Artículo de método

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

DOI:

10.3791/66231

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26 de enero de 2024

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1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La secuenciación unicelular ha permitido el mapeo de poblaciones celulares heterogéneas en el estroma de los órganos hematopoyéticos. Estas metodologías proporcionan una lente a través de la cual estudiar la heterogeneidad no resuelta previamente en estado estacionario, así como los cambios en la representación del tipo de célula inducidos por tensiones extrínsecas o durante el envejecimiento. Aquí, presentamos protocolos paso a paso para el aislamiento de poblaciones de células estromales de alta calidad de timo murino y humano, así como de hueso murino y médula ósea. Las celdas aisladas a través de estos protocolos son adecuadas para generar conjuntos de datos multiómicos de una sola celda de alta calidad. Aquí se analizan los impactos de la digestión de la muestra, el agotamiento del linaje hematopoyético, el análisis/clasificación FACS y cómo estos factores influyen en la compatibilidad con la secuenciación de una sola célula. Con ejemplos de perfiles FACS que indican una disociación exitosa e ineficiente y rendimientos de células estromales aguas abajo en el análisis posterior a la secuenciación, se proporcionan indicadores reconocibles para los usuarios. Tener en cuenta los requisitos específicos de las células estromales es crucial para obtener resultados reproducibles y de alta calidad que puedan avanzar en el conocimiento en el campo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el adulto sano, la producción de novo de células sanguíneas se produce en la médula ósea y el timo. Las células estromales en estos sitios son esenciales para el mantenimiento de la hematopoyesis, pero el estroma constituye menos del 1% del tejido 1,2,3,4. Por lo tanto, la obtención de aislados puros de estroma portador de hematopoyesis constituye un desafío importante, particularmente para la multiómica unicelular que requiere un procesamiento oportuno para obtener muestras de alta calidad. Los componentes de diferentes cócteles de digestión pueden interferir con ciertos pasos en el análisis multiómico 5,6. Los protocolos presentados aquí detallan el aislamiento de una amplia variedad de células estromales de la médula ósea y los tejidos tímicos.

Las perturbaciones de los constituyentes estromales tanto en la médula ósea como en el timo dan lugar a una profunda alteración en el desarrollo de las células sanguíneas y pueden dar lugar a neoplasias malignas 7,8,9. El estroma portador de la hematopoyesis se daña después del condicionamiento citotóxico y el trasplante de médula ósea, lo que resulta en una reducción de la secreción de citocinas y factores de crecimiento que sostienen las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC)2,10,11. Además, el envejecimiento afecta a las células estromales de la médula ósea y el timo, lo que probablemente contribuya al envejecimiento de los fenotipos hematopoyéticos. El timo es el primer órgano que sufre una involución extensa asociada a la edad. La grasa y el tejido fibrótico comienzan a reemplazar al estroma de soporte de las células T desde el inicio de la pubertad12,13. En la médula ósea, el contenido de adipocitos aumenta con la edad y los nichos vascular y endosteal se remodelan significativamente 14,15,16.

Para permitir el estudio del estroma de soporte de hematopoyesis en múltiples estados de estrés y en el caso del timo tanto de tejido humano como murino, hemos optimizado los protocolos de digestión publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Estos protocolos garantizan un aislamiento eficiente y reproducible de las células, y son compatibles con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y otros tipos de multiómicas.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todo el trabajo con tejido humano se llevó a cabo después de la aprobación de la Junta de Revisión Interna (IRB) del Hospital General de Massachusetts. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones C57Bl/6, de 8 a 10 semanas de edad, machos y hembras. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación del tejido tímico murino

  1. Prepare los siguientes tampones y soluciones.
    1. Medio 199 (M199) con 2% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales).
    2. Cóctel de disociación murina: 0,5 WU/mL Liberase TM y 6,3 U/mL de DNasa I en M199 + 2% FBS (ver Tabla de Materiales).
    3. M199 con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA).
      NOTA: El medio que contiene FBS se puede cambiar a BSA para mejorar la calidad del ARN.
  2. Realizar la disección del timo murino
    1. Eutanasiar al ratón por asfixia con CO2 (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) y colocarlo boca arriba. Humedece el pelaje del pecho rociando etanol al 70% y procede a abrir la cavidad torácica.
    2. Disecciona cuidadosamente el timo haciendo primero una incisión transversal justo debajo de la caja torácica con unas tijeras quirúrgicas. Corta las costillas a cada lado del ratón hasta la clavícula. A continuación, corte el diafragma para que se pueda liberar la pared torácica. Levante las costillas con un par de pinzas para exponer la cavidad torácica.
      1. El timo es un órgano blanco y bilobular, situado en la parte superior de la cavidad, justo encima del corazón. Sostenga el timo con las pinzas y corte suavemente el tejido conectivo que mantiene el timo en su lugar. Coloque el tejido tímico disecado en el pocillo de una placa de 6 pocillos con M199 + 2% de FBS en hielo.
        NOTA: Cuando se trabaja con ratones envejecidos o condicionados por radiación o cepas mutantes con defectos tímicos, el timo puede ser tan pequeño que se requiere un microscopio de disección para extirpar el órgano de manera confiable.
    3. Con un microscopio de disección, extraiga cualquier tejido extratímico con pinzas de punta roma y tijeras de microresorte.
  3. Realizar la disociación enzimática del tejido tímico murino (30 min en incrementos de 10 min)
    1. Coloque el timo limpio en la tapa de un tubo de 15 ml y pique finamente el tejido con tijeras quirúrgicas estériles.
      NOTA: Picar el tejido en la tapa del tubo que se va a utilizar para la digestión minimiza la pérdida de tejido debido a la transferencia de un recipiente a otro. Esto es muy importante cuando se trabaja con ratones envejecidos o condicionados por radiación o cepas mutantes con defectos tímicos. El pequeño tamaño del timo en estos entornos requiere la necesidad de reducir la pérdida de material siempre que sea posible.
    2. Agregue 2 mL de cóctel de disociación murina al tubo de 15 mL, coloque la tapa que contiene las piezas de timo e invierta 5 veces para asegurar que el tejido se resuspenda en el cóctel de disociación.
    3. Para evitar fugas, envuelva la tapa del tubo en una película de parafina. A continuación, coloque el tubo horizontalmente en un baño de agua a 37 °C con agitación a 250 rpm. Incubar durante 10 min.
      NOTA: El éxito del protocolo de digestión depende de que la incubación se realice a 37 °C y con agitación. El protocolo descrito se ha optimizado mediante un baño de agua agitado. Si eso no está disponible, otros enfoques que permiten la agitación en un entorno caliente podrían funcionar, pero recomendamos que el protocolo se optimice primero para estos ajustes.
    4. Coloque el tubo de 15 ml en una rejilla y deje que los trozos de tejido se asienten. Retire con cuidado el sobrenadante y páselo por un colador de células de 70 μm en un tubo de 50 ml helado.
    5. Repita los pasos 2-4 dos veces para un total de 3 rondas de digestión. El tejido debe estar más o menos completamente disociado al final de la última incubación.
    6. Añadir 20 mL de M199 + 2% de FBS a la suspensión celular recogida. Girar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
    7. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en un volumen adecuado de M199 + 2% FBS. A continuación, proceda al recuento de células.
      NOTA: El volumen de M199 + 2% FBS a resuspender dependerá del estado del timo. Para ratones de 6-10 semanas de edad, recomendamos resuspender el tejido en 3-4 mL de M199 + 2% de FBS. Sin embargo, para los experimentos en los que se utiliza tejido envejecido o condicionado por radiación o cepas mutantes con defectos tímicos, el pequeño tamaño del timo requerirá volúmenes más bajos que oscilan entre 0,1 y 1 mL.
    8. Cuente las células diluyendo la suspensión celular 1:2 en una solución de azul de tripano al 0,4% (p/v). Cargue las células en un hemocitómetro y cuente bajo un microscopio de campo claro. Cuente las células sin teñir para determinar el número de células vivas por mililitro y el número de células teñidas de azul para evaluar la viabilidad de la muestra.
  4. Realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia del estroma tímico murino
    1. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender células a una concentración de 5 x 107 células/mL en M199 + 2% FBS suplementado con 25 U/mL de inhibidor de la ARNasa Protector (ver Tabla de Materiales).
    2. Añadir bloque murino de Fc (ver Tabla de Materiales) a una concentración de 2 μg/mL e incubar durante 10 min a 4 °C.
    3. Teñir las células con los siguientes anticuerpos: CD45-PE/Cy7 (4 μg/mL), Ter119-PE (4 μg/mL), CD31-BUV737 (2 μg/mL) y EpCam-BV711 (2 μg/mL) (ver Tabla de Materiales) durante 30 min a 4 °C.
    4. Lavar las muestras en M199 + 2% BSA y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en M199 + 2% BSA que contengan un colorante de viabilidad como DAPI (0,5 μg/mL) o 7-AAD (1 μg/mL) (ver Tabla de Materiales). Proceder al aislamiento FACS de las células estromales tímicas siguiendo los protocolos establecidos19.

2. Preparación del tejido tímico humano

  1. Prepare los siguientes tampones y soluciones.
    1. Medio 199 (M199) con 2% (v/v) FBS.
    2. M199 con 1,5% (p/v) de BSA.
    3. Cóctel de disociación humana: 1 mg/ml de colagenasa IV y 2 mg/mL de dispasa y 6,3 U/mL de DNasa I en M199 +1,5% BSA (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: El último paso de la digestión en la preparación del tejido tímico humano incluye la tripsina. Por lo tanto, es esencial que todos los pasos hasta ese momento se lleven a cabo en BSA que contenga tampón, ya que FBS inhibirá la actividad de la tripsina.
  2. Realizar el aislamiento de tejido tímico humano
    1. Coloque el timo humano (recolectado siguiendo el método19 publicado anteriormente) en un volumen adecuado de M199 + 1.5% BSA y guárdelo en hielo hasta que comience el procesamiento.
    2. Al trabajar con tejido tímico humano, manéjelo como si fuera potencialmente infeccioso realizando el trabajo en una campana de cultivo de tejidos y tomando las precauciones estándar según las pautas de los CDC20.
    3. Coloque el tejido en una placa de Petri de 10 cm con 10 mL de M199 helado + 1,5% de BSA. Con pinzas y tijeras estériles, limpie cuidadosamente la grasa extratímica o el tejido que se dañó durante la extracción del órgano.
    4. Con unas tijeras quirúrgicas y un par de pinzas, corte el timo encubos de 1 cm y 3 ml y utilice el émbolo de una jeringa de 10 ml para empujar suavemente las piezas. Esto liberará algunos de los timocitos en desarrollo, reduciendo así el volumen de tejido a digerir.
      NOTA: Guarde la fracción hematopoyética liberada si es necesario un análisis posterior de las etapas de desarrollo de los timocitos. Sin embargo, no combine esta fracción con la fracción de células estromales generadas durante la digestión enzimática. Se observó que la agrupación de las dos fracciones aumenta significativamente el riesgo de formación de obstrucciones en la suspensión celular, lo que en última instancia reduce el rendimiento de las células estromalas. Pocas células estromales se pierden durante el suave aplastamiento del tejido.
  3. Realizar la disociación enzimática del tejido tímico humano (90 min en incrementos de 30 min)
    1. Transfiera aproximadamente 5 mg de los trozos de tejido tímico ligeramente triturados a la tapa de un tubo cónico de 50 ml. A continuación, corte el tejido finamente con unas tijeras quirúrgicas estériles.
    2. Pipetee 8 mL de cóctel de disociación humana en el tubo de 50 mL, coloque la tapa que contiene el tejido tímico humano picado y luego invierta suavemente el tubo 5 veces para asegurarse de que todo el tejido se mezcle con el cóctel de enzimas.
    3. Asegure la tapa del tubo con una película de parafina para evitar fugas. Incubar el tubo horizontalmente en un baño de agua agitado (250 rpm) a 37 °C durante 30 min.
    4. Coloque el tubo de 50 ml en una rejilla y deje que los trozos de tejido tímico humano se asienten antes de retirar el sobrenadante y pasarlo por un colador de células de 70 μm a un nuevo tubo de 50 ml colocado en hielo.
    5. Repita los pasos 2.3.2-1.3.4 para un total de dos rondas de digestión con el cóctel de disociación humana.
    6. Una vez finalizada la segunda ronda de digestión, agregue 8 ml adicionales del cóctel de disociación humana al tejido restante. A continuación, pipetee también 2 mL de tripsina al 0,25% en el tubo de disociación tisular. Incubar durante 30 minutos más a 37 °C, agitando a 250 rpm.
      NOTA: Es absolutamente esencial que el tiempo de digestión del tejido humano sea de al menos 90 minutos, ya que los tiempos de incubación más cortos conducen a una reducción drástica de la producción de células estromales.
    7. Una vez realizado el último paso de incubación, agrupe la suspensión celular y los fragmentos de tejido restantes con el sobrenadante recogido en los pasos anteriores pasando por un filtro de células de 70 μm. Agregue 3 mL de FBS a la muestra para romper la reacción de tripsina y colóquela en hielo.
    8. Proceda a contar las celdas como se describe en el paso 1.3.
  4. Realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia del estroma tímico humano
    1. Centrifugar la suspensión celular del timo humano y resuspender a una concentración de 5 x 107 células/mL en M199 + 2% FBS suplementado con 25 U/mL de inhibidor de la ARNasa Protectora.
    2. Incubar con Fc Block humano (5 μg/mL) (ver Tabla de Materiales) durante 10 min a 4 °C.
    3. Tiñir la muestra durante 30 min a 4 °C con CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL de muestra), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL de muestra), CD4-BV605 (5 μL/100 μL de muestra), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) y EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) (ver Tabla de materiales).
    4. Lavar las muestras en M199 + 1,5% BSA y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
    5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en M199 + BSA al 1,5% que contengan un colorante de viabilidad como DAPI (0,5 μg/mL) o 7-AAD (1 μg/mL). Proceder al aislamiento FACS de las células estromales tímicas siguiendo los protocolos establecidos19.

3. Preparación de hueso murino y tejido de médula ósea

NOTA: Las fracciones óseas y de médula ósea se preparan en dos reacciones de digestión separadas para obtener la máxima pureza de las células estromales y una disociación óptima de los tejidos. Las muestras se pueden agrupar después de los pasos de digestión para clasificarlas como un compartimento estromal.

  1. Prepare los siguientes tampones y soluciones.
    1. M199 con 2% (v/v) FBS.
    2. Cóctel de disociación Murine B&M (hueso y médula): Stemxime 2 mg/mL, Dispasa 1 mg/mL y 10 U/mL de DNasa I (ver Tabla de Materiales) en M199 +2% FBS.
      NOTA: Prepare la mezcla de disociación B&M fresca y mantenga la mezcla en hielo hasta su uso.
    3. M199 con 0,5% (p/v) de BSA.
    4. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,5% (p/v) de BSA.
    5. M199 con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de EDTA.
      NOTA: El medio que contiene FBS se puede cambiar a BSA para mejorar la calidad del ARN.
  2. Realizar la separación de la médula ósea murina
    1. Eutanasia del ratón por asfixia con CO2 (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Rocíe con etanol al 70% para humedecer el pelaje.
    2. Retire con cuidado el fémur, la tibia, la pelvis y el húmero de cada lado y colóquelos en un pocillo que contenga M199 + 2% de FBS en hielo21,22.
    3. Retire todo el músculo, ligamento y tejido cartilaginoso con toallitas de papel para minimizar el daño al hueso y preservar la capa perióstica. Colóquelos en un pozo nuevo con M199 + 2% FBS en hielo.
    4. Utiliza un bisturí y corta las placas de crecimiento de los huesos largos para eliminar la epífisis y colócala en un plato de 10 cm con M199 + 2% FBS en hielo.
    5. Enjuague la médula ósea de los huesos hasta que esté de color blanco pálido. Utilice una aguja de 28 g y una jeringa de 10 ml llena de 10 ml de M199 + 2 % de FBS para enjuagar la médula en un tubo de 15 ml con hielo. Coloque el hueso enrojecido en el plato de 10 cm con la epífisis.
      NOTA: El lavado completo de la médula ósea para la separación completa de los tejidos dará como resultado una mejor preparación de la muestra.
  3. Realizar la disociación enzimática del tejido de la médula ósea murina (30 min en incrementos de 10 min)
    1. Deje el tubo de 15 ml en posición vertical sobre hielo hasta que la médula se hunda hasta el fondo del tubo. Retire lentamente los 10 mL de M199 + 2% de FBS mediante pipeteo.
    2. Añadir 4 mL de cóctel de disociación B&M al tubo de 15 mL y colocarlo en un baño de agua a 37 °C (sin agitar) durante 10 min.
    3. Después de 5 minutos, invierta el tubo tres veces y vuelva a colocarlo en el baño de agua.
    4. Después de los primeros 10 minutos, asegúrese de que el gránulo esté en el fondo y recoja el sobrenadante mientras se filtra a través de un colador de células de 70 μm en un tubo helado de 50 ml. Agregue 2 mL de cóctel de disociación B&M fresco al pellet BM restante y vuelva a colocarlo en el baño de agua.
    5. Disocie los restos de médula ósea mediante un pipeteo vigoroso con una pipeta de 1 ml. Recoja toda la suspensión celular resultante en el mismo tubo que en los pasos anteriores. Agregue 20 mL de M199 + 0.5% BSA + 2 mM de EDTA a la suspensión celular recolectada.
      NOTA: En el paso 3.3.5, el tampón añadido después de la muestra final digerida contiene EDTA para ayudar a inhibir la actividad enzimática adicional.
  4. Realizar la depleción de células hematopoyéticas del tejido de la médula ósea murina.
    1. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender en 500 μL de PBS + 0,5% de BSA con anticuerpos de biotina (5 mg/mL) dirigidos a CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 y CD3 (ver Tabla de Materiales). Transfiera a un tubo de fondo redondo con una tapa.
    2. Incubar en un agitador orbital durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    3. Agite las perlas magnéticas a fondo y añada 25 μL de perlas magnéticas al tubo.
    4. Incubar en un agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    5. Coloque el tubo en el imán correspondiente durante 2-3 minutos y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo.
      NOTA: La médula ósea se puede agrupar o mantener separada de la fracción ósea después de este paso. Si el agotamiento del linaje tiene éxito, la suspensión celular resultante debe estar desprovista de glóbulos rojos.
  5. Realizar la disociación enzimática del tejido óseo murino.
    1. Rompe los huesos en pedazos más pequeños en el plato de 10 cm con el extremo plano de la tapa de un tubo de 50 mL. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de células de 70 μm para aislar los fragmentos óseos dentro del filtro.
      NOTA: Alternativamente, se puede usar un mortero para la fragmentación ósea. Esta opción, sin embargo, tiende a generar más residuos y a reducir la viabilidad de las células estromales cuando el hueso está molido en lugar de romperse. Las células del estroma todavía están adheridas al hueso y dentro de él, y el sobrenadante que contiene células hematopoyéticas debe desecharse.
    2. Use unas tijeras para cortar los fragmentos de hueso en el filtro de células. Esto aumentará el área de superficie para una disociación enzimática más eficiente. Lavar el hueso con 5 mL de M199 + 2% FBS.
    3. Coloque la fracción ósea en 5 mL de mezcla murina de disociación B&M (ver Tabla de Materiales) en un tubo nuevo de 50 mL.
    4. Para evitar fugas, envuelva la tapa del tubo en una película de parafina. A continuación, coloque el tubo horizontalmente en un baño de agua a 37 °C con agitación a 120 rpm durante 30 min.
    5. Después de la digestión, añadir 25 mL de M199 + 0,5% BSA + 2 mM de EDTA y filtrar el sobrenadante que contiene las células estromales a través de un colador de células de 70 μm en un tubo helado de 50 ml.
      NOTA: Compruebe que los fragmentos óseos resultantes han disminuido visiblemente por la digestión. En el paso 3.5.5, el tampón añadido después de la muestra final digerida contiene EDTA para ayudar a inhibir la actividad enzimática adicional.
  6. Realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia del hueso murino y el estroma de la médula ósea.
    1. Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Resuspender en bloque Fc murino a una concentración de 10 μg/mL en PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e incubar durante 10 min a 4 °C.
    3. Teñir las células (hasta 10 millones de células/100 μL de volumen total de tinción) con los siguientes anticuerpos: CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL), CD31-BV421 (0,66 μg/mL), CD140a-APC (2 μg/mL), Sca1-AF700 (0,66 μg/mL), CD51-PE (2 μg/mL), CD105-PE/dazzle (2 μg/mL) (ver Tabla de materiales).
    4. Deje que Calcein-AM se equilibre a temperatura ambiente y vuelva a suspender en 50 μL de DMSO. Prepárese fresco para cada uso. Mantener a temperatura ambiente después de la resuspensión. Diluir previamente la calceína en PBS (0,1 mg/mL) antes de añadirla a la muestra (20 μg/mL) ya resuspendida en el cóctel de tinción de anticuerpos e incubar durante 20-30 min a 4 °C en la oscuridad.
    5. Lavar las muestras en PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
    6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Proceder al aislamiento FACS de las células estromales óseas y de médula ósea siguiendo los protocolos establecidos19.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estos protocolos producen variedades de células estromales reproducibles del timo y la médula ósea adecuadas para el análisis de citometría de flujo, así como multiómicas de una sola célula, como la secuenciación de SCRNA. El tejido tímico murino experimenta una remodelación significativa en respuesta a factores estresantes, como el condicionamiento citotóxico que precede al trasplante de médula ósea o el proceso natural de envejecimiento. Como consecuencia, la celularidad tímica se reduce drásticamente en ambos entornos (Figura 1A). Mientras que un timo de un ratón salvaje de 8 semanas de edad contiene aproximadamente 100 millones de células, se puede esperar que la celularidad de un ratón de 2 años sea la mitad de eso, y un timo 4 días después de la irradiación y el trasplante de médula ósea puede ser tan bajo como 5.00.000 células (Figura 1A).

El condicionamiento citotóxico ablacionará preferentemente las células hematopoyéticas, por lo que el compartimento estromal se enriquecerá proporcionalmente (Figura 1B). Sin embargo, la baja celularidad general hará que el aislamiento de un número suficiente de células estromales tímicas sea un desafío. Por lo tanto, puede ser necesario agrupar animales para obtener números de celda compatibles con las aplicaciones multiómicas posteriores y minimizar la pérdida de material siempre que sea posible. Para realizar multiómicas en células estromales tímicas, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células vivas, únicas, CD45-Ter119- (Figura 1C) garantizará que se pueda clasificar un número suficiente de células de la mayoría de las condiciones de estrés.

Para preservar la heterogeneidad del compartimento del estroma, normalmente no clasificamos un solo marcador positivo del estroma, sino que seleccionamos las células hematopoyéticas. Todavía se recomienda incluir marcadores de células estromales positivos para el análisis para garantizar que se haya logrado una disociación tisular adecuada. Sin embargo, el aislamiento de FACS es imperfecto y, según lo determinado por scRNAseq, entre el 30% y el 50% de las células clasificadas serán de origen hematopoyético (Figura 1D, E). Esto se puede mejorar mediante el agotamiento magnético de las células CD45+ antes de FACS; sin embargo, esto no se recomienda para condiciones de celularidad tímica reducida (Figura 1A), ya que la pérdida de material que viene con el procesamiento adicional involucrado en el agotamiento magnético da como resultado rendimientos del estroma demasiado bajos para aplicaciones posteriores.

Para el aislamiento del estroma tímico humano, el paso más crítico es la digestión enzimática. Si se apresura la etapa de disociación, el rendimiento general de células estromalas, así como la representación del subtipo de células estromalas, disminuirá gravemente (Figura 2A). También se recomienda incluir siempre los marcadores de endotelio tímico y epitelio para asegurar que la digestión de los tejidos ha sido óptima, ya que la simple obtención de marcadores hematopoyéticos negativos no será suficiente para medir la liberación real de células estromales. Esto se ejemplifica en la Figura 2A, donde el porcentaje de células negativas para marcadores hematopoyéticos es mayor en la muestra digerida durante 30 min en comparación con la muestra incubada durante 90 min. Sin embargo, como se observa en la puerta consecutiva, el rendimiento de las células endoteliales y epiteliales es muy pobre en el protocolo de digestión más corto (Figura 2A).

Para el aislamiento de FACS de células estromales tímicas humanas para aplicaciones multiómicas, se sugiere la tinción con un cóctel de anticuerpos de linaje hematopoyético, así como anticuerpos CD4 y CD8, además del marcador panhematopoyético CD45 y el marcador eritroide CD235a (Figura 2B) para mejorar el enriquecimiento de células estromales. Por lo tanto, para el análisis multiómico humano del estroma tímico, las células vivas, únicas, CD45-CD235a-Linaje-CD4-CD8- deben clasificarse por FACS (Figura 2B). Como se ha visto para scRNAseq de muestras murinas, esto todavía resulta en la contaminación del 30%-50% de las células hematopoyéticas, pero esto aún proporciona una resolución aceptable del compartimento del estroma del timo humano (Figura 2C, D).

Para el estroma óseo y BM se utilizó la misma estrategia que para el tejido tímico; Las células estromales se aíslan mediante compuerta en células negativas para marcadores hematopoyéticos, y se incluyen otros marcadores de células estromales como controles de digestión (Figura 3). La disociación del tejido calcificado como el hueso da lugar a una acumulación significativa de residuos. La adición de calceína como colorante de viabilidad permitirá la exclusión de la mayoría de estos desechos, que de otro modo inflarían falsamente los números clasificados y disminuirían las frecuencias de la población cerrada (Figura 3). Esto se ejemplifica en los gráficos FACS que comparan la compuerta en todas las celdas y solo la compuerta en Calcein+ (Figura 3). Como se ha visto para las células estromales tímicas humanas, el porcentaje de células con marcadores hematopoyéticos negativos no es una lectura fiable de la eficiencia de la disociación ósea y del tejido BM (Figura 3). Si bien la puerta CD45-Ter119- puede contener una gran cantidad de células en una muestra en la que falló el paso de digestión, un análisis más detallado de los marcadores típicos de células óseas y estromales óseas CD31, CD140a y CD51 demuestran claramente una liberación deficiente del estroma (Figura 3 y Figura 4).

Para el aislamiento de FACS de células óseas murinas y estromales BM, se sugiere el uso de la estrategia de compuerta como se muestra en la Figura 3, donde solo clasificamos CD45-Ter119-Calceína+, pero monitoreamos las propiedades de dispersión frontal y lateral y la expresión de marcadores de células estromales de la población clasificada para garantizar una digestión óptima (Figura 3A). La combinación de la depleción de células magnéticas de la médula ósea con linaje hematopoyético positivo antes de FACS y la clasificación en las puertas mostradas da como resultado la secuenciación de células individuales con un estroma del >90%. Un ejemplo de este tipo de ejecución de secuenciación de scRNA (Figura 5A,B) ilustra esta baja contaminación hematopoyética después de la anotación basada en el transcriptoma de las células analizadas (ejemplos de genes marcadores hematopoyéticos, Figura 5C). Esto contrasta marcadamente con las preparaciones del estroma tímico en las que no se realizó el agotamiento magnético de las células antes de la etapa de clasificación debido al limitado material de partida en el tejido tímico posterior al trasplante (Figura 1F).

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Figura 1: Análisis de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular del estroma tímico murino. (A) Cuantificación del número de timocitos en ratones de 8 semanas de edad (Control), ratones de 8 semanas de edad irradiados letalmente y trasplantados 4 días antes (trasplante) y ratones de 2 años (Aged ). (B) Gráficos representativos de citometría de flujo que demuestren el enriquecimiento en subtipos de células estromales 4 días después de la irradiación letal y el trasplante. (C) Estrategia de compuerta por citometría de flujo para clasificar el estroma tímico murino para el análisis multiómico de una sola célula. (D) UMAP del timo murino que indica estroma (azul) y células hematopoyéticas (rojo). (E) UMAPs que muestran genes marcadores hematopoyéticos murinos en muestras de timo. (F) Cuantificación de células estromales y hematopoyéticas murinas en muestras de scRNAseq de timo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Análisis de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular del estroma tímico humano. (A) Gráficos FACS que muestran resultados representativos del impacto de diferentes tiempos de digestión en la liberación de poblaciones de células del estroma tímico humano. (B) Estrategia de activación por citometría de flujo para clasificar el estroma tímico humano para el análisis multiómico de una sola célula. (C) UMAP de timo humano que indica estroma (azul) y células hematopoyéticas (rojo). (D) UMAPs que muestran genes marcadores hematopoyéticos humanos en muestras de timo. (E) Cuantificación de células estromales y hematopoyéticas humanas en muestras de scRNAseq de timo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Los marcadores estromales de médula ósea murina y la calceína son útiles para estimar la eficiencia de la disociación. (A) Análisis representativo de citometría de flujo de células estromales de médula ósea murina CD45-Ter119 controladas en todas las células y células Calceína+. Con la posterior activación de CD31- que muestra una mayor proporción de células CD140a+CD51+ al seleccionar las células Calceína+. (B) Análisis de citometría de flujo representativo de una digestión ósea fallida con células CD140a+CD51+ faltantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Estrategia de activación del estroma de la médula ósea. (A) Estrategia de activación por citometría de flujo para clasificar el estroma de la médula ósea murina para multiómicas unicelulares. (B) Análisis de citometría de flujo representativo de una digestión fallida de la médula ósea con células CD140a+CD51+ faltantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Secuenciación de ARN unicelular de médula ósea con composición de células estromales y hematopoyéticas. (A) UMAP de hueso murino y médula ósea que indica estroma (azul) y células hematopoyéticas (rojo). (B) Cuantificación de células estromales y hematopoyéticas en muestras de hueso murino y médula ósea. (C) UMAP de genes marcadores hematopoyéticos en muestras de médula ósea murina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Las células estromales de los órganos hematopoyéticos son fundamentales para la producción normal de sangre y las perturbaciones del estroma hematopoyético pueden dar lugar a graves deficiencias en el mantenimiento hematopoyético y en la respuesta al estrés 9,23,24. El conocimiento de las células estromales hematopoyéticas es esencial para la comprensión de las enfermedades hematológicas 7,9,10,24 y para la capacidad de desarrollar terapias para combatirlas25,26. Sin embargo, separar de forma reproducible el estroma hematopoyético del parénquima es un reto, especialmente con la llegada de la multiómica unicelular que requiere preparaciones de muestras de alta calidad al tiempo que maximiza el rendimiento y la variedad de las células estromales. Los protocolos descritos aquí se han optimizado para ser compatibles con la mayoría de las aplicaciones multiómicas posteriores, al tiempo que se enfrentan a los desafíos de aislar células estromales hematopoyéticas 1,2,19.

La primera cuestión a tener en cuenta para el aislamiento de las células estromales hematopoyéticas son las condiciones de disociación. La disociación óptima es fundamental para liberar las células del estroma del tejido y reflejar la heterogeneidad completa del compartimento del estroma 1,2. La elección de la mezcla de disociación correcta depende del alcance experimental y de los protocolos posteriores. Recomendamos preparar las mezclas de disociación lo más frescas posible y mantenerlas en hielo hasta su uso. Algunos componentes son difíciles de disolver, como la dispasa, y pueden requerir más tiempo para la mezcla de la pipeta. No se recomienda el vórtice, ya que puede alterar la conformación nativa de las enzimas de la digestión, lo que en última instancia conduce a su inactivación. Es importante destacar que el EDTA inhibirá la actividad enzimática y debe evitarse durante los pasos de digestión activa, pero puede emplearse para detener la reacción si el tampón que contiene la enzima no se puede eliminar rápidamente. Además de la mezcla de enzimas en sí, dos puntos son críticos para una disociación eficiente del tejido, (1) trituración y corte minuciosos para aumentar el área de superficie y, (2) tiempo de incubación suficiente con las enzimas de digestión. El tejido tímico humano es, por ejemplo, significativamente más difícil de disociar que el tejido murino y, por lo tanto, los tiempos de digestión deben ser más largos. Si no se realiza un ajuste para el tejido humano, el rendimiento estromal y la variedad celular disminuirán (Figura 2A). Las enzimas de disociación requieren una temperatura óptima de 37 °C, lo que inevitablemente influye en la expresión génica27. Aunque la disociación en frío o a temperaturas más bajas sería deseable para conservar los estados celulares, actualmente no existen comercialmente combinaciones de enzimas de disociación activas en frío adecuadas para el hueso y la médula ósea. Para cualquier tejido que requiera digestión, la heterogeneidad y el porcentaje de contribución adquirido de los diferentes tipos de células cambiarán invariablemente con el tiempo de digestión, la composición del cóctel de enzimas y el procesamiento. Aguas abajo de estos pasos iniciales, la heterogeneidad y la representación se limitarán aún más por los pasos de filtración, como el tamaño de las boquillas durante la clasificación y la captura de tipos de células difíciles (por ejemplo, adipocitos del estroma) y los diámetros de los canales de los dispositivos fluídicos. Por lo tanto, al comparar conjuntos de datos, debemos tener en cuenta que estas diferencias en los protocolos pueden afectar la representación de las subpoblaciones. De ello se deduce lógicamente que debemos estar atentos a mantener los mismos pasos de procesamiento al medir el impacto de las perturbaciones en los sistemas estromales.

Si bien el costo de la secuenciación ha disminuido y está disminuyendo, las tecnologías de células individuales a menudo están limitadas por el número de células que se pueden analizar. Para optimizar la capacidad de cada kit de reactivos, se empleó la depleción magnética de células hematopoyéticas siempre que fue posible. Esto permite evitar un gran número de células contaminantes, que son mucho más numerosas que el estroma, tanto en la médula ósea como en las fracciones de muestras tímicas. Sin embargo, si el material de partida es limitado, como en el caso del tejido tímico post-trasplante, el aumento de la pérdida inespecífica de células en el que invariablemente incurren las estrategias de depleción magnética puede hacer que esto no sea aconsejable. Además, durante la preparación y digestión de los tejidos, la trituración, el corte y la liberación enzimática de los componentes de la matriz extracelular generan una gran cantidad de residuos. Este tipo de contaminante, si se deja en la muestra para su análisis, puede causar problemas de obstrucción en el procesamiento posterior, causar pozos negativos para la clasificación de índice de celda única e inflar mucho los porcentajes de la puerta principal en el análisis. La tinción con calceína se utilizó para dar positivo a las células/células vivas. La calceína viene en diferentes colores, lo que la hace altamente adaptable a su matriz de tinción. Cuando trabaje con calceína, tenga cuidado de no someter el tinte a ciclos repetidos de congelación y descongelación (es decir, siempre prepárelo fresco y manténgalo a temperatura ambiente después de disolverlo).

La capacidad de multiplexar muestras basadas en anticuerpos codificados con códigos de barras con oligonucleótidos de ADN28 permite una mayor utilidad de las reacciones de secuenciación de células individuales en plataformas como 10x Genomics. Los anticuerpos hashtagping diseñados para la multiplexación de muestras vienen con diferentes objetivos para las moléculas de la superficie celular o la membrana nuclear y especificidad tanto para ratones como para humanos. Si bien el sistema de hashtags celulares se ha utilizado con éxito para múltiples tejidos, los experimentos que combinan mezclas de enzimas de digestión con el uso posterior de hashtags pueden conducir a una recuperación drásticamente reducida. Hemos intentado incluir pasos de lavado adicionales después de la disociación y agregar EDTA para inhibir la actividad de las enzimas de la digestión. Sin embargo, incluso con estos pasos, se espera una menor identificación de hashtags que las células hematopoyéticas. Se descubrió que con los protocolos de digestión enzimática, las tasas de captura de hashtags estaban entre el 30% y el 70%. Esto ocurre a pesar de que el mismo clon de anticuerpo con un conjugado de fluorocromo marcó >90% de las células estromales de la misma población. Cualquier diseño experimental que combine la digestión enzimática del tejido con el hashtagging debe ser pilotado y se debe tener precaución para garantizar la inhibición enzimática.

Divulgaciones

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D.T.S. es director y accionista de Agios Therapeutics y Editas Medicines; fundador, director, accionista y miembro del consejo asesor científico de Magenta Therapeutics y LifeVault Bio, accionista y fundador de Fate Therapeutics y Garuda Therapeutics, y director, fundador y accionista de Clear Creek Bio, consultor de FOG Pharma, Inzen Therapeutics y VCanBio, y receptor de fondos de investigación patrocinados por Sumitomo Dianippon. D.T.S y K.G son inventores de US20220143099A1 patentes.

Agradecimientos

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Contamos con el apoyo de la asistencia técnica experta del centro de citometría de flujo HSCI-CRM del Hospital General de Massachusetts y del centro Bauer Core de la Universidad de Harvard. T.K y K.G contaron con el apoyo del Consejo Sueco de Investigación y C.M. de la Fundación Alemana de Investigación. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee por su ayuda en el análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25% Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomicina D)BD Biosciences559925
Cóctel de Linaje Anti-Humano 3-FITCBD Biosciences643510
Albúmina sérica bovinaMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 ratonesJackson664Machos o hembras, 8-12 semanas de edad
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Coladores de células estériles, blanco, tamaño de malla: 70 µ mFisher Scientific08-771-2
Dispasa IIThermo Fisher Scientific17105041
Solución Dnase IThermo Fisher Scientific90083  2500 U/mL
Estreptavidina de ratón Easysep RapidSpheres Kit de aislamientoStemCell Technologies19860
Suero fetal bovinoGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma 5401127001grado de investigación
Medio 199Gibco12350
Ratón antihumano CD235a-BV77BD Biosciences740785
Ratón antihumano CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Ratón antihumano CD45-BV77Biolegend304050
Ratón antihumano CD4-BV605BD Biosciences562658
Ratón antihumano CD66b-FITCBD Biosciences555724
Ratón antihumano CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Ratón antihumano EpCam-BV421Biolegend324220
Protector Inhibidor de ARNasaMillipore Sigma3335402001
Rata anti-ratón CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rata anti-ratón CD11b-BiotinaBiolegend101204
Rata anti-ratón CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rata Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rata anti-ratón CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rata anti-ratón CD31-BV421Biolegend102424
Rata anti-ratón CD3-BiotinaBiolegend100244
Rata anti-ratón CD45.2-BiotinaBiolegend109804
Rata anti-ratón CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rata anti-ratón CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rata anti-ratón CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rata anti-ratón CD45R/B220-BiotinaBiolegend103204
Rata anti-ratón CD51-PEBiolegend104106
Rata anti-ratón EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rata anti-ratón Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rata anti-ratón Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinaBiolegend108404
Rata anti-ratón Ter119-BiotinaBiolegend116204
Rata anti-ratón Ter119-PEBiolegend116208
Rata anti-ratón Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme LS004107Bioquímica de Worthington

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

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