₂ (basado en el diseño de Balch et ^al.11, aunque no requiere una columna de cobre calentada para gas N₂ de pureza; consulte el Archivo suplementario 1 para obtener más información sobre el colector de gas). Abra el colector para ventilar O₂ y permita que salga el gas N₂ .
      5. Apague el fuego, luego coloque la punta de la pipeta en el líquido y ajuste el flujo de gas para que las burbujas sean moderadamente vigorosas pero no se desborden. Enjuague el líquido con N₂ durante 30 min.
      6. Tire de la punta de la pipeta hacia arriba en el espacio de cabeza de la garrafa. Agregue 2,0 g de NaHCO₃ y 4,8 g de Na₂S∙9 H₂O, y espere hasta que la resazurina se vuelva incolora.
         PRECAUCIÓN: Na₂S∙9 H₂O es corrosivo, tóxico e irritante. Use equipo de protección personal cuando manipule y enjuague bien las herramientas metálicas después del contacto.
      7. Una vez que la resazurina esté incolora, retire la pipeta de vidrio e inmediatamente tape la garrafa con un tapón # 10. Enrolle un cable sobre el tapón y alrededor del borde de la garrafa para asegurar el tapón.

2. Adquisición in situ de microorganismos anaerobios ambientales

1. Adquisición de muestras anaeróbicas de superficie (cultivo mixto de suelo)
   1. Lleve la/s botella/s de medios de cultivo de suelo mixto hechos como los anteriores y un descoronador al campo.
      NOTA: Los autores utilizan una broca de suelo cónico estándar de 2 5/8" de Giddings (Tabla de materiales). Sin embargo, se puede utilizar cualquier descorazonador de suelo o paleta que pueda muestrear a la profundidad deseada.
   2. Empuje (hincado de pilotes/estacas) el descoronador en el sedimento hasta que la parte superior del cilindro de recolección de muestras esté al ras con la superficie del sedimento.
   3. Gire el descoronador 90° para liberar el núcleo y tire hacia arriba hasta que la muestra se extraiga del medio ambiente.
   4. En sedimentos sueltos (como los que se pueden encontrar al tomar muestras de humedales), cubra la base del núcleo con una nueva mano enguantada de nitrilo a medida que se extrae para evitar que la muestra se caiga o se disemine al agua durante la extracción.
   5. Se aproxima rápidamente a ojo a 6-7 cm de la base del núcleo. Use una mano nueva enguantada de nitrilo para cortar el núcleo y separar la parte inferior 6-7 cm.
   6. Transfiera inmediatamente la parte inferior del núcleo a la botella de cultivo. Si el suelo/sedimento es demasiado grande, forme rápidamente para que quepa más fácilmente en la botella, minimizando la exposición a la atmósfera aeróbica tanto como sea posible.
   7. Una vez transferida la muestra, vuelva a colocar inmediatamente el tapón y manténgalo en su lugar con un tapón de rosca.
   8. Mantenga la muestra fría. Refrigere el frasco de recolección a 4 °C al regresar al laboratorio.
2. Adquisición de muestras anaeróbicas subsuperficiales (cultivo mixto de pozos)
   1. Coloque una botella estéril de 1 litro junto al colector de gas. Tapa la botella con un tapón de goma. Gotee etanol 100% sobre el tapón y préndale fuego con un encendedor.
   2. Coloque una aguja estéril de 23 G en la configuración del colector de gas N₂ . Abra el colector para ventilar O₂ y permita que el gas N₂ (o Ar) fluya a una velocidad moderada.
   3. Una vez que el tapón ya no esté en llamas, inserte la aguja en la botella. Inserte en la botella una segunda aguja estéril de 23 G que no esté unida al colector de gas. Enjuaga el biberón durante 1-2 minutos.
   4. Extraiga la aguja que no esté unida al colector de gas. Presurizar el frasco durante 1 min. Extrae la aguja restante.
   5. Lleve el frasco presurizado y una aguja esterilizada de 23 G al sitio del pozo. Extraer líquido del pozo siguiendo los métodos de Merino et ^al.12.
      NOTA: Dependiendo del método, la conexión y el caudal del pozo, esto cambia la estrategia de adquisición de una muestra de agua. Si hay un flujo continuo de agua, recoja el agua como se describe en el paso 2.2.6. será suficiente. Si el flujo de agua se recolecta por lotes o es de bajo flujo, se puede utilizar un método alternativo de entrada/salida. En todas las situaciones, minimice la contaminación e intente asegurarse de que la muestra recolectada sea representativa del entorno deseado para muestrear. Esta es una afirmación ampliamente generalizada porque ha sido la experiencia de los autores que cada evento de recolección de muestras de sitios gubernamentales o privados tenía que ser altamente adaptable a la accesibilidad disponible.
   6. Abra rápidamente la botella, bombee líquido para llenarla por completo y cierre la botella.
   7. Inserte la aguja de 23 G que se llevó al sitio en el tapón de goma de la botella para aliviar la presión en la botella. Extrae la aguja.
   8. Mantenga la muestra fría. Refrigere el frasco de recolección a 4 °C al regresar al laboratorio.

3. Crecimiento in vitro de microorganismos anaerobios adquiridos en campo

1. Crecimiento por botella de cultivo
   1. Coloque un frasco estéril de N₂ con tapón y los frascos de cultivo y el frasco de recolección preparados como se indica anteriormente. Gotee etanol 100% sobre los tapones y préndales fuego con un encendedor.
   2. Monta una aguja de 23 G en una jeringa de 1 ml. Una vez que los tapones ya no estén encendidos, inserte la aguja en el frasco de N₂ y extraiga ~ 1 ml de N₂. Extrae la aguja.
   3. Presione lentamente el émbolo para liberar el N₂. Tan pronto como la jeringa esté vacía, inserte la aguja en el frasco de recolección y extraiga 0,5 ml de la muestra ambiental. Extrae la aguja.
   4. Inserte la aguja en el frasco de cultivo e inyecte la muestra. Extrae la aguja.
   5. Agite el biberón y colóquelo en una incubadora a temperatura, según lo informado por la Tabla 1 o el entorno de interés del lector.
      NOTA: El progreso del cultivo (ya sea en botella o biorreactor) se monitorea mediante el uso de un hemocitómetro Petroff-Hauser de 0,02 mm de profundidad. Los enriquecimientos de microorganismos anaeróbicos o fastidiosos no suelen alcanzar densidades celulares en las que se pueda utilizar OD₆₀₀ , y otros métodos de detección no son prácticos para la monitorización rutinaria y repetitiva. Los límites de detección, el control de calidad y los cálculos estadísticos dependen del tipo de cámara de recuento de células y de las necesidades del usuario.
2. Crecimiento por biorreactor
   1. Preparación de un balón con una jeringa modificada
      1. Retire el émbolo de tres jeringas Luer Lock de 10 ml (una para cada ensamblaje final). Corta la brida de cada jeringa y lima el extremo cortado para que no perfore los globos. Limpie todas las virutas limadas de la jeringa modificada.
      2. Prepara un globo doblado colocando un globo dentro de otro.
      3. Estire el extremo del balón doblado sobre la jeringa modificada de 10 ml.
      4. Separe ligeramente el extremo del globo exterior del globo interior. Exprime todo el aire atrapado entre los globos.
      5. Apriete una brida alrededor de la base de los globos para asegurarlos a la jeringa.
   2. Preparación de un tapón modificado
      1. Retire los émbolos de diez jeringas Luer Lock de 1 ml (dos para cada tapón que se vaya a modificar). Corta la brida de las jeringas.
      2. Coloque dos tapones de goma tamaño # 10 (para garrafas de 8 L) y tres tamaños para botellas con acabado de rosca GL45 (para botellas de captura). Con una broca de 1/4" (6,4 mm), taladre dos agujeros en la parte superior de cada tapón de goma lo suficientemente anchos para que las jeringas modificadas encajen y lo suficientemente estrechos para que el ajuste sea hermético.
      3. Inserte las jeringas modificadas a través de los orificios del tapón de goma.
      4. Limpie y autoclave el tapón modificado a 121 °C durante 30 min.
   3. Preparación del conjunto del biorreactor
      1. Desinfecte con etanol al 70% todas las llaves de paso, los conectores del adaptador de bloqueo Luer hembra y otros materiales de biorreactor no esterilizables en autoclave, y autoclave a 121 °C durante 30 minutos todos los tubos (después de cortar a medida), tapones, lana de vidrio y otros materiales de biorreactor esterilizables en autoclave.
      2. Coloque un biorreactor estéril (Figura 1 y Figura 2) en un soporte de anillo y asegúrelo con una correa de cadena. También coloque un baño de agua, una bomba peristáltica, la garrafa de 8 L con tapón que contiene el medio (del paso 1.2 del protocolo), una botella de 3,5 L (botella de captura sin muestreo) y una botella de 500 ml (botella de captura de muestreo).
      3. Taponando la garrafa
         1. Coloque un globo con una jeringa modificada. Conecte una llave de paso de tres vías a la punta de bloqueo luer de la jeringa.
         2. Tome el conjunto del globo y conecte la llave de paso de tres vías a la tubería de un tanque de N₂. Gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo abierto a la atmósfera.
         3. Abra el tanque de gasolina y llene el globo con N₂. Una vez lleno, gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo del globo. Cierre el tanque de gasolina y desconecte la tubería del tanque de la llave de paso de tres vías.
         4. Conecte lo siguiente en secuencia: una llave de paso de tres vías (del globo con la jeringa modificada), una llave de paso de dos vías, un acoplador adaptador de bloqueo luer hembra y la punta de bloqueo luer de una de las jeringas del tapón modificado.
         5. A la punta luer lock de la otra jeringa, conecte una llave de paso bidireccional. Cierre ambas válvulas de las llaves de paso de dos vías en el conjunto de tapón modificado.
         6. Desenrosque el cable que sujeta el tapón de tamaño # 10 sin modificar de la garrafa. Reemplace rápidamente el tapón sin modificar con el conjunto de tapón modificado y gire el cable como antes para asegurar el conjunto de tapón modificado a la garrafa.
            NOTA: Si está seguro y preparado, el conjunto de tapón modificado se puede utilizar para tapar la garrafa en el paso final de la preparación del medio (paso 1.2.2.7).
         7. Gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo abierto a la atmósfera. Abra la llave de paso bidireccional en secuencia. El gas del globo y el espacio de cabeza de la garrafa de 8 L ahora están conectados.
      4. Taponado de las botellas de captura sin muestreo y de muestreo
         1. Tapar la botella de captura sin muestreo de 3,5 L con un tapón modificado dimensionado para botellas con acabado de rosca GL45, aplicando etanol al 70% en la base del tapón para ayudar a encajarlo en la botella. Tape la botella con un tapón de rosca abierto GL45.
         2. Conecte lo siguiente en secuencia: un globo con la punta luer lock de la jeringa modificada, una llave de paso de tres vías, un acoplador adaptador luer lock hembra y la punta luer lock de una de las jeringas del tapón modificado. Gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo abierto directamente a la atmósfera.
         3. A la punta luer lock de la otra jeringa, conecte un acoplador adaptador luer lock hembra.
         4. Repita los tres pasos anteriores para el frasco de captura de muestra de 500 ml.
      5. Instalación de la tubería
         1. Mida la distancia entre los puertos de la camisa de agua del biorreactor y las lengüetas de la manguera del baño de agua. Corte dos longitudes de tubo de silicona de 3/16" (4,8 mm) de diámetro interior y 3/8" (9,5 mm) de diámetro exterior para abarcar esta distancia.
         2. Ensamble dos conectores de manguera rectos con tapones de rosca abiertos GL14. Conecte cada uno a un extremo de las dos piezas del tubo.
         3. Gire los tapones de rosca en los puertos de la camisa de agua del biorreactor. Conecte los otros extremos de la tubería a las lengüetas de la manguera del baño de agua para que el agua salga del baño de agua, entre por la parte inferior de la camisa de agua del biorreactor, salga por la parte superior de la camisa de agua y regrese al baño de agua. Apriete las bridas alrededor de los extremos del tubo para asegurarlo a las lengüetas de la manguera del baño de agua.
         4. En el caso de bombas similares a la minibomba de caudal variable de caudal ultrabajo de VWR, pase el conjunto de tubo ranurado de 4,8 mm (3/16" de diámetro exterior) a través de la bomba.
         5. Mida la distancia entre el conjunto de tubos de garrafón y el conjunto de tubos de la bomba peristáltica. Corte una longitud de tubo de silicona de 3/16" (4,8 mm) de diámetro interior y 3/8" (9,5 mm) de diámetro exterior para abarcar esta distancia.
         6. Conecte un extremo de la tubería a la lengüeta de la manguera del conjunto de tubos de garrafón y el otro a la lengüeta de la manguera del conjunto de tubos de la bomba peristáltica, orientada de modo que el medio fluya desde la garrafa y a través de la bomba peristáltica.
         7. Mida la distancia entre el conjunto de tubería de la bomba peristáltica y el puerto inferior del biorreactor. Corte una longitud de tubo de silicona de 3/16" (4,8 mm) de diámetro interior y 3/8" (9,5 mm) de diámetro exterior para abarcar esta distancia.
         8. Conecte un extremo de este tubo a la lengüeta de la manguera del conjunto de tubos de la bomba peristáltica y conecte con cuidado el otro al puerto inferior del biorreactor. Teniendo cuidado de no romper el vidrio, pero también de asegurar la conexión, apriete una brida alrededor del extremo del tubo para asegurar el tubo al puerto inferior del biorreactor.
         9. Mida y corte aproximadamente 5" (127 mm) de longitud de tubo de silicona de 3/16" (4,8 mm) de diámetro interior, 3/8" (9,5 mm) de diámetro exterior.
         10. Conecte un conector adaptador de bloqueo Luer hembra a una llave de paso de tres vías. Conecte cualquier extremo de la llave de paso de tres vías al tubo.
         11. Ensamble un conector de manguera en ángulo con el tapón de rosca abierto GL14. Conéctelo al otro extremo del tubo.
         12. Gire la tapa de rosca en el puerto vertical superior del biorreactor. Gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo que apunta al biorreactor.
         13. Mida la distancia entre el conjunto de puerto vertical superior y el conjunto de botella de captura sin muestreo. Corte una longitud de tubo de silicona de 3/16" (4,8 mm) de diámetro interior y 3/8" (9,5 mm) de diámetro exterior para abarcar esta distancia. Corte las bridas de dos jeringas Luer Lock de 1 ml e insértelas en los extremos del tubo.
         14. Conecte un extremo de este conjunto de tubería a la llave de paso de tres vías del conjunto de puerto vertical superior y conecte el otro extremo al conector adaptador de bloqueo luer hembra en el conjunto de botella de captura sin muestreo.
         15. Mida la distancia entre el conjunto de puerto vertical superior y el conjunto de la botella de captura de muestreo. Corte una longitud de tubo de silicona de 3/16" (4,8 mm) de diámetro interior y 3/8" (9,5 mm) de diámetro exterior para abarcar esta distancia. Corte las bridas de dos jeringas Luer Lock de 1 ml e insértelas en los extremos del tubo.
         16. Conecte un extremo de este conjunto de tubería a la llave de paso de tres vías del conjunto de puerto vertical superior y conecte el otro al conector adaptador de bloqueo luer hembra en el conjunto de la botella de captura de muestra.
   4. Llenado del biorreactor
      1. Cubra uno de los puertos GL18 del biorreactor con un tabique de goma blanca. Tape el otro puerto GL18 y los puertos GL14 expuestos verticalmente restantes con tabiques de silicona revestidos de PTFE de tamaño GL18/GL14 (PTFE orientado hacia el vidrio) y tapones de rosca superiores abiertos.
      2. Con una varilla de 50 cm de longitud, empaque 0,9 g de lana de vidrio en la base del biorreactor.
      3. Autoclave 1,3 L de arena a 121 °C durante 30 min. Llene el biorreactor con la arena usando un embudo.
         NOTA: Aquí se pueden sustituir otros tipos de sedimentos informados por el entorno del lector y los microorganismos de interés.
      4. Coloque el tubo en un tanque de N₂ en la parte superior del biorreactor y enjuague el espacio de cabeza del biorreactor con N₂ durante 2 min. Tape inmediatamente el biorreactor con un tapón de tamaño #7 y un tapón de rosca GL45 abierto.
      5. De la botella de captura sin muestreo, desconecte el tubo y gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo que apunta al globo. Conecte el tubo a un tanque de N₂ al conector del adaptador Luer Lock hembra y enjuague el espacio de cabeza del biorreactor con N₂ durante 2 minutos. Vuelva a conectar inmediatamente el tubo y vuelva a colocar la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo abierto a la atmósfera.
      6. Repita el paso anterior para la botella de captura de muestreo.
      7. Gire la llave de paso de tres vías del puerto vertical superior del biorreactor para bloquear el extremo que apunta a la botella de captura de muestra. Bombee líquido desde la garrafa al biorreactor. Ponga en pausa la bomba y ventile el globo de la botella de muestreo, y llene el globo de la garrafa con N₂ según sea necesario.
      8. Una vez que el biorreactor se haya llenado con el medio, ajuste el caudal de la bomba a 0,6 ml/min (valor digital de 40 en la minibomba).
         NOTA: Aquí se pueden sustituir otros caudales deseados por el lector.
      9. Ajuste la temperatura del baño de agua, según lo informado por la Tabla 1 o el entorno de interés del lector.
         NOTA: El inóculo se puede agregar en este punto o más tarde, dependiendo de los detalles del estudio. Si se inocula en este punto, continúe con el paso 3.2.4.10. Si se inocula más tarde, continúe con el paso 3.2.5.
      10. Coloque un frasco de recolección o un frasco de cultivo inoculado y un frasco estéril de N₂ con tapón. Gotee etanol 100% sobre los tapones y préndales fuego con un encendedor.
      11. Coloque una aguja de 23 G en una jeringa de 60 ml. Una vez que los tapones ya no estén en llamas, inserte la aguja en el frasco de N₂ y extraiga ~ 50 ml de N₂. Extrae la aguja.
      12. Presione lentamente el émbolo para liberar el N₂. Tan pronto como la jeringa esté vacía, inserte la aguja en el frasco de recolección y extraiga 50 ml de la muestra ambiental. Extrae la aguja.
      13. Cambie la aguja de 23 G por una aguja metálica larga estéril (cánula, longitud 31,5 cm). Inserte la aguja metálica larga a través del tabique de goma blanca en el puerto GL18 del biorreactor.
      14. Introduzca la aguja en el sedimento e inyecte el inóculo. Extrae la aguja.
   5. Mantenimiento del biorreactor en funcionamiento
      1. Cada día que el biorreactor esté funcionando, realice lo siguiente:
         1. Compruebe el nivel del baño de agua. Si es bajo, agregue más agua (use agua destilada para la longevidad del equipo al reducir la corrosión y la acumulación de minerales).
         2. Compruebe el globo de la botella de captura que no toma muestras; Un globo lleno inhibirá el flujo del medio. Cuando esté lleno, gire la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo que apunta a la botella de captura. Aprieta el globo para vaciarlo; luego, regrese la llave de paso de tres vías para bloquear el extremo abierto a la atmósfera; Repita hasta que el globo esté vacío.
         3. Compruebe el globo de la garrafa de 8 L. Si es bajo, cierre la llave de paso de dos vías en secuencia y desconecte la llave de paso de tres vías de la llave de paso de dos vías. Rellene y vuelva a colocar el conjunto del globo siguiendo los pasos 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 y 3.2.3.3.7.
         4. Compruebe el nivel del medio en la garrafa de 8 L. Si es bajo, monte otra garrafa de 8 L y prepare más medio siguiendo los pasos del protocolo 1.2. y 3.2.3.3. Detenga la bomba, cierre la válvula de bola de lengüeta de la manguera, desconecte rápidamente la garrafa vieja y conecte la garrafa nueva.
            NOTA: Para un caudal de 0,6 ml/min, se necesitará un medio nuevo cada 9 días.
         5. Compruebe el nivel del medio en la botella de captura sin muestreo. Si está lleno, monte otra botella de captura que no sea de muestreo de acuerdo con el paso 3.2.3.4.1. Enjuague el nuevo frasco con N₂, desconecte rápidamente el globo con la jeringa modificada y el tubo del frasco viejo y conéctelo al frasco nuevo.
         6. Retire el tapón modificado de una botella de captura llena que no sea de muestreo. Autoclave el líquido a 121 °C durante 30 min; Luego, deseche el líquido de acuerdo con las políticas institucionales del lector. Limpie y autoclave todas las piezas del conjunto de botellas de captura sin muestreo para prepararlas para el próximo uso.
      2. Realice el muestreo cada 7 días (o el número de días deseado por el lector) haciendo lo siguiente:
         1. Gire la llave de paso de tres vías del puerto vertical superior del biorreactor para bloquear el extremo que apunta a la botella de captura que no toma muestras. Recoja 250 ml de líquido.
            NOTA: Para un caudal de 0,6 ml/min, la recolección de 250 ml tomará ~7 h.
         2. Vuelva a colocar la llave de paso de tres vías del puerto vertical superior del biorreactor para bloquear el extremo que apunta a la botella de captura de muestra. Desconecte el tubo y la botella de captura de muestreo de la llave de paso de tres vías del puerto vertical superior del biorreactor.
         3. Después de la prueba, el almacenamiento y/o la eliminación adecuada del líquido de muestreo, limpie todas las piezas del conjunto de la botella de captura de muestreo, excepto el globo, con la jeringa modificada. Autoclave todas las piezas a 121 °C durante 30 min, excepto el globo, con la jeringa modificada y los conectores adaptadores Luer Lock hembra. Vuelva a montar para el siguiente día de muestreo.
            NOTA: Se recomienda encarecidamente tener redundancia duplicada o triplicada de piezas, tapas, tubos y tabiques para una reparación y reemplazo rápidos si es necesario.

Aquí mostramos los resultados de un estudio de biorreactor utilizando un método de preparación de medio de cultivo mixto de pozo y un método de configuración de biorreactor como se describe en este documento. El medio de cultivo mixto de pozo fue modificado para contener como fuente de carbono una lechada de mazorcas de maíz procesada por Disolución Hidrotermal Oxidativa (OHD)13,14. El medio de cultivo mixto de pozo modificado se bombeó al biorreactor durante 44 días a una velocidad de 0,4 mL/min. El día 23, se agregó un inóculo procedente del pozo BLM-1 en la región del Valle de la Muerte de Nevada, EE. UU.15. Las muestras líquidas del biorreactor se recogieron en una botella de captura de muestras los días 1, 8, 15, 22, 23 (después de la inoculación), 30, 37 y 44.

Para rastrear el estado general del cultivo de inóculo (y de los habitantes del sedimento del biorreactor que sobrevivieron al autoclave antes del inóculo), se observaron muestras líquidas del biorreactor mediante recuentos celulares directos. Los recuentos celulares directos del líquido muestreado se realizaron con un hemocitómetro Petroff-Hauser. Para conocer la identidad de los miembros microbianos del biorreactor, se extrajo ADN de muestras líquidas del biorreactor y se analizaron los genes de ARNr 16S mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Los datos de NGS se procesaron internamente utilizando mothur siguiendo el POE16 de MiSeq.

Antes de la inoculación, los recuentos celulares directos a menudo estaban por debajo del límite de detección (b.d.l.) de 1,0 × 106 células/ml. El día 23 (después de la inoculación) tuvo un recuento celular bajo de 2,6 × 106 células/ml, mientras que los días siguientes 30, 37 y 44 tuvieron recuentos celulares superiores a 1,0 × 107 células/ml (Figura 3). A pesar de que los recuentos celulares fueron d.d.l. en los días 1, 8 y 22, se extrajo ADN para NGS de todos los puntos de tiempo, lo que indica una presencia basal de microorganismos pre-inóculo en el sedimento incluso después del autoclave. El género principal presente (determinado por el número de lecturas en cada Unidad Taxonómica Operativa (OTU)) se mantuvo estable en los días 8, 15 y 22, y se identificó como Geobacillus. Después de la inoculación con el inóculo BLM-1 el día 23, Geobacillus dejó de dominar, y surgieron nuevos géneros principales junto con una multitud de géneros de menor presencia, que en su mayor parte, mantuvieron una presencia hasta el final del estudio (Figura 4). A partir de estos, concluimos que el inóculo BLM-1 era un cultivo activo y dinámicamente cambiante dentro del biorreactor.

Un estudio adicional de los datos de NGS reveló miembros de la "materia oscura microbiana". Las OTU con nombres taxonómicos asignados que contenían las palabras "no clasificado" o "no cultivado" se utilizaron como un sustituto de las OTU que contenían miembros de la "materia oscura microbiana". Los datos de NGS se recopilaron para el día 44 (el último día de la posinoculación con microorganismos del pozo BLM-1) y se filtraron para que no contuvieran OTU que tuvieran lecturas en los datos previos a la inoculación (días 1, 8, 15 o 22), ya que no era probable que estas OTU estuvieran en el inóculo. Los datos filtrados de NGS del día 44 contenían 1.844 OTU y 3.396 lecturas. De estas, 366 OTU (20%) y 925 lecturas (27%) no estaban clasificadas a nivel de filo, y 1252 OTU (68%) y 2357 lecturas (69%) no estaban clasificadas o no cultivadas a nivel de género. Aunque a corto plazo, este estudio piloto respalda el potencial de un biorreactor con medios ambientalmente informados para cultivar miembros de la "materia oscura microbiana".

Figura 1: Esquema del biorreactor de borosilicato diseñado a medida utilizado para el cultivo anaeróbico. (A) Vista del biorreactor desde un lado. (B) Girando A 90° (en el sentido de las agujas del reloj) alrededor del eje z se obtiene la vista). (C) Una vista superior del biorreactor. El diseño encamisado permite el control de la temperatura con agua o aceite. Los dos puertos de la cubierta se pueden ver en el lado derecho de la vista en B. La cámara interior puede llenarse con sedimentos de cualquier tipo o puede dejarse vacía de sedimentos para el cultivo planctónico. Tres puertos de muestreo (que se ven en el lado derecho de la vista en A) permiten eliminar material a diferentes profundidades de la columna del biorreactor. Las aberturas estándar de 45, 18 y 14 GL se pueden sellar con tabiques de teflón o butilo que mantendrán un sello hermético al gas durante 1 a 6 meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Conjunto de biorreactor activo. Los artículos de vidrio que se presentan en la foto de izquierda a derecha son (A) garrafón de 8 L, (B) biorreactor (ver Figura 1) y (C) botella de captura sin muestreo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Recuentos celulares directos del estudio del biorreactor. Las poblaciones microbianas dentro del biorreactor se monitorizaron utilizando una cámara de recuento de células de hemocitómetro Petroff-Hauser de 0,02 mm. El inóculo se añadió al comienzo del día 23. Los recuentos celulares de los días 1, 8 y 22 estuvieron por debajo del límite de detección. El límite de detección efectivo del recuento celular directo es de 1 × 106 células/ml. Abreviatura: b.d.l. = por debajo del límite de detección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Secuenciación de nueva generación del biorreactor. Las OTU se representan en gráficos de barras apiladas que indican el porcentaje de lecturas que pertenecen a OTU únicas de cada punto de tiempo del estudio del biorreactor. Las OTU únicas se asignaron a su taxonomía asociada en un punto de corte de género. El género 'Otro' se define como todos los géneros con menos del 10% de lecturas en cada punto de tiempo. El número total de lecturas de ADN representadas es de 506.358. El número de lecturas para cada punto de tiempo se muestra en la parte superior del gráfico. El inóculo se añadió al comienzo del día 23. Abreviatura: OTU = Unidad Taxonómica Operativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de los medios. Lista de compuestos y parámetros físicos para cada medio. Los medios presentados son ingenuos; No contienen carbono ni fuentes de energía, ya que estas pueden ser específicas y deben estar informadas por los microorganismos y el entorno de interés del lector. Consulte la sección de discusión para obtener ideas sobre posibles adiciones de carbono y fuentes de energía.

Archivo complementario 1: Configuración del colector de gas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.