Un flujo de trabajo semiautomatizado para la criopreservación de esperma de coral para apoyar los biobancos y la acuicultura

Summary

Este protocolo describe una vía semiautomatizada para mejorar la eficiencia y la capacidad de procesamiento y criopreservación de esperma de especies de coral amenazadas, con el objetivo de asegurar la diversidad genética y apoyar los esfuerzos de restauración de los arrecifes.

Abstract

Los arrecifes de coral se enfrentan a una crisis a medida que aumenta la frecuencia de los eventos de blanqueamiento causados por el calentamiento de los océanos, lo que resulta en la muerte de los corales en los arrecifes de todo el mundo. La consiguiente pérdida de diversidad genética y biodiversidad puede disminuir la capacidad de los corales para adaptarse al cambio climático, por lo que los esfuerzos para preservar la diversidad existente son esenciales para maximizar los recursos disponibles para la restauración de los arrecifes ahora y en el futuro. El enfoque más eficaz para asegurar la genética a largo plazo es la criopreservación y el biobanco, que permiten el almacenamiento congelado de muestras vivas a temperaturas criogénicas en nitrógeno líquido de forma indefinida. La criopreservación de esperma de coral ha sido posible desde 2012, pero la naturaleza estacional de la reproducción de los corales significa que las actividades de los biobancos se restringen a unas pocas noches al año cuando se produce el desove. Por lo tanto, es esencial mejorar la eficiencia del procesamiento de esperma de coral y los flujos de trabajo de criopreservación para maximizar estas limitadas oportunidades de biobancos. Con este fin, nos propusimos optimizar las vías de procesamiento de criopreservación para el esperma de coral basándonos en las tecnologías existentes y creando un enfoque semiautomatizado para agilizar la evaluación, el manejo y la criopreservación del esperma de coral. El proceso, que combina el análisis de esperma asistido por ordenador, crioviales con códigos de barras y una serie de hojas de datos automáticas conectadas para la edición simultánea por parte de varios usuarios, mejora la eficiencia tanto del procesamiento de muestras como de la gestión de metadatos en el campo. A través de la integración con programas de investigación transversales como el Programa de Restauración y Adaptación de Arrecifes en Australia, la criopreservación puede desempeñar un papel crucial en los programas de restauración de arrecifes a gran escala al facilitar el manejo genético de las poblaciones acuícolas, apoyar la investigación para mejorar la tolerancia térmica y prevenir la extinción de las especies de coral. Los procedimientos descritos se utilizarán para los profesionales de la criopreservación y los biobancos de corales en arrecifes de todo el mundo y proporcionarán un modelo para la transición de las tecnologías de criopreservación de los laboratorios de investigación a las aplicaciones a gran escala.

Introduction

Los arrecifes de coral a nivel mundial están experimentando una pérdida de especies, poblaciones y diversidad genética de corales debido al calentamiento de los océanos y la acidificación causada por el cambio climático, disminuyendo la viabilidad de estos hábitats críticos e impactando a las especies que sustentan ^1,2. El enfoque más eficaz para asegurar la genética a largo plazo es la criopreservación y el biobanco, que permiten el almacenamiento congelado de muestras vivas a temperaturas criogénicas en nitrógeno líquido de forma indefinida³. El desarrollo en 2012 de métodos para la criopreservación de esperma de coral⁴ permitió el biobanco de genética de estas especies por primera vez y condujo al desarrollo del primer biorepositorio de genética de corales en 2012⁵. Desde entonces, este protocolo de criopreservación se ha perfeccionado^{aún más 6} y se ha utilizado para asegurar la genética de más de 50 especies de coral en todo el mundo, de las cuales 30 provienen de la Gran Barrera de Coral en Australia⁷. El esperma de coral criopreservado puede generar corales sanos que se desarrollan normalmente y se han utilizado para facilitar experimentos de flujo genético asistido en Australia⁸ y el Caribe⁹. Si bien actualmente se están desarrollando tecnologías que permiten la criopreservación de tipos de tejidos complejos, como larvas¹⁰ y tejidos de corales adultos^11,12, la criopreservación de esperma de coral es actualmente la herramienta más establecida disponible para el biobanco de rutina de genética de corales.

A medida que los impactos en las poblaciones de coral han aumentado, varios países han iniciado programas a gran escala para apoyar la restauración y adaptación de los arrecifes (por ejemplo, el Programa de Restauración y Adaptación de Arrecifes [RRAP] en Australia¹³) o para asegurar las poblaciones de coral en peligro restantes (por ejemplo, Florida Coral Rescue en los EE.UU.¹⁴). En el contexto de estos programas, la criopreservación puede considerarse como una tecnología facilitadora, que apoya la investigación y la producción de corales a gran escala, además de asegurar la diversidad genética existente y prevenir extinciones. La criopreservación de espermatozoides puede permitir un mayor control sobre la reproducción entre poblaciones que están separadas física o temporalmente y puede permitir el manejo genético de los reproductores para seleccionar rasgos deseables como la tolerancia térmica o la resistencia a enfermedades⁸. Hasta la fecha, los biobancos de esperma de coral se han llevado a cabo a una escala relativamente pequeña en apoyo de la gestión de la biodiversidad⁷, por lo que se requerirá cierto nivel de ampliación para que dicho biobanco alcance su potencial dentro de estos programas de restauración de arrecifes más grandes. Al igual que con todos los esfuerzos de restauración de arrecifes basados en la reproducción de corales, el principal impedimento para aumentar los esfuerzos de biobancos es el período limitado durante el cual los gametos de coral están disponibles, ya que el desove en la mayoría de las especies constructoras de arrecifes coincide con la luna llena a fines de la primavera y principios del verano¹⁵, lo que significa que los gametos solo están disponibles para la criopreservación y el biobanco unas pocas noches al año. Además, en las regiones donde se produce el desove en masa, por ejemplo, la Gran Barrera de Coral, suele haber varias especies que desovan simultáneamente o con pocas horas de diferencia entre sí en la misma noche¹⁵. Por lo tanto, se requieren mejoras en la vía de criopreservación de espermatozoides para aumentar la escala y la eficiencia del procesamiento para maximizar la capacidad del biobanco durante estas breves ventanas anuales de desove, al tiempo que se garantiza la integridad de las muestras y los metadatos asociados.

La criopreservación y el biobanco de esperma de coral implican varios pasos clave, desde la recolección de gametos durante el desove hasta la incorporación de muestras al biorepositorio y a la base de datos (Figura 1). El proceso comienza con la separación de los espermatozoides de los óvulos (en las especies hermafroditas) o la recolección de los espermatozoides de la columna de agua (en las especies gonocóricas), seguida de la evaluación de la motilidad y concentración de los espermatozoides. A continuación, los espermatozoides se combinan con crioprotector (concentración final del 10% v/v, dimetilsulfóxido, DMSO) en agua de mar filtrada (FSW) y se enfrían a -20 °C/min en un dispositivo de enfriamiento diseñado a medida⁴. Las primeras iteraciones de este proceso se basaron en la evaluación visual de la motilidad y concentración de los espermatozoides a través de microscopía de contraste de fase y recuentos de hemocitómetros, la impresión y el etiquetado de tubos a medida que las muestras se procesaban para la criopreservación, el pipeteo manual de muestras de esperma en crioviales y el enfriamiento en un rack flotante especialmente diseñado¹⁶. La aplicación del análisis de esperma asistido por ordenador (CASA)¹⁷ y el desarrollo de^{un dispositivo de} enfriamiento impreso en 3D6 han mejorado la eficiencia y la fiabilidad de la criopreservación de esperma de coral, pero la vía de procesamiento de muestras de esperma se ha mantenido prácticamente igual desde su creación. Si bien este enfoque es adecuado para procesar muestras de un número moderado de colonias y especies en una noche de desove, para grandes volúmenes y números de colonias (por ejemplo, muestras individuales de >10 colonias a la vez), existen cuellos de botella en la vía de criopreservación que impiden el procesamiento de las muestras de manera oportuna (es decir, dentro de las 2 horas posteriores a la liberación de espermatozoides) sin degradación del potencial de fertilidad de la muestra. Aunque existen sistemas de manejo de fluidos a gran escala para crioviales (por ejemplo, Thomas et ^al.18), generalmente están diseñados para el procesamiento de lotes grandes (es decir, múltiples bastidores de crioviales) y no son adecuados para el transporte y uso en el campo, por lo que no son rentables para esta aplicación. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo mejorar la eficiencia de la criopreservación de esperma de coral mediante la introducción de equipos y métodos de automatización portátiles y económicos en pasos clave de la vía de procesamiento para maximizar el número de muestras que podrían criopreservarse de manera efectiva en una noche de desove.

Protocol

Los métodos descritos en este documento se pueden utilizar para procesar y criopreservar esperma de especies de coral hermafroditas y gonocóricas. Una introducción general y un manual sobre el desove de corales y la recolección de gametos para la criopreservación de esperma para ambos modos reproductivos se pueden encontrar en el Curso de Capacitación en Criopreservación de Corales¹⁹ del Instituto Nacional de Biología de la Conservación y el Zoológico Nacional del Smithsonian. Los métodos descritos se desarrollaron principalmente utilizando gametos de colonias de Acropora millepora recolectados en el grupo de islas Keppel en Woppaburra Sea Country y en Davies Reef en Bindal Sea Country, en la Gran Barrera de Coral en Australia. Toda la recolección y utilización de corales y gametos se llevó a cabo con el consentimiento libre, previo e informado de los Custodios Tradicionales de los Países del Mar pertinentes. Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Pre-desove: controles del sistema y preparación de la solución de activación de espermatozoides y criodiluyente

1. Confirme que el escáner de código de barras esté cargado, activo y configurado para ingresar datos de hoja de cálculo como entrada de celda horizontal. Consulte el manual del usuario del lector de códigos de barras para personalizar esta configuración.
2. Prepare soluciones madre concentradas de activación de esperma de coral para CASA.
   NOTA: Se deben usar guantes desechables cuando se manipulan productos químicos para la preparación de la solución de activación.
   1. Preparar una solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) al 30% (5 mL) disolviendo 1,5 g de BSA en 4 mL de agua estéril purificada para cultivo de tejidos con la ayuda de un calentador de tubos ajustado a 37 °C o sujetando el tubo con las manos ahuecadas, agitando periódicamente y suavemente (no agitar el vial).
   2. Una vez en solución, enrasar hasta el volumen final (5 mL) con agua de cultivo de tejidos, etiquetar el tubo con la fecha y marcar "30% BSA en H₂O".
   3. Conservar en el frigorífico (4 °C) durante un máximo de 2 semanas.
   4. Prepare 60 mM de solución madre de cafeína (25 mL) disolviendo 0,2913 g de cafeína en 24 mL de agua de mar filtrada (FSW).
   5. Una vez en solución, enrasar hasta el volumen final (25 mL) con FSW, etiquetar el tubo con la fecha y marcar "60 mM de cafeína en FSW".
   6. Almacene en el refrigerador hasta por 1 mes.
      NOTA: La solubilidad máxima de la cafeína en FSW es de aproximadamente 71 mM.
3. Prepare la solución de trabajo de activación de espermatozoides para muestras de esperma a ~ 10⁹ espermatozoides / mL (0.9% BSA + 12 mM de cafeína en FSW).
   1. Para 10 mL de solución de trabajo, combine 2,0 mL de 60 mM de solución madre de cafeína + 0,3 mL de solución madre BSA al 30% + 7,7 mL de FSW.
   2. Etiquete el tubo con la fecha y "solución de trabajo de activación de espermatozoides - 0,9% BSA + 12 mM de cafeína".
   3. Prepárese cada día de uso, almacene a temperatura ambiente (19-30 °C) y deseche la solución no utilizada al final del día.
4. Preparar soluciones crioprotectoras (criodiluyentes). Asegúrese de usar guantes desechables cuando manipule el DMSO crioprotector.
   NOTA: FSW se prepara con diferentes concentraciones de crioprotector en función de la concentración inicial de espermatozoides dentro de una muestra y la concentración final deseada de espermatozoides de alícuotas criopreservadas. Al preparar el criodiluyente, asegúrese de que FSW esté alícuota en el tubo de 50 mL antes de la adición de DMSO.
   1. Recoja agua de mar cruda del sistema de tanques en el que se mantienen los corales antes del desove (~ 35 ppt de salinidad).
   2. Filtre el agua de mar cruda utilizando un sistema de filtración en la parte superior de una botella conectado a una bomba de vacío con un filtro de membrana no pirogénico de 0,2 μm instalado.
   3. Para una concentración de espermatozoides ≥2 × 10⁹ espermatozoides/mL, prepare DMSO al 20% en FSW combinando 10 mL de DMSO + 40 mL de FSW en un tubo de 50 mL.
   4. Para una concentración de espermatozoides <2 × 10⁹ espermatozoides/mL, prepare DMSO al 30% en FSW combinando 15 mL de DMSO + 35 mL de FSW en un tubo de 50 mL.
   5. Etiquete el tubo con la fecha y la concentración de DMSO, es decir, 30% de DMSO o 20% de DMSO.
   6. Prepárese cada día de uso, almacene a temperatura ambiente (19-30 °C) y deseche la solución no utilizada al final de cada día.
      NOTA: La mezcla de DMSO y FSW crea una reacción exotérmica, y el criodiluyente debe prepararse mucho antes de su uso para permitir que se enfríe a temperatura ambiente. FSW se puede almacenar a 4 °C para la preparación del criodiluyente para contrarrestar esta generación de calor.
5. Prepare el registrador de datos de termopar.
   1. Para medir la velocidad de enfriamiento aproximada de cada ciclo de criopreservación, coloque un criovial que contenga un 10% de DMSO en FSW con una sonda de termopar insertada a través de la tapa en una ranura de muestra del estante de criopreservación junto a las muestras de esperma.
   2. Para hacer un vial de termopar, pinche o derrita un pequeño agujero en la tapa del criovial con código de barras e inserte un termopar tipo K o tipo T a través de la abertura. Empuje la punta de la sonda del termopar hacia abajo hasta un nivel tal que se asiente en el centro de la muestra cuando se llene el vial, manteniendo la punta de la sonda centrada en el vial para evitar el contacto con la pared interior del vial. Selle la tapa y sostenga la sonda del termopar en su lugar con pegamento caliente.
   3. Con guantes desechables, llene el criovial con código de barras con un volumen de 10% de DMSO en FSW igual al volumen de la muestra de esperma que se va a criopreservar.
   4. Prepare DMSO fresco al 10% en FSW y rellene los viales de termopar a diario.

2. Preparación y evaluación de espermatozoides

1. En el caso de las especies hermafroditas (por ejemplo, las especies de Acropora ), recoja los haces de gametos de la superficie del agua con una pipeta de transferencia de 3 mL y colóquelos en un tubo marcado de 50 mL en una proporción de 5 mL de haces de gametos sobre 5 mL de agua de mar (10 mL de volumen total).
2. En el caso de las especies gonocóricas, recoja los espermatozoides cerca de la boca del pólipo con una pipeta de transferencia de 3 ml y coloque la muestra en un tubo de 50 ml etiquetado, luego proceda directamente al paso 2.8.
   NOTA: Los guantes desechables no son necesarios para la recolección y manipulación de muestras de gametos, pero se pueden usar si se prefiere. Las manos deben lavarse bien con agua dulce o cambiarse los guantes entre cada muestra de gameto para evitar la contaminación cruzada.
3. Para las especies hermafroditas, agite los haces de espermatozoides y óvulos agitando suavemente la muestra con la mano hasta que los paquetes se hayan roto.
   NOTA: Algunas especies de Montipora tienen una toxina en los óvulos, por lo que se debe permitir que se deshagan lentamente con una agitación mínima para evitar dañar los espermatozoides.
4. Deje reposar la muestra durante 2 minutos en una rejilla de tubos para permitir que los óvulos floten hacia la superficie y los espermatozoides se asienten (los huevos formarán una capa rosada/marrón en la superficie y los huevos individuales serán visibles; véase la Figura 1i).
5. Para separar los espermatozoides y eliminar los óvulos contaminantes, aspire suavemente los espermatozoides desde el fondo del tubo con una pipeta de transferencia limpia de 3 ml.
6. Transfiera la muestra de esperma a un colador de células de 100 μm colocado encima de un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 mL. La muestra debe fluir fácilmente a través del filtro. Golpee el filtro para estimular el flujo de la muestra y, si es necesario, se puede usar una pipeta de transferencia limpia para recolectar cualquier muestra residual de la parte inferior del filtro. Retire el filtro, luego tape el tubo sin apretar para permitir el intercambio de aire.
7. Etiquete la muestra de esperma filtrada con el ID de colonia y mueva la muestra a la estación de trabajo de evaluación de espermatozoides.
8. Abra el archivo de la hoja de datos automático del biobanco de corales (Archivo complementario 1). En la pestaña de evaluación de espermatozoides, ingrese los metadatos de la colonia de coral (columnas A-H).
9. Prepare los espermatozoides para la evaluación de CASA.
   1. Mezcle bien la muestra de esperma y retire una alícuota de 10 μL a un tubo de microcentrífuga vacío de 1,8 mL.
   2. Agregue inmediatamente 0,390 mL de solución de trabajo de activación de espermatozoides gota a gota durante 10-20 s, mezclando suavemente los espermatozoides en la solución. Esto da una relación de dilución de 1:39 (espermatozoides: solución, v/v) (o factor de dilución de 40), que proporciona una concentración adecuada para la evaluación CASA (~50 × 10⁶/mL) si la concentración de espermatozoides crudos es de ~2 × 10⁹ espermatozoides/mL. Invierta el tubo 5 veces y agite la tapa del tubo antes de abrirlo para asentar la solución en el fondo del tubo.
      NOTA: La concentración de espermatozoides para CASA debe estar en el rango de 8-50 × 10⁶/mL para permitir un seguimiento preciso de los espermatozoides¹⁷. Se puede agregar una solución de trabajo de activación de espermatozoides adicional a la alícuota de espermatozoides crudos para reducir la concentración si es necesario. Vuelva a calcular la tasa de dilución e introduzca este valor en la hoja de cálculo. En los casos en los que se deban procesar muchas muestras simultáneamente, los tubos de microcentrífuga de 1,8 mL se pueden precargar con 0,390 mL de solución de trabajo de activación de espermatozoides con la alícuota de 10 μL de muestra de esperma añadida directamente a ella, luego mezclar bien invirtiendo el tubo 10× y moviendo la tapa del tubo antes de abrirlo.
10. Evaluar la motilidad de los espermatozoides y la concentración de la muestra activada mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA) como se describe en Zuchowicz et ^al.17 colocando 4 μL de suspensión de espermatozoides activados en una cámara de recuento Makler²⁰ o mediante una evaluación visual y un recuento de hemocitómetros bajo microscopía de contraste de fase como se describe en Hagedorn et ^al.4.
    NOTA: La cámara Makler y el cubreobjetos deben limpiarse bien con etanol al 70%, luego con agua destilada y limpiarse con una toallita de papel sin pelusa entre muestras.
11. Introduzca el factor de dilución de espermatozoides utilizado para la evaluación de CASA e introduzca las salidas de CASA para la concentración de espermatozoides (millones/mL), la motilidad total (%) y la motilidad progresiva (%) en la hoja de datos automática.
    NOTA: Las métricas CASA adicionales, incluida la velocidad de ruta promedio (VAP), la velocidad en línea recta (VSL) y la velocidad curvilínea (VCL) se pueden incluir opcionalmente en la hoja de datos automática o recuperarse de los archivos CASA guardados más adelante.
12. Escriba la concentración de espermatozoides en el tubo de muestra de esperma filtrado y transfiera la muestra a la estación de trabajo de criopreservación en el mismo orden en que se rompe y procesa el paquete.

3. Dilución de espermatozoides y equilibrio crioprotector

1. En la estación de trabajo de criopreservación, abra el mismo archivo de hoja de datos automático del biobanco de corales que utiliza la estación de trabajo de evaluación de esperma y seleccione la pestaña Criopreservación . Verifique la etiqueta del tubo de muestra de esperma e identifique la entrada correspondiente marcando ID de colonia (columna C). Si no accede al mismo archivo de hoja de datos automática simultáneamente entre estaciones de trabajo, ingrese manualmente los datos en el ID de colonia (columna C) y la concentración de espermatozoides (columna F) en la hoja de datos automática.
2. Con una pipeta serológica, mida el volumen de la muestra de esperma introduciendo la muestra en la pipeta y expulsándola de nuevo al mismo tubo; introduzca el valor en la columna E.
3. Verifique la columna I calculada automáticamente para la concentración de crioprotector requerida y la columna H para el volumen de criodiluyente que se agregará (Tabla 1).
4. Ponga en marcha un temporizador durante 10 minutos y, utilizando una pipeta serológica, comience inmediatamente a añadir el criodiluyente, gota a gota, con una mezcla suave y constante de la muestra, asegurándose de que se utilizan guantes desechables para la manipulación de DMSO.
5. Registre el tiempo de adición del criodiluyente en la columna P.

Concentración de espermatozoides	Criodiluyente	Relación de dilución (espermatozoides:criodiluyentes)	Concentración final de DMSO en la muestra de esperma (%)
< 2 × 109/mL	30% DMSO en FSW	2:1	10%
≥ 2 × 109/mL	20% DMSO en FSW	1:1	10%

Tabla 1: Proporción de concentración y dilución de criodiluyente para la criopreservación de esperma de coral, basada en la evaluación de la concentración total de espermatozoides en la muestra a criopreservar.

4. Criopreservación de esperma

1. Lea la columna K para determinar la cantidad de crioviales que debe llenar. Esto se calcula automáticamente a partir del volumen total de esperma y el volumen deseado por vial (1 ml en la mayoría de los casos). Durante el período de incubación de 10 minutos, continúe con los pasos 4.2 a 4.6.
2. Destape los crioviales estériles con código de barras y coloque las tapas sobre una superficie limpia/estéril.
3. Opcional: Escriba la carrera # en cada criovial usando un marcador permanente; Esto puede ayudar en la identificación rápida de muestras para su ingreso al Biobanco.
4. Utilizando una pipeta serológica y una pipeta alícuota ajustada al volumen de muestra deseado (1 mL), alícuota muestras en crioviales con código de barras sin tapón y viales de retapa.
5. Coloque un vial de termopar y todos los viales de muestra llenos en una rejilla criogénica vacía a temperatura ambiente. Asegúrese de que la superficie con código de barras esté orientada hacia afuera en todos los viales.
6. Si es necesario, coloque crioviales ficticios adicionales que contengan un 10% de DMSO en FSW en cualquier espacio vacío del bastidor criogénico para asegurarse de que todos los espacios estén ocupados.
7. Introduzca el número de ejecución en la hoja de datos automática (columna U) y escanee el número de serie del bastidor criogénico (código QR) en la columna V.
8. Coloque el cursor en la celda correcta de la columna Z y escanee en el vial de termopar, seguido de todos los tubos crioviales que están cargados en el rack (columna AA en adelante). Evite inclinar la rejilla de lado para asegurarse de que la muestra no entre en la rosca del vial.
9. Durante el escaneo, verifique que los datos se ingresen en la celda correcta y que todos los crioviales se hayan escaneado una vez.
10. Deje a un lado las gradillas cargadas y escaneadas durante el resto del período de equilibrio del crioprotector y prepare el recipiente de enfriamiento para la criopreservación.
11. Llene el recipiente de enfriamiento de la rejilla criogénica con nitrógeno líquido hasta el nivel predeterminado adecuado necesario para enfriar a aproximadamente -20 °C/min.
    NOTA: El nitrógeno solo debe usarse en áreas bien ventiladas, ya que existe el riesgo de asfixia. Se deben usar zapatos cerrados, anteojos/protectores faciales de seguridad y guantes criogénicos cuando se manipule nitrógeno líquido. Consulte las directrices institucionales para obtener información específica sobre el manejo y uso del nitrógeno líquido.
12. Al final del período de equilibrio del crioprotector de 10 minutos, conecte la sonda de termopar al registrador de datos y comience a grabar, luego coloque suavemente la rejilla criogénica completa en el recipiente de enfriamiento y aplique la tapa.
13. Registre la hora de inicio en la columna Q.
14. Una vez que el vial de termopar lea -80 °C o menos en el registrador de datos, enfríe las muestras en nitrógeno líquido transfiriendo el inserto del bastidor criogénico a un baño de nitrógeno líquido en un recipiente separado, como una caja de poliestireno.
15. Retire los crioviales del estante y transfiéralos a un transportador seco para su transporte al biorepositorio.

Results

Los pasos descritos en este protocolo se basan en los métodos originales para la criopreservación de esperma de coral descritos por Hagedorn et ^al.4 y el refinamiento posterior de Zuchowicz et ^al.6, proporcionando mejoras clave para aumentar la eficiencia del procesamiento de esperma para la criopreservación y el biobanco. El uso de crioviales con código de barras y un autopipeteador de alícuotas simplifica el procedimiento de empaquetado de esperma al eliminar la necesidad de imprimir y etiquetar a mano los crioviales, y reduce la tensión de pipetear a mano grandes cantidades de muestras. Es importante destacar que estas mejoras también reducen el tiempo necesario para la preparación de muestras para la criopreservación, de alrededor de 8-10 minutos a menos de 5 minutos. Junto con el uso de CASA, estas mejoras reducen el número de personal necesario para un biobanco eficiente de esperma de coral, de 4 a 6 en los métodos originales, a tan solo dos personas utilizando el protocolo actual. Además, el uso de crioviales con código de barras significa que cada tubo tiene un identificador único, por lo que cada uno se puede rastrear dentro de la base de datos con mayor resolución que el método anterior utilizando etiquetas impresas por lotes.

Las pruebas de campo del protocolo en dos eventos de desove durante la temporada de desove de la Gran Barrera de Coral de 2022 en Australia dieron como resultado la criopreservación y el biobanco de 389 muestras de 57 colonias de 5 especies por parte de dos operadores (una persona para CASA, una persona para la criopreservación), con una persona adicional que ayuda con la ruptura del haz y la separación de esperma según sea necesario. Durante el evento de desove de noviembre de 2022 en Konomie (North Keppel Island) en Queensland, Australia, dos operadores criopreservaron 150 muestras de 24 colonias de Acropora millepora durante un período de 2 h. El procesamiento eficiente y la criopreservación de este volumen de muestras de un número tan grande de colonias de coral fueron posibles principalmente gracias a la eficiencia obtenida en el tiempo de preparación de la muestra y la transferencia simplificada de metadatos entre estaciones de trabajo.

Pruebas adicionales del flujo de trabajo durante el desove en diciembre de 2023 determinaron que, para el esperma de coral, la cámara de recuento Makler proporcionó datos de motilidad y concentración más precisos en comparación con los portaobjetos de cámara de un solo uso de cubreobjetos fijos disponibles en el mercado que se utilizan habitualmente con los sistemas CASA. La cámara de recuento de Makler se validó para CASA utilizando microperlas de látex disponibles comercialmente a una concentración conocida con un volumen de muestra de 4 μL y la configuración estándar de CASA¹⁷ utilizada para el esperma de coral. Estos análisis mostraron recuentos consistentes con baja variabilidad (44,5 ± 0,7 millones/mL) que se encontraban dentro del rango de concentración esperado (46,0 ± 7,0 millones/mL) proporcionado por el fabricante (Figura 2). Una comparación de los datos de CASA para Acropora millepora recolectados utilizando la cámara de conteo Makler y los portaobjetos de la cámara de cubreobjetos fijos encontró una diferencia significativa en los recuentos de concentración de espermatozoides entre los dos tipos de cámaras (P = 0.002; Figura 2), con los portaobjetos de la cámara de cubreobjetos fijos registrando menos de la mitad de la concentración determinada mediante la cámara de recuento Makler. Esta tendencia también se observó en muestras de esperma de otras dos especies de coral (datos no mostrados). Las pruebas realizadas durante diciembre de 2023 tampoco encontraron diferencias significativas en las concentraciones posteriores a la descongelación de espermatozoides totales, móviles o progresivamente móviles en muestras criopreservadas utilizando una dilución 1:1 con 20% de DMSO o una dilución 1:2 (espermatozoides: criodiluyente) con 30% de DMSO (Figura 3).

Figura 1: El flujo de trabajo utilizado para el procesamiento semiautomatizado de esperma de coral para la criopreservación y ejemplos de equipos móviles utilizados en el campo. (A) Los haces de gametos de coral se recolectan en una proporción de 5 mL de haces sobre 5 mL de FSW y se dividen para separar los óvulos y los espermatozoides (i). Los metadatos de la colonia se introducen en la hoja de datos automática (ii) y la muestra de esperma aislada se evalúa mediante análisis de esperma asistido por ordenador (CASA) (iii). Los parámetros de calidad del esperma se añaden a la hoja de datos automática para calcular la adición de 20% o 30% de DMSO en FSW (iv), y la muestra diluida se alícuota en crioviales con código de barras (v). Los crioviales se cargan en el bastidor criogénico y se escanean en la hoja de datos automática (vi), luego se enfrían a una velocidad de -20 °C/min a -80 °C (vii). A continuación, las muestras se enfrían en nitrógeno líquido y se transfieren a transportadores secos para su transporte al Banco de Criodiversidad de Taronga (viii). (B) Ejemplo de las estaciones CASA (izquierda) y criopreservación (derecha) instaladas en un sitio de campo remoto en el aula del Centro de Educación Ambiental de Konomie. (C) Ejemplo de la estación de criopreservación de alta capacidad basada en laboratorio configurada para hacer funcionar múltiples bastidores criogénicos en el Simulador Nacional del Mar del Instituto Australiano de Ciencias Marinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de dos opciones diferentes de portaobjetos de cámara para la medición de la concentración de esperma de coral. (A) Comparación de las mediciones de la concentración total de espermatozoides en Acropora millepora (n = 3 individuos) utilizando la cámara de conteo Makler y portaobjetos de cámara de cubreobjetos fijos disponibles en el mercado. Las columnas muestran la media ± SEM.; los asteriscos indican una diferencia significativa (P = 0,002). (B) Validación de la cámara de recuento Makler utilizando microperlas de látex disponibles comercialmente a una concentración conocida y configuraciones estándar de CASA para esperma de coral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Concentraciones post-descongelación de espermatozoides totales, móviles o progresivamente móviles en muestras criopreservadas. Comparaciones posteriores a la descongelación de las concentraciones de espermatozoides totales, móviles y progresivamente móviles utilizando 20% o 30% de DMSO en FSW para lograr la concentración final de DMSO del 10% para la criopreservación. Las muestras de n = 3 individuos se dividieron en 2 alícuotas cada uno, con una alícuota criopreservada con una adición 1:1 de 20% de DMSO y la segunda alícuota diluida a <2 × 10⁹/mL utilizando FSW para la criopreservación con una adición 1:2 (espermatozoides: criodiluyente) de 30% de DMSO. Las columnas muestran la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fichero complementario 1: Ficha técnica de los biobancos de coral. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

La vía de procesamiento semiautomatizado descrita en este protocolo permite el procesamiento eficiente y la criopreservación del esperma de coral para asegurar la genética de las especies amenazadas y apoyar los esfuerzos de restauración y adaptación de los arrecifes. La motivación para el desarrollo de este protocolo fue la falta de sistemas existentes adecuados para los requisitos de rendimiento de la criopreservación de esperma de coral y el uso de crioviales, ya que los sistemas de procesamiento de alto rendimiento para la criopreservación de esperma generalmente se basan en el empaque de muestras en pajuelas francesas de 0,25 mL o 0,5 mL^21,22. En comparación, los crioviales generalmente se usan a pequeña escala para el procesamiento de bajo rendimiento (por ejemplo, criopreservación de muestras de laboratorio para investigación^23,24), o en sistemas de procesamiento de alto rendimiento para muestras a granel que utilizan equipos costosos y no portátiles (por ejemplo, procesamiento de cultivos celulares para la industria^18,25). También investigamos el potencial de utilizar un sistema de destaponado automático para agilizar la extracción y el reemplazo de los tapones crioviales, pero los sistemas solo estaban disponibles para crioviales individuales o para bastidores crioviales completos, por lo que no proporcionaron una solución rentable. Actualmente, hay varios grupos a nivel mundial que están utilizando el protocolo de criopreservación ideado por Hagedorn et ^al.4 para asegurar la diversidad genética de los corales, y es importante que este trabajo continúe expandiéndose a más arrecifes en todo el mundo. Por lo tanto, una consideración importante en el desarrollo del protocolo actual fue la necesidad de utilizar tecnologías rentables y accesibles que pudieran ser fácilmente implementadas por estos otros grupos, y que no fueran prohibitivas para los nuevos grupos que quisieran comenzar la criopreservación de esperma de coral.

Un componente clave del protocolo descrito es el manejo mejorado de metadatos de muestra a través de hojas de cálculo vinculadas en Microsoft Excel. La entrada de datos suele ser sencilla, pero hay que tener en cuenta que la edición de la información en las hojas de datos automáticas sólo debe realizarse eliminando y volviendo a introducir la información, ya que las funciones rápidas (por ejemplo, Ctrl + C, Ctrl + V) para editar datos afectarán potencialmente a las entradas simultáneas de otros usuarios y pueden causar problemas con la vinculación de datos entre hojas de cálculo. Un componente importante de los metadatos es un identificador único (es decir, el ID de la colonia) que está vinculado a la colonia donante y que se adjunta a la muestra en todas las etapas de la vía de procesamiento. Es esencial que los tubos de muestra estén claramente etiquetados con la identificación de la colonia en el momento de la recolección del paquete, y que esta información se transcriba con precisión en cualquier tubo nuevo al que se transfiera la muestra durante la preparación (por ejemplo, durante el filtrado para separar óvulos y espermatozoides, o para la adición de criodiluyentes). Aunque el protocolo permite la transferencia automática de la información sobre la calidad de la muestra desde el operador de CASA a la estación de trabajo de criopreservación, se pueden encontrar problemas cuando la cobertura de Internet o Wi-Fi es deficiente. Si se producen retrasos en la transferencia de datos, se recomienda que las dos estaciones de trabajo funcionen sin conexión y mantengan hojas de datos automáticas separadas que se puedan conciliar posteriormente. La información clave requerida por el operador de criopreservación es la identificación de la colonia y la concentración de la muestra, por lo que se recomienda que el operador de CASA escriba la concentración de la muestra en el tubo de muestra como respaldo para garantizar que esta información esté a mano para la preparación de la criopreservación si hay un retraso en la carga o descarga de metadatos entre computadoras.

La elección del escáner de código de barras y los crioviales con código de barras utilizados para este protocolo se puede variar para adaptarse al presupuesto y la disponibilidad del producto; Sin embargo, hay algunos elementos clave que deben tenerse en cuenta en su selección. El escáner de código de barras debe tener la capacidad de configuraciones personalizadas, específicamente la capacidad de cambiar las especificaciones de entrada de datos y la dirección de entrada de datos. Las hojas de datos automáticas utilizadas para este protocolo utilizan la entrada horizontal, pero en algunas ocasiones (por ejemplo, la adhesión al biobanco o para otros usos de laboratorio) puede ser necesaria la entrada vertical, por lo que es importante que esta función sea personalizable. Si bien el protocolo se puede utilizar con códigos de barras 1D y 2D, se recomienda que los crioviales seleccionados tengan un componente legible por humanos (por ejemplo, los códigos de barras 1D suelen incluir un número único) para permitir la verificación cruzada de la entrada de muestras durante la criopreservación. Además de la entrada de muestras, el escáner de códigos de barras se puede utilizar para automatizar la entrada de algunos campos de metadatos mediante la creación e impresión de códigos QR para la información que se repite en las muestras (por ejemplo, nombres de especies, fechas y ubicaciones de arrecifes) antes del desove. Esta información se puede introducir rápida y fácilmente en las hojas de datos automáticas escaneando con el escáner de código de barras. Además, al adjuntar códigos de barras con número de serie a cada rack criogénico y sonda de termopar, también es posible vincular cada ciclo de criopreservación con un conjunto específico de equipos dentro de la base de datos, lo que es útil para el control de calidad y para identificar los componentes que requieren reparación o reemplazo.

Los factores limitantes en el procesamiento suelen ser el tiempo que se pasa esperando a que se rompan los paquetes y el tiempo necesario para filtrar y separar los espermatozoides de los óvulos antes de la CASA y la criopreservación. Siempre que sea posible, se recomienda procesar las muestras en el orden en que se rompen los paquetes; Sin embargo, se pueden obtener más ganancias en eficiencia a través de la gestión estratégica de los pedidos de procesamiento de muestras. Por ejemplo, si hay 5 o menos crioviales por colonia debido a bajos volúmenes de muestra (es decir, menos de 3 mL de espermatozoides por colonia) o baja concentración de espermatozoides que requiere una dilución 2:1 con criodiluyente (es decir, menos de 2 × 10^{9 9}/mL), entonces es mejor agregar criodiluyente a dos muestras de colonia al mismo tiempo para que puedan ejecutarse juntas en el mismo rack criogénico (total de # ranuras disponibles = 11), en lugar de ejecutarlos por separado con maniquíes llenando los espacios vacíos. Además, es posible ejecutar varios racks criogénicos simultáneamente (para muestras >6 mL de volumen) siempre que se tenga cuidado para garantizar que todos los procesos se puedan completar dentro del tiempo de equilibrio del criodiluyente de 10 minutos, lo que puede aumentar aún más el rendimiento de la muestra. Sin embargo, cuando se ejecutan varios bastidores criogénicos o se combinan varias colonias en un solo bastidor criogénico, se debe tener cuidado para garantizar que los metadatos de criopreservación se asignen a la muestra correcta en la hoja de datos automática, especialmente si las muestras se criopreservan en un orden diferente al de su evaluación CASA.

Además del desarrollo del flujo de trabajo semiautomatizado, la presente descripción del protocolo también proporciona dos comparaciones metodológicas relacionadas con la concentración de espermatozoides que tienen como objetivo mejorar el análisis de espermatozoides y los resultados de la criopreservación. En general, la recolección de 5 mL de haces de gametos sobre 5 mL de agua de mar (volumen total de 10 mL) dará como resultado una concentración de espermatozoides igual o superior a 2 × 10⁹ células/mL, pero hay ocasiones en las que la concentración de espermatozoides puede ser menor debido a diferencias de especies o a la ruptura de los haces durante la recolección. El uso de un criodiluyente DMSO de mayor concentración (30% v/v) reduce la cantidad en la que se diluyen los espermatozoides para ayudar a minimizar la variación de un lote a otro en la concentración de espermatozoides en el criovial. Es importante destacar que el uso de DMSO al 30% para lograr la concentración final de DMSO no afecta la concentración posterior a la descongelación ni los parámetros de motilidad, como se muestra en los datos representativos de la Figura 3. La segunda comparación metodológica proporciona una alternativa a los portaobjetos de cámara de cubreobjetos fijos de un solo uso que se utilizan normalmente para CASA. El principal desafío con el uso de portaobjetos disponibles comercialmente para el análisis de esperma de coral es que pueden afectar la precisión de la evaluación de la motilidad debido a que los espermatozoides se adhieren al recubrimiento del portaobjetos. El uso de la solución de activación supera este problema en muchas muestras, pero no en todas, por lo que se recomienda realizar un análisis CASA por separado para la motilidad utilizando un portaobjetos simple para garantizar la fiabilidad y la consistencia. El uso de una cámara de conteo Makler supera la necesidad de analizar la concentración y la motilidad por separado, y potencialmente mejora la precisión de las mediciones de concentración (Figura 2), por lo que se recomienda su uso con el protocolo actual. Dada esta discrepancia en las mediciones de concentración, un hallazgo que se ha reportado previamente²⁰, es importante registrar siempre los detalles de los portaobjetos en la base de datos junto con los datos de calidad del esperma y, siempre que sea posible, ser coherente en el tipo de portaobjetos de cámara utilizado para minimizar la variación de un lote a otro y ayudar a garantizar cálculos confiables de las proporciones de espermatozoides: óvulos para las fertilizaciones.

El proceso semiautomatizado descrito en este documento proporciona una vía estandarizada y eficiente para la criopreservación y el biobanco de esperma de especies de coral amenazadas, al tiempo que conserva la bioseguridad y la calidad de la muestra. El protocolo descrito es fácilmente transferible y relativamente barato de implementar en programas de todo el mundo que trabajan para asegurar la diversidad de corales existente mediante la criopreservación, que será esencial para prevenir extinciones y maximizar los recursos disponibles para los esfuerzos de restauración de arrecifes ahora y en el futuro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovation ALI-Q 2 VS Pipeta Controller - Pipeta de alícuota	Vistalab	2100-1005	Manejo de fluidos – medición del volumen de espermatozoides, adición de solución crioprotectora, alícuota de muestras en crioviales
pipetas serológicas de 5 mL (a granel)	Thermo Scientific	Nunc 170355	Manejo de fluidos – medición del volumen de espermatozoides, adición de solución crioprotectora, alícuota de muestras en crioviales
pipetas serológicas de 10 mL (a granel)	Thermo Scientific	Nunc  170356	Manejo de fluidos – medición del volumen de espermatozoides, adición de solución crioprotectora, alícuotas de muestras en crioviales
P2 0.2– 2 y micro; Pipeta	L Gilson	F144054M	Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil
P10 1– 10 y micro; Pipeta	L Gilson	F144055M	Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil
P20 2– 20 y micro; Pipeta L	Gilson	F144056M	Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil
P200 20– 200 y micro; Pipeta	L Gilson F144058M		Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación móvil
P1000 100– 1000 y micro; Pipeta L	Gilson	F144059M	Preparación de soluciones de activación de espermatozoides y manipulación de muestras de esperma para la concentración y la evaluación de la
Bomba de vacío	Millipore	WP6122050	Preparación de agua de mar filtrada para la preparación de soluciones Sistema de
filtración reutilizable en la tapa de la botella Thermo	Scientific	DS0320-5045	Preparación de agua de mar filtrada para la preparación
de soluciones0,22-y micro; M Discos filtrantes, mezclas de ésteres de celulosa	Merck Millipore	GSWP04700	Preparación de agua de mar filtrada para la preparación de soluciones Agua de
mar filtrada	N/A	–	Medio base para la activación de espermatozoides y soluciones crioprotectoras
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Producto químico crioprotector utilizado a una concentración final de 10% v/v en agua de mar filtrada para la criopreservación de esperma
Cafeína	Sigma-Aldrich	C0750	Se utiliza para activar la motilidad de los espermatozoides
Fracción de choque térmico BSA	Sigma-Aldrich	A9647	Se utiliza para minimizar la adherencia de los espermatozoides a los portaobjetos de pozo CASA
Tubos de 15 ml - Thermo con bastidores	Scientific	339651	Preparación de la solución de activación de espermatozoides
Tubos de 50 ml con estanterías	Thermo Scientific	339653	Para la recogida de haces de gametos y muestras de esperma filtradas
Pipetas de transferencia	Thermo Scientific	Samco 202PK	Para ayudar a la recogida de haces de gametos de la superficie del agua
100-µ mCanastas de filtro	Fisher Scientific	22363549	Para excluir óvulos durante la separación de la muestra de semen
Bastidores Eppendorf	Interpath	511029	Dilución y activación de espermatozoides para la concentración y la evaluación móvil
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Eppendorf	30120086	Dilución y activación de espermatozoides para la concentración y la evaluación móvil
Cubreobjetos de vidrio 18x18 mm	Marca	4700 45	Evaluación de la concentración y motilidad de los espermatozoides mediante microscopía de fase
Portaobjetos de vidrio liso, prelimpios, 75x25 mm	Corning	2947	Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante microscopía
de fase Hemocitómetro	Hausser Scientific	1492	Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante microscopía de fase
Portaobjetos CASA (Leja 20-µ m 4 cámaras, SC-20-01-04-B)	IMV Technologies	025107	Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)Cámara de recuento de espermatozoides
de Makler (CASA)	IVFStore	SM-373	Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)
accu-bead® cuentas de recuento	Hamilton-Thorne	710111	Evaluación de la concentración y motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)
Sistema CASA + ordenador portátil	Hamilton Thorne	Ceros II	Evaluación de la concentración y la motilidad de los espermatozoides mediante el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)
Gafas de seguridad	genéricas	;	Equipo de protección personal para usar cuando se manipula DMSO y nitrógeno líquido
Bata de laboratorio Manga	larga, largo y	;	Equipo de protección personal para usar cuando se manipula DMSO y nitrógeno líquido
Criogonos (par)	Tempshield	Mid-Arm Equipo de	protección personal para usar cuando se manipulan DMSO y nitrógeno líquido
Pinzas medianas	Genéricas	;	Para la extracción de muestras criopreservadas de los criobastidores y la manipulación de muestras en nitrógeno líquido
Escáner de código de barras (compatible con 2D)	Zebra	DS2278	Para la lectura de códigos de barras 1D y 2D en crioviales para la gestión de muestras
Vial de 2,0 ml CryoStorage, rosca externa, pretapado, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), lineal y legible por humanos	Eppendorf	30079434	Crioviales con código de barras para la criopreservación de muestras de esperma
Rack criovial	Simport	T315	Bastidor para sujetar crioviales, con base de bloqueo para permitir el destapado y el taponado con una sola mano
Estantes de congelación	Personalizado	–	Sistema de criopreservación diseñado a medida para el esperma de coral, que utiliza componentes impresos en 3D y fácilmente disponibles. La lista de piezas y las instrucciones de montaje están disponibles en Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Tapa de rejilla de congelación	Personalizado	–	Sistema de criopreservación diseñado a medida para el esperma de coral, que utiliza componentes impresos en 3D y fácilmente disponibles. La lista de piezas y las instrucciones de montaje están disponibles en Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Termo de congelación – Contenedor de alimentos al vacío de doble pared de acero inoxidable 18/8 de 1,5 litros	Isosteel	VA-9683	Sistema de criopreservación diseñado a medida para el esperma de coral, que utiliza componentes impresos en 3D y fácilmente disponibles. La lista de piezas y las instrucciones de montaje están disponibles en Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Temporizadores de laboratorio	Genéricos	–	Para el momento del equilibrio crioprotector antes de la criopreservación
Baño de nitrógeno 9L	BelArt	M16807-9104	Para el enfriamiento de muestras durante la criopreservación y la retención de muestras durante la clasificación y la manipulación
Registrador de datos de termopar: multicanal	Omega	HH520	Monitoreo de temperatura durante la criopreservación para determinar la velocidad de congelación y el punto final
Sonda de termopar – Tipo K	Omega	5SC-TT-K-30-36 Monitoreo de	temperatura durante la criopreservación para determinar la velocidad de congelación y el punto final
Bolígrafos criogénicos/bolígrafos permanentes de color	Staedtler Lumocolor	318	Opcional para marcar tapas crioviales para ayudar con la gestión de muestras
Cargador seco - cargado	Taylor Wharton	CXR100 o CX500	Para la transferencia de muestras criopreservadas desde el campo/sitios de recolección hasta el biorepositorio para almacenamiento