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Artículo de método

Técnicas de cultivo in vitro para modelar la organogénesis del hígado, construir ensamblajes y diseñar tejidos sintéticos utilizando líneas celulares humanas

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DOI:

10.3791/66229

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18 de abril de 2025

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1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

En este artículo

Resumen

Los organoides revolucionan el modelado personalizado de tejidos para el desarrollo de órganos, el descubrimiento de fármacos y la investigación de enfermedades. La ingeniería de organoides avanza en la creación de intrincados tejidos sintéticos. El objetivo es integrar la morfogénesis, la tecnología de ensamblaje y las biomatrices para avanzar en la ingeniería de tejidos. Este protocolo ayuda a modelar la organogénesis hepática y a establecer directrices para la construcción de tejidos sintéticos.

Resumen

La enfermedad hepática crónica ha alcanzado proporciones epidémicas, afectando a más de 800 millones de personas en todo el mundo. El tratamiento actual, el trasplante hepático ortotópico, tiene varias limitaciones. Han surgido soluciones prometedoras en el campo de la medicina regenerativa hepática, con un potencial significativo de la organogénesis hepática. La organogénesis hepática temprana, que ocurre entre E8.5 y 11.5, implica la formación de interacciones epitelio-mesenquimales que conducen a la morfogénesis, la formación del cordón hepático y la migración colectiva. Sin embargo, hay una falta de métodos para el modelado in vitro de este proceso. En este estudio, se presenta una serie detallada de métodos, que permiten modelar varias etapas y aspectos de la organogénesis hepática con líneas celulares humanas. En una serie de métodos, se utiliza la tecnología de ensamblaje con esferoides hepáticos (HEP) y mesenquimales (MES), replicando estructuras tempranas encontradas en la organogénesis hepática, modelando la morfogénesis temprana y demostrando la migración celular intersticial como se ve in vivo. Estos innovadores sistemas de ensamblajes ayudan a identificar los factores que influyen en la formación y migración de ensamblajes. También se emplearon sistemas de cultivo de esferoides HEP para modelar la migración colectiva y la morfogénesis ramificada. Los medios condicionados por mesénquima (M-CM) desempeñan un papel importante en el inicio de la migración de ramificaciones dependientes de la dosis. Todos los métodos presentados demostraron ser altamente reproducibles con una alta tasa de éxito. Al vincular estos eventos entre sí, nuestro trabajo permitirá recrear eventos morfogenéticos secuenciales para realizar ingeniería inversa de la organogénesis in vitro e in vivo.

Introducción

La migración de células hepáticas desempeña un papel importante en la organogénesis hepática, la enfermedad y la terapia celular. Durante la organogénesis hepática (E8.5-9.0, ratón), el epitelio prehepático ventral del intestino anterior comienza a expresar genes hepáticos debido a señales inductivas que emanan del mesénquima circundante y del corazón. En E9.0, el epitelio del intestino anterior se engrosa a medida que las células pasan de una morfología cilíndrica cuboidal a una pseudoestratificada, formando el divertículo hepático1,2. En esta etapa crítica, el divertículo hepático está compuesto por solo ~ 1,500 células. A continuación, el endodermo hepático que recubre el divertículo hepático se engrosa, se deslamina y forma cordones de hepatoblastos migratorios (HB). Estos HBs co-migran con las células endoteliales y las células mesenquimales, ramificándose en el tejido mesenquimal circundante, iniciando la migración celular colectiva tridimensional para formar la yema hepática3,4. De hecho, durante esta etapa, las células experimentan colectivamente (1) co-migración, o movimiento junto con otros tipos de células, (2) morfogénesis ramificada o formación de estructuras ramificadas en forma de tubo, y (3) migración intersticial, o migración encima de, o entre otras células. En E11.5, la migración cesa y se ha formado el hígado primitivo, expandiéndose 103 veces3. La migración de células hepáticas también puede ser necesaria en etapas posteriores de la organogénesis hepática, ya que la expresión de HBs fetales de rata ha mostrado evidencia de genes altamente regulados al alza asociados con la migración celular colectiva 3D, la morfogénesis y la remodelación de la matriz extracelular5. Además de su papel en la organogénesis hepática temprana, la migración colectiva 3D está estrechamente relacionada con la diseminación local y la metástasis del carcinoma hepatocelular (CHC) avanzado, lo que en última instancia conduce a un peor pronóstico y a un aumento de la resistencia al tratamiento6. Los hepatocitos adultos y fetales también emplean la migración colectiva cuando se desplazan desde el bazo hasta el interior del hígado durante la repoblación hepática. Los estudios de imagen in vivo han demostrado que los hepatocitos trasplantados entran en la vena porta y luego en los capilares en cuestión de horas, migrando a través de los sinusoides hepáticos y a través del tejido hepático7,8,9. Finalmente, estudios recientes demuestran que los HB migratorios surgen durante la regeneración del hígado murino y humano, con alguna evidencia de movimiento en las sábanas10. En general, la migración colectiva del hígado, capaz de múltiples modos de morfogénesis, desempeña un papel importante en la organogénesis, el cáncer, la terapia celular de hepatocitos y la regeneración hepática.

Numerosos estudios genéticos han explorado las vías moleculares que subyacen a la migración celular colectiva del hígado en 3D. Estos estudios revelan que la ausencia de cordones hepáticos dificulta la formación del hígado, lo que subraya la necesidad de la formación del cordón hepático y sus interacciones con las células de soporte para la formación del hígado1,11,12,13. Estos estudios también demuestran que el crecimiento del hígado se inicia por varios factores, incluyendo FGF-2 secretado por el mesodermo cardíaco, BMP4 secretado por el mesénquima circundante, HGF y las interacciones de las células endoteliales. Además, los factores de transcripción asociados a la migración, incluidos HEX, PROX1 y TBX3, juegan un papel crucial2,14. En conclusión, los estudios genéticos proporcionan evidencia de que la señalización del factor soluble, que conduce a la expresión del factor de transcripción, impulsa la migración, la señalización y las interacciones moleculares entre los HB y su mesénquima circundante.

Si bien la migración celular en la organogénesis hepática temprana ha sido ampliamente investigada, los estudios in vitro actuales de la migración hepática frecuentemente emplean ensayos 2D que utilizan células HCC altamente migratorias junto con modelos tumorales in vivo15. Estos estudios han proporcionado información sobre varios factores que influyen en la migración hepática, incluyendo TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 y miRNAs21,22,23. Aunque se han realizado avances notables en la comprensión de los mecanismos moleculares de la migración de células hepáticas en 3D, las claras disparidades entre la migración celular en 2D y en 3D sugieren que los ensayos en 2D poseen limitaciones inherentes. Además, estos modelos a menudo carecen de la inclusión de tipos de células mesenquimales, que son esenciales tanto para la migración como para el crecimiento. Aunque ha habido avances en el desarrollo de modelos 3D para la migración hepática que integran el mesénquima de soporte, estos modelos enfatizan principalmente la comigración en lugar de explorar los diversos modos de migración colectiva.

La capacidad de generar tejidos a partir de esferoides a través de diversos procesos de autoensamblaje y morfogenéticos facilita la exploración científica de los tejidos sintéticos. Estos tejidos tienen amplias aplicaciones en el desarrollo y la detección de fármacos, el modelado de enfermedades, la terapia y otras aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. Se proporcionan los detalles metodológicos de varios sistemas de cultivo in vitro en 3D diseñados para exhibir diferentes modos de migración colectiva del hígado en 3D. Estos sistemas comprenden (1) cultivo de coesferoides con esferoides HEP y MES en una matriz, (2) gotas de matriz de esferoide HEP cultivadas con M-CM, (3) esferoides mixtos HEP-MES y (4) matriz de esferoides HEP cultivada con una alta densidad de células MES. Estos sistemas permiten un modelado robusto de la migración colectiva del hígado en un entorno 3D, avanzando así en nuestra comprensión de los procesos moleculares y celulares que subyacen a la organogénesis del hígado, el cáncer y la terapia.

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Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. Las abreviaturas utilizadas en este artículo se definen en el Archivo Complementario 1.

1. Preparación de solución de agarosa al 1% de baja electroendosmosis (EEO)

  1. Pese 2,5 g de polvo de agarosa de baja EEO y transfiéralo a un vaso de precipitados.
    NOTA: Asegúrese de que el vaso de precipitados tenga al menos el doble del tamaño del volumen deseado para acomodar el burbujeo durante la preparación de la solución.
  2. Utilice un cilindro graduado para medir 250 ml de agua destilada y viértala en el vaso de precipitados, con el objetivo de obtener una concentración final (p/v) del 1%.
  3. Cubra la abertura del vaso de precipitados con una envoltura de plástico, dejando un pequeño orificio para la ventilación. Calentar el vaso de precipitados en el microondas durante 30 s.
  4. Retire con cuidado el vaso de precipitados y agite el contenido. Repita este proceso cada 30 s hasta la disolución completa.
    PRECAUCIÓN: Manipule la cristalería para microondas con cuidado, usando guantes adecuados. Vigile la solución de cerca para evitar que se sobrecaliente o hierva.
  5. Una vez que se logre una solución homogénea, retire el vaso de precipitados del microondas. Agite suavemente la solución antes de transferirla a un biberón preesterilizado. Esterilizar la solución en autoclave y almacenar la solución de agarosa a temperatura ambiente (RT) hasta que esté lista para usar.

2. Recubrimiento de placa de 96 pocillos

NOTA: Las microplacas esferoides de conexión ultrabaja de 384 pocillos se pueden utilizar en estos y otros experimentos.

  1. Afloje la tapa del frasco que contiene la solución estéril de agarosa al 1%. Calentar la solución en el microondas en intervalos de 30 s hasta que pase a la fase líquida; A continuación, apriete la tapa.
    PRECAUCIÓN: Manipule la cristalería para microondas con cuidado, usando guantes adecuados. Vigile de cerca la solución para evitar que se sobrecaliente o hierva.
    NOTA: Realice estos pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos estéril.
  2. Transfiera 55-65 μL de la solución de agarosa al 1% por pocillo para recubrir la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y gire inmediatamente la placa.
  3. Una vez que la solución de agarosa al 1% se haya transferido al número deseado de pocillos, coloque las placas en un refrigerador a 4 °C durante 20-30 minutos para permitir que la agarosa se solidifique. Antes de usar, lleve la placa a temperatura ambiente (Figura 1A).

3. Preparación de esferoides HEP

  1. Cultive células HepG2-WT en un matraz T-75 utilizando un medio de crecimiento completo (cDMEM) compuesto por el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep). Mantener el cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2, cambiando diariamente el medio de crecimiento.
  2. Al alcanzar el 80% de confluencia, enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y deseche el enjuague. Añadir 5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% al matraz e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 5-10 min.
  3. Agregue cantidades iguales de cDMEM y lave las células del matraz. Una vez que las células se desprendan, transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL y centrifugue la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a RT.
    NOTA: Todos los pasos de centrifugación descritos en este protocolo se realizaron a temperatura ambiente (RT). Sin embargo, estos procedimientos de centrifugación pueden llevarse a cabo alternativamente a bajas temperaturas.
  4. Vuelva a suspender la suspensión celular en cDMEM fresco y cuente las células para determinar la concentración final en células/mL (Figura 1B).
  5. Marcaje de las células
    NOTA: Este es un paso opcional.
    1. Transfiera la cantidad deseada de suspensión celular a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL y centrifuga la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.
    2. Vuelva a suspender el pellet de células en un medio de crecimiento sin suero para lograr una concentración final de 1,0 x 106 células/mL. Añadir 5 μL de solución fluorescente de marcaje celular por mL de suspensión celular e incubar la suspensión celular a 37 °C y 5% de CO2 en rotación durante 20 min.
      NOTA: El medio de crecimiento sin suero es DMEM y solo se complementa con un 1% de pen-estreptococo. Ajuste el tiempo de incubación para una tinción uniforme en función de la densidad de la suspensión celular.
    3. Una vez finalizada la incubación, centrifugar la suspensión celular a 450 x g durante 5 min y volver a suspender el pellet celular en cDMEM fresco. Repita este proceso de lavado dos veces más (Figura 1C).
  6. Formación de esferoides
    1. Suspenda las células en cDMEM fresco para lograr una concentración final de 5,0 x 104 células/ml según el recuento de células. Mezcle bien la suspensión celular y transfiera 100 μL de suspensión celular por pocillo a la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa.
      NOTA: La densidad de suspensión celular está configurada para alcanzar 5,000 celdas por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa. Para el uso de placas de 384 pocillos, las celdas se suspenden a una concentración final de 2,0 x 105 celdas/mL, y se transfieren 50 μL de suspensión celular por pocillo para lograr una concentración de 10.000 células por pocillo.
    2. Centrifugar la placa a 340 x g durante 10 min e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 5-9 días (Figura 1D).
      NOTA: Cambie el medio de crecimiento cada dos días después de la siembra, eliminando suavemente el 50% de cDMEM y reemplazándolo. Los esferoides HEP son adecuados para el modelo de ensamblaje HEP-MES o el modelo M-CM.

4. Preparación de esferoides MES

  1. Cultive células HFF/MRC-5 en un matraz T-175 utilizando cDMEM compuesto por DMEM, suplementado con un 10% de FBS y un 1% de Pen-Strep. Mantener el cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2, cambiando el medio cada dos días.
  2. Al alcanzar el 80% de confluencia, realice un enjuague de las celdas con 1x PBS y deseche el enjuague. Añadir 5 mL de Tripsina-EDTA al 0,25% al matraz e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 5-10 min.
  3. Agregue cantidades iguales de cDMEM y lave las células del matraz. Una vez que las células se desprendan, transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL y centrifugue la suspensión celular a 300 x g durante 5 minutos.
  4. Vuelva a suspender la suspensión celular en cDMEM fresco y cuente las células para determinar la concentración final en células/mL (Figura 1B).
  5. Marcaje de células con colorante
    NOTA: Este es un paso opcional.
    1. Transfiera la cantidad deseada de suspensión celular a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL y centrifuga la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.
    2. Vuelva a suspender el pellet de células en un medio de crecimiento sin suero para lograr una concentración final de 1,0 x 106 células/mL. Añadir 5 μL de solución fluorescente de marcaje celular por mL de suspensión celular e incubar la suspensión celular a 37 °C y 5% de CO2 en rotación durante 20 min.
      NOTA: El medio de crecimiento sin suero es DMEM y solo se complementa con un 1% de pen-estreptococo. Ajuste el tiempo de incubación para una tinción uniforme en función de la densidad de la suspensión celular.
    3. Una vez finalizada la incubación, centrifugar la suspensión celular a 450 x g durante 5 min y volver a suspender el pellet celular en cDMEM fresco. Repita este proceso de lavado dos veces más (Figura 1C).
  6. Formación de esferoides
    1. Suspenda las células en cDMEM fresco para lograr una concentración final de 1,0 x 105 células/ml según el recuento de células. Mezcle bien la suspensión celular y transfiera 100 μL de suspensión celular por pocillo a la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa.
      NOTA: La densidad de suspensión de celdas está configurada para lograr una densidad de 10,000 celdas por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa.
    2. Centrifugar la placa a 340 x g durante 10 min e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 5-9 días (Figura 1D).
      NOTA: Cambie el medio de crecimiento cada dos días después de la siembra, eliminando suavemente el 50% de cDMEM y reemplazándolo. Los esferoides MES son adecuados para el modelo de ensamblaje HEP-MES.

5. Formación de ensamblajes HEP-MES

NOTA: Consulte los pasos 3 y 4 para la formación de HEP (Figura 2A) y esferoides MES (Figura 2B).

  1. Recoja los esferoides HFF/MRC-5 individualmente con una pipeta de la placa de 96 pocillos. Transfiéralos a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL que contenga cDMEM fresco. Deje que los esferoides se asienten en el tubo durante 5 minutos y luego enjuague suavemente con cDMEM.
    tibio NOTA: Realice el proceso de enjuague suavemente y con cuidado.
  2. Transfiera suavemente un solo esferoide HFF/MRC-5 con una pipeta a un pocillo que contenga un esferoide HepG2-WT. Añada Matrigel (MG) o colágeno de cola de rata (CG) con factor de crecimiento reducido (GFR) en una dilución 1:1 y 1:5 e incube a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h (Figura 2C).
    NOTA: Descongele MG durante la noche en hielo en un refrigerador de 2 °C a 8 °C. Asegúrese de utilizar pipetas, puntas y tubos preenfriados cuando manipule MG, ya que forma un gel por encima de 10 °C.
  3. Después de la incubación, añadir 75 μL de cDMEM fresco a cada pocillo e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2-3 días><. NOTA: Cambie el medio de crecimiento cada dos días después de la siembra, eliminando suavemente el 50% de cDMEM y reemplazándolo. Los ensamblajes se seguirán formando sin cambios de medio durante un máximo de 3 a 4 días. La formación de ensamblajes HEP-MES puede ocurrir sin el uso de la matriz.

6. Formación de gotas de esferoide HEP

NOTA: Consulte el paso 3 para la formación de esferoides HEP (Figura 3A). Se pueden utilizar dos materiales diferentes para suspender los esferoides HEP en gotas. Los dos métodos se proporcionan a continuación.

  1. Gotas de GFR MG
    1. Recoja los esferoides HepG2-WT individualmente con una pipeta de la placa de 96 pocillos, lo que permite que se depositen en una centrífuga cónica estéril de 15 ml sobre hielo.
    2. En un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL separado, mezcle 1 mL de MG GFR helado y medio de crecimiento de control helado a una dilución 1:1. Aspire el medio con una pipeta del tubo de 15 mL que contiene los esferoides HepG2-WT y colóquelo en hielo.
      NOTA: Descongele MG durante la noche en un refrigerador de 2 °C a 8 °C. Asegúrese de que las pipetas, puntas y tubos estén preenfriados cuando manipule MG, ya que forma un gel por encima de 10 °C.
    3. Agregue la solución de MG a los esferoides HepG2-WT, asegurando una distribución uniforme de los esferoides dentro de la solución de MG.
    4. Con una pipeta de 200 μL, recoja un volumen de 15 μL de un solo esferoide en la solución de MG y siembre lentamente en una placa de Petri de 60 mm (Figura 3B).
      NOTA: Si se siembra más de un esferoide por gota, retírelo y vuelva a sembrarlo correctamente. Los esferoides se reposicionan si es necesario para garantizar que estén en el centro de la gota. Para una siembra óptima de esferoides, considere usar el pipeteo inverso para minimizar la formación de burbujas de aire.
  2. Gotas de CG cola de rata
    NOTA: Toda la preparación del CG debe realizarse con hielo.
    1. Recoja los esferoides HepG2-WT individualmente utilizando una pipeta de la placa de 96 pocillos, permitiéndoles asentarse en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL sobre hielo (Figura 3B).
    2. En un tubo de microcentrífuga, agregue 358,8 μL de agua desionizada, 100 μL de PBS 10x, 12,1 μL de NaOH 1 N y 529,1 μL de CG de cola de rata para un volumen total de 1 mL.
      NOTA: Siempre se debe agregar el CG de cola de rata original al final.
    3. Agregue la solución de CG a los esferoides HepG2-WT, asegurando una distribución uniforme de los esferoides dentro de la solución de CG.
    4. Con una pipeta de 200 μL, recoja un volumen de 15 μL de un solo esferoide en la solución de CG y siembrójelo lentamente en una placa de Petri de 60 mm.
      NOTA: Si se siembra más de un esferoide por gota, retírelo y vuelva a sembrarlo correctamente. Los esferoides se reposicionan para garantizar que estén en el centro de la gota. Para una siembra óptima de esferoides, considere usar el pipeteo inverso para minimizar la formación de burbujas de aire.
  3. Incubar las gotas a 37 °C y 5% deCO2 durante 60 min antes de añadir el medio de crecimiento.
  4. Agregue lentamente 5 mL del medio de crecimiento deseado a la placa de Petri e incube a 37 °C, y 5% de CO2 con cambios en el medio de crecimiento cada tres días (Figura 3C).
    NOTA: Se utilizó M-CM en el ensayo de formación de gotas HEP.

7. Preparación de M-CM

  1. Recolectar células HFF/MRC-5 y sembrarlas en un matraz tratado con cultivo de tejidos T-75 a una densidad de siembra de 5.000 células/cm2 e incubar el matraz a 37 °C y 5% de CO2 durante 72 h en 15 mL de cDMEM.
    NOTA: Supervise el matraz durante este período para garantizar una salud celular óptima.
  2. Después de las 72 h de incubación, recoja el M-CM en un tubo centrífugo cónico estéril de 15 mL. Centrifugar la M-CM a 290 x g durante 5 min para la eliminación de residuos y filtrar utilizando un filtro de 0,2 μm para la esterilización (Figura 4A).
  3. Diluya el M-CM con medio de crecimiento completo en una proporción de dilución de 1:1 a 1:7 y agréguelo al experimento deseado (Figura 4B).
    NOTA: Utilice M-CM en el ensayo de formación de gotas HEP.

8. Formación de esferoides mixtos HEP-MES

NOTA: Consulte los pasos 3.1-3.5. para la preparación de la suspensión de celdas HepG2-WT y los pasos 4.1-4.5 para la preparación de la suspensión de celdas HFF/MRC-5.

  1. Suspenda las células HepG2-WT en cDMEM fresco para lograr una concentración final de 1,0 x 105 células/mL por cada suspensión celular.
  2. Suspenda las células HFF/MRC-5 en cDMEM fresco para lograr una concentración final de 1,0 x 105 células/mL para cada suspensión de células.
  3. Transfiera las suspensiones de células HepG2-WT y HFF/MRC-5 a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mL en una proporción de 1:1 para obtener una concentración final de 2,0 x 105 células/mL. Mezcle bien la suspensión celular y transfiera 100 μL de suspensión celular por pocillo a la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa.
    NOTA: La densidad de suspensión celular está configurada para obtener 20,000 celdas por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa.
  4. Centrifugar la placa a 340 x g durante 10 min e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 1-2 días (Figura 5C).
  5. Adición de hidrogeles de fibrina
    NOTA: Este es un paso opcional que se realiza en 72 h después de enchapar esferoides mixtos HEP-MES.
    1. En un tubo centrífugo cónico estéril de 15 mL, mezcle fibrinógeno (3,25 mg/mL) y trombina (12,5 unidades/mL) en una proporción de 4:1 para la formación de fibrina y coloque el tubo en hielo.
  6. Transfiera la fibrina a cada pocillo con un esferoide mixto preexistente a una dilución 1:1 con cDMEM actual en el pocillo. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min.
  7. Después de la incubación, añadir 75 μL de cDMEM fresco a cada pocillo e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 1-2 días><. NOTA: Cambie el medio de crecimiento cada dos días después de la siembra, eliminando suavemente el 50% de cDMEM y reemplazándolo.

9. Modelo migratorio MES de alta densidad

NOTA: Consulte el paso 3 para la preparación de esferoides HepG2-WT (Figura 6A) y los pasos 4.1-4.5 para la preparación de la suspensión de celdas HFF/MRC-5 (Figura 6B).

  1. Suspenda las células HFF/MRC-5 en cDMEM fresco para lograr una concentración final de 6,0 x 105 células/mL y colóquelas en hielo.
  2. Mezcle la suspensión de celdas HFF/MRC-5 y MG/CG helada en una dilución 1:1 (Figura 6C).
    NOTA: La densidad de suspensión celular está configurada para obtener 30,000 celdas por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de agarosa. Descongele MG durante la noche en hielo en un refrigerador de 2 ° C a 8 ° C. Asegúrese de que las pipetas, puntas y tubos estén preenfriados cuando manipule MG, ya que forma un gel por encima de 10 °C.
  3. Transfiera 100 μL de solución de HFF/MRC-5 y MG utilizando una pipeta a un pocillo que contenga un esferoide HepG2-WT. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min.
  4. Después de la incubación, añadir 75 μL de cDMEM fresco a cada pocillo e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante un máximo de 12 días.

10. Análisis estadístico

  1. Revise y analice los datos recopilados utilizando Microsoft Excel o cualquier software estadístico/gráfico.
    NOTA: Para la evaluación estadística entre dos grupos, se realizó la prueba t de Student (tipo II con dos colas), y se consideró que los valores de p iguales o inferiores a 0,05 tenían significación estadística y se definen en el texto y en las leyendas de las figuras/figuras.

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Resultados

El interés en tejidos sintéticos para diversas aplicaciones biomédicas, como la modelización de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la ingeniería de tejidos (Figura 7), está en aumento. Dentro de este campo, los organoides, esferoides y células derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) están siendo transformados en tejidos sintéticos más complejos y de mayor tamaño. Esta transformación implica la aplicación de principios de la morfogénesis, el uso de herramientas como...

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Discusión

El presente protocolo abarca múltiples métodos para cultivar ensamblajes simples y complejos, así como técnicas para inducir la migración celular colectiva 3D en la organogénesis hepática temprana24,25. Los protocolos descritos destacan varios pasos críticos, siendo la formación de esferoides un aspecto central en todas las metodologías. Los micropocillos (96 o 384 pocillos) se utilizan con placas no adherentes o recubiertas de agarosa para lograr la formación de...

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Divulgaciones

NP es el fundador de Khufu Therapeutics, una empresa de ingeniería de organoides que desarrolla tratamientos para enfermedades hepáticas agudas y crónicas.

Agradecimientos

Los autores desean expresar su sincero agradecimiento a Ogechi Ogoke y Osama Yousef por sus valiosas contribuciones a los datos utilizados en este artículo. NP contó con el apoyo de los fondos iniciales UB CBE, una beca Mark Diamond, el C024316 de Ciencias de Células Madre del Estado de Nueva York, el centro de Células Madre en Medicina Regenerativa (ScIRM) de la UB, el Centro de Ingeniería de Células, Genes y Tejidos de la Universidad de Buffalo (CGTE).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microplaca de esferoide de fijación ultrabaja de 384 pocillos negro/transparente con fondo redondoCorning3830
Placa de cultivo celular de 96 wl plana,TC,STRL,1/pk,100/CSProductos de laboratorio Ventas701001
AgarosaSigma-AldrichA0576Baja EEO
Software AxiovisionZEISSversión 4
Placa de cultivo celular, 60 mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CSVentas de productos de laboratorio705001
matraz de cultivo celular, 175cm², ventilación, TC, STRL, 5/pk, 40/CSVentas de productosde laboratorio 709003
matraz de cultivo celular, 75cm², ventilación, TC, STRL, 5/pk, 100/CSVentas de productos de laboratorio708003
tubos de centrífuga, 15mL, PP, STRL, GRAD, 50/bg,500/CSVentas de productos de laboratorioL226010
Colágeno I, Cola de Rata, 100 mgCorning354236
DMEM, alto contenido de glucosa, Suplemento GlutaMAX, piruvatoThermoFisher Scientific10569010
EVOS Fluorescente, microscopio de contraste de faseEVOSAMEFC4300R1.360 x 1.024 píxeles
de densidad Fetal Suero bovino, calificado, Estados UnidosThermoFisher Scientific26140079
Fibrinógeno de plasma humanoSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
Membrana basal con factor de crecimiento reducido (GFR) de Matrigel Matrix, sin LDEV, 10 mLCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT BulletKit de crecimiento de células madre mesenquimales humanasLonzaPT-3001
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Trombina de plasma humanoSigma-AldrichT6884-100UN100 unidades
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenolThermoFisher Scientific25300062
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenolThermoFisher Scientific25200072
Solución de etiquetado de células Vybrant DiDThermoFisher ScientificV22887
Solución de etiquetado de células Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Etiquetado de células SoluciónThermoFisher ScientificV22886
Zeiss AxioZEISSSE64, densidad de 1.344 píxeles y 1.024 píxeles
Microscopio de fluorescencia

Referencias

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