Optimización de la visualización del transporte axonal de carga endógena mediante microscopía de fluorescencia en Caenorhabditis elegans vivos

Summary

El artículo describe la optimización de los parámetros de adquisición de microscopía de fluorescencia para visualizar el transporte axonal de cargas endógenas marcadas con una resolución de una sola neurona en un nematodo vivo.

Abstract

El transporte axonal es un requisito previo para entregar proteínas axonales desde su sitio de síntesis en el cuerpo de la célula neuronal hasta su destino en el axón. En consecuencia, la pérdida de transporte axonal perjudica el crecimiento y la función neuronal. Por lo tanto, el estudio del transporte axonal mejora nuestra comprensión de la biología celular neuronal. Con las recientes mejoras en la edición del genoma de CRISPR Cas9, el etiquetado endógeno de las cargas axonales se ha vuelto accesible, lo que permite ir más allá de la visualización del transporte basada en la expresión ectópica. Sin embargo, el etiquetado endógeno a menudo se produce a costa de una señal de baja intensidad y requiere estrategias de optimización para obtener datos sólidos. Aquí, describimos un protocolo para optimizar la visualización del transporte axonal mediante la discusión de los parámetros de adquisición y un enfoque de blanqueo para mejorar la señal de la carga endógena marcada sobre un fondo citoplasmático difuso. Aplicamos nuestro protocolo para optimizar la visualización de los precursores de vesículas sinápticas (SVP) marcados por RAB-3 marcado con proteína fluorescente verde (GFP) para resaltar cómo el ajuste fino de los parámetros de adquisición puede mejorar el análisis de la carga axonal marcada endógenamente en Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

A lo largo de la vida, las neuronas dependen del transporte axonal para transportar proteínas, lípidos y otras moléculas desde el cuerpo celular hasta su destino final en el axón. En consecuencia, la alteración del transporte axonal se asocia con una pérdida de la función neuronal y a menudo está involucrada en la patología de trastornos neurodegenerativos ^1,2. Por lo tanto, es de gran interés comprender los mecanismos que subyacen al transporte axonal.

Varias décadas de investigación sobre el transporte axonal revelaron muchos conocimientos importantes sobre la maquinaria molecular que media este transporte, su composición y los mecanismos reguladores. El transporte axonal de largo alcance ocurre en el citoesqueleto de los microtúbulos, que consiste en polímeros de microtúbulos parcialmente superpuestos que generalmente están orientados con su extremo positivo hacia afuera en los axones³. En consecuencia, el transporte anterógrado está mediado por proteínas motoras que caminan hacia el extremo positivo de los microtúbulos, las quinesinas, mientras que el transporte retrógrado depende del motor de dineína dirigido al extremo negativo. Aunque se han revelado muchos aspectos del transporte, para muchas proteínas axonales todavía no está claro cómo se cargan en la maquinaria de transporte, cómo se organizan los paquetes de transporte individuales y cómo se regula este transporte³.

El transporte axonal se estudió inicialmente en experimentos de radiomarcaje, en los que se inyectaron aminoácidos radiomarcados en el compartimento somático, donde se incorporaron a las proteínas endógenas nacientes y se pudieron rastrear a lo largo del tiempo en el compartimento axonal mediante autorradiografía⁴. Aunque los experimentos de radiomarcaje permitieron el estudio del transporte axonal de proteínas endógenas in vivo, no permiten el seguimiento directo del comportamiento de la carga individual para obtener información mecanicista⁴. Esta limitación se superó con el uso de la microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el transporte axonal a menudo no se visualiza en las proteínas endógenas, sino por la expresión de una copia marcada con fluorescencia. Especialmente para proteínas de baja expresión, la sobreexpresión proporciona intensidades de señal más altas que hacen posible la visualización, preferiblemente con resolución de una sola neurona. Además, la expresión ectópica de la proteína marcada con fluorescencia evita la necesidad y los desafíos de la edición del genoma. Por el contrario, se ha argumentado que el comportamiento de la carga expresada ectópicamente puede diferir del comportamiento de la carga endógena⁵.

Las mejoras recientes en la edición del genoma facilitaron el acceso a las estrategias de etiquetado endógeno. Por lo tanto, una intensidad de señal más baja se ha convertido en la principal limitación para estudiar el transporte axonal de una carga por expresión ectópica en lugar de marcaje endógeno. Las consideraciones cuidadosas en la estrategia de etiquetado endógeno, junto con una optimización de las condiciones de adquisición, pueden superar este desafío.

Los nematodos proporcionan un excelente modelo de investigación para estudiar el transporte axonal in vivo debido a su transparencia y facilidad en las manipulaciones genéticas. En este protocolo, describimos una estrategia de investigación para visualizar el transporte axonal de proteínas endógenas con resolución de una sola neurona en Caenorhabditis elegans vivos. Visualizamos el transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas mediante el uso de una cepa generada por el Jorgensen Lab⁶, en la que la vesícula asociada a RAB GTPasa, RAB3, está marcada endógenamente con GFP, en la neurona motora DA9. Al preguntarse cómo las pequeñas adaptaciones en diferentes parámetros de adquisición y el fotoblanqueo pueden mejorar la visualización de eventos de transporte individuales, el protocolo proporciona ideas sobre cómo optimizar las condiciones de imagen.

Protocol

Para obtener un protocolo detallado sobre cómo mantener y preparar nematodos para la obtención de imágenes de células vivas, consulte el trabajo de S.Niwa ⁷.

1. Generación de cepas de gusanos

Además de generar cepas de nematodos, el Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)⁸ contiene una creciente colección de cepas de nematodos con proteínas marcadas con fluorescencia endógena que se pueden obtener directamente desde su página web.

1. Elección de la estrategia de marcaje con fluorescencia
   1. Utilice la cepa de nematodos MTS1161, que contiene el alelo⁶ de rab-3(ox699), para visualizar la GFP endógena marcada con RAB-3 en la neurona motora DA9 (la cepa se depositará en el CGC). Para visualizar otras proteínas axonales, genere una cepa de nematodos con una proteína endógena marcada utilizando el protocolo de edición CRISPR Cas9 del Mello Lab⁹.
      NOTA: MTS1161 utiliza un enfoque de recombinación para etiquetar específicamente la célula RAB-3 de forma endógena con una etiqueta GFP⁶. Un enfoque alternativo común se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente dividida, que se recomienda para proteínas de expresión especialmente baja, ya que aumenta el número de copias fluorescentes por proteína endógena mediante el uso de múltiples copias fluorescentes divididas¹⁰. El número de copias puede estimarse inicialmente a partir de los conjuntos de datos de transcriptomas de la página web de CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Elección de la neurona para visualizar el transporte axonal
   1. En la MTS1161 de tensión, visualice RAB-3 en la neurona motora DA9 (ver Figura 1). Para otras cargas axonales, especialmente proteínas de baja expresión, identifique una neurona en la que los niveles de expresión de la proteína analizada sean más altos utilizando la página web de CenGen.
      NOTA: El proyecto CenGen (cengen.org) proporciona un excelente recurso en línea para estimar los niveles de expresión de una proteína de interés en muchas neuronas del nematodo basado en un gran conjunto de datos transcriptómicos que cubren las 302 neuronas del sistema nervioso de C. elegans ^12,13.

2. Manipulación de gusanos y preparación para la obtención de imágenes

1. Mantenga los nematodos en un césped de bacterias (cepa: OP50) sembrados en placas de medio de crecimiento de nematodos a 20 °C y cultivados hasta una edad de 1 día hasta la edad adulta para la toma de imágenes.
   NOTA: La medición del transporte axonal en una etapa de edad definida es importante ya que las tasas de transporte disminuyen con el envejecimiento de manera constante en diferentes cargas axonales, clases de neuronas y organismos. 14,15,16,17,18-Nematodos^en la etapa larvaria L4 o 1 día en la edad adulta se han utilizado en la mayoría de los artículos y, por lo tanto, ofrecen los conjuntos de datos más grandes para las comparaciones.
2. Preparación de nematodos para la obtención de imágenes de células vivas: Realice todos los pasos posteriores con un microscopio estereoscópico para visualizar y manipular los gusanos.
   1. Transfiera los nematodos a una gota de 0,5 mM de Levamisol utilizando un pico de alambre de platino e incube los nematodos durante 20 minutos en la gota.
   2. Monte con cuidado 10-20 nematodos de la gota de levamisol en una gota de 12 μL de medio M9 en un parche de agarosa al 10% (disuelto en medio M9) en un portaobjetos de vidrio usando un palillo para el cabello. Para obtener un procedimiento detallado sobre cómo hacer un parche de agarosa al 10%, consulte el protocolo de S.Niwa⁷.
      NOTA: Montar un número bajo de nematodos es suficiente, ya que solo se tomarán imágenes de unos pocos animales por portaobjetos antes de que los animales comiencen a sufrir hipoxia.
   3. Coloque un cubreobjetos encima de la gota (22 mm x 22 mm o 18 mm x 18 mm). Para el transporte de imágenes en el axón DA9, coloque el axón cerca del cubreobjetos. Para ello, gire el cubreobjetos 45° después de colocarlo sobre el parche de agar, para hacer rodar a los animales sobre su espalda.
   4. Selle el espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio con un gel viscoso como la vaselina. Esto evitará que el parche de agarosa se seque, lo que puede hacer que los nematodos se desplacen fuera del campo de imágenes.
      NOTA: Es crucial tratar a los animales con la mayor delicadeza posible. Concentraciones demasiado altas de levamisol o daños físicos en el gusano pueden afectar el transporte axonal. Los espasmos leves de la cola durante la sesión de imágenes son una buena señal de que el animal permanece en un estado saludable. Los animales se mantienen sanos e incluso pueden recuperarse del parche de agarosa después de la sesión de imagen.

3. Microscopía de células vivas

NOTA: Los valores exactos de los parámetros de adquisición pueden diferir entre los microscopios. Sin embargo, las tendencias de cada parámetro de adquisición deben ser independientes del microscopio utilizado. En este protocolo se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio que estaba equipado con una línea láser separada para el blanqueo (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el microscopio). La fluorescencia verde fue excitada por un láser de 488 nm y la emisión fue filtrada por un filtro de emisión ET525/36. El blanqueo se realizó utilizando una línea láser de 488 nm.

1. Asegúrese de que la temperatura de la habitación, o si se dispone de una etapa con control de temperatura, esté ajustada a una temperatura constante. Para los nematodos, ajuste la temperatura a 20 °C.
2. Monte el portaobjetos y use la lente del objetivo con un aumento de 4x-20x para ubicar los nematodos en el portaobjetos y memorizar las posiciones. Cambie a una lente de aumento de 63x para la adquisición de imágenes.
3. Tome una sola imagen para comprobar los parámetros de adquisición iniciales. Realice un seguimiento de las intensidades de la señal en el campo de visión con el histograma de intensidad del software de adquisición. Los valores de intensidad deben cubrir el tercio más bajo de la señal máxima que la cámara puede detectar. Evite la saturación de píxeles. Mejore la intensidad del láser de excitación si la intensidad de la señal es demasiado baja.
   NOTA: No utilice intensidades de láser de excitación demasiado altas, ya que blanquea la proteína fluorescente durante el lapso de tiempo.
4. Modifique el parámetro de adquisición y los pasos aquí para optimizar la detección de la señal de fluorescencia.
   1. Implementación de una etapa de blanqueo: Blanquear la región del axón que se va a analizar utilizando una línea láser de 488 nm (potencia: 15 mW) para la etapa de blanqueo. Apunta a una eficiencia de blanqueo de al menos el 90%. Determine la eficiencia del blanqueo comparando la intensidad de la señal de la región antes y después del paso de blanqueo.
      NOTA: El blanqueo mejora la señal de las partículas en movimiento al reducir la señal que se deriva de las partículas estacionarias, así como la señal que se deriva de la fracción citoplasmática de la proteína en el fondo. La carga membranosa, como RAB-3 en los precursores de vesículas sinápticas, tiene una fracción citoplasmática baja, por lo que la etapa de blanqueo solo mejora ligeramente la señal del paquete de transporte sobre el fondo citoplasmático (Figura 2A, D). Sin embargo, el blanqueo mejora el seguimiento de los eventos de transporte individuales en distancias más largas y permite cuantificar los tiempos de pausa (Figura 2A).
   2. Agrupación: utilice la agrupación en bins 2 x 2 para mejorar la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales. La agrupación combina matrices de píxeles en un píxel más grande. Esto reducirá la resolución espacial, pero mejorará la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales y es especialmente útil para partículas tenues (Figura 2B, D).
   3. Tiempo de exposición: Mejore el tiempo de exposición para mejorar la intensidad de la señal. La mejora del tiempo de exposición aumenta la intensidad de la señal de la muestra a costa de obtener una resolución temporal más baja para los eventos de transporte. Para el experimento aquí, use una resolución temporal de 300 ms a 700 ms entre puntos de tiempo consecutivos (tiempo de exposición de 100 a 500 ms) para seguir los eventos de transporte individuales de RAB-3. (Figura 2C,D)
5. Registro de lapso de tiempo: Realice un lapso de tiempo de al menos 1-3 minutos dependiendo de la intensidad de la señal de la proteína, así como de la frecuencia de los eventos de transporte individuales. Una vez que se haya registrado un lapso de tiempo, pase al siguiente animal. No se deben tomar imágenes de los animales en un portaobjetos durante más de 30 minutos para garantizar que los animales registrados estén en un estado saludable.
   NOTA: Los movimientos leves de la cola de los animales durante la grabación son un indicador de que el animal todavía está vivo.

4. Análisis de los datos de transporte axonal

NOTA: Utilice ImageJ/Fiji¹⁹ para los siguientes pasos de análisis de imágenes. Fiji es capaz de leer datos mediante todos los paquetes de software de microscopía comunes.

1. Generación de Kymograph
   1. Importar datos: Importe el archivo de datos de lapso de tiempo a Fiji. En caso de que no pueda importar los datos a Fiji, exporte el registro de tiempo como un archivo tiff desde el paquete de software y cárguelo posteriormente en Fiji.
   2. Corrección de deriva: Compruebe si el segmento animal/axón se ha movido o se ha desviado ligeramente durante la adquisición de la imagen. Corrija el movimiento de los animales o la deriva ejecutando el complemento StackReg²⁰. Al ejecutar el complemento, elija la transformación Cuerpo rígido .
   3. Generación manual de un kymograph: En la Figura 3 se proporciona un procedimiento detallado paso a paso. Utilice la película corregida de deriva para generar el quimógrafo. Utilice la herramienta Línea segmentada y ajuste el ancho de la línea para que coincida con el diámetro del axón haciendo doble clic con el botón izquierdo del ratón en el icono de línea segmentada para dibujar una línea a lo largo del segmento del axón que se analizará. Ejecute el complemento Kymoreslicewide de ImageJ/Fiji para generar el kymograph y utilice el valor de intensidad máxima a lo ancho de la línea en su configuración de parámetros.
      NOTA: Mantener la consistencia en la dirección del dibujo lineal (por ejemplo, siempre proximal al axón distal o inverso) simplifica el trazado de la dirección del movimiento hacia atrás en los quimógrafos.
2. Análisis de los parámetros de transporte
   1. Calcule el parámetro de transporte: número de evento, velocidad, duración de la ejecución y duración de la pausa del kymograph siguiendo los pasos siguientes.
      1. Rastrear eventos de transporte en el quimógrafo: Utilice la herramienta Línea recta para trazar eventos de transporte individuales en el quimógrafo. Guarde cada línea en el administrador de ROI y rastree todos los eventos de transporte en el kymograph. Elija los siguientes parámetros de medición en ImageJ/Fiji: Área, Rectángulo delimitador, Valor medio de gris, Diámetro de Feret.
      2. Calcular parámetro de transporte: pegue la tabla de resultados en una hoja de cálculo y utilice las siguientes columnas de las secciones de resultados para calcular:
         Longitud de la tirada: Multiplique la anchura (en píxeles) por la resolución de la cámara (por ejemplo, x μm/pxl) para determinar la longitud de la tirada en μm.
         Velocidad: Longitud de la carrera/Duración de la ejecución. Para determinar la duración de un evento de movimiento en segundos, multiplique la altura (en píxeles) por el tiempo de adquisición entre puntos de tiempo consecutivos (por ejemplo, x s/píxel).
         Tiempo de pausa: duración de la carrera entre dos movimientos consecutivos a los que la velocidad es 0.
         Número de evento: Los eventos totales se pueden normalizar a la longitud total del quimógrafo para determinar el número de eventos por minuto y el segmento de longitud del axón. Los eventos se pueden clasificar a su vez en eventos de transporte anterógrados y retrógrados. Para determinar la direccionalidad de cada evento de movimiento, utilice la herramienta Ángulo de Feret. En los cimogramas que se generaron inicialmente dibujando la línea segmentada de proximal a distal y los eventos de transporte anterógrado en el cimograma apuntan de derecha a izquierda, un ángulo de Feret < 90° indicará un evento anterógrado y >90° un evento retrógrado, de lo contrario será el inverso.

Results

Visión general del sistema modelo y del procedimiento de medición
Para visualizar el transporte axonal de los precursores de las vesículas sinápticas, rastreamos endógenamente GFP marcado con RAB-3. Aquí hacemos uso de una cepa⁶ de GFP::Flip-on::RAB-3 recientemente generada, en la que la expresión de la recombinasa Flippasa bajo un promotor específico de la célula (glr-4p) marca RAB-3 endógeno en la neurona motora DA9. DA9 es una neurona motora bipolar, con su cuerpo celular ubicado en la parte posterior del animal en el lado ventral, cerca del ano (Figura 1A). Contiene una dendrita corta que corre hacia delante a lo largo del cordón nervioso ventral y un axón largo que corre hacia atrás, forma una comisura y luego corre hacia delante a lo largo del cordón nervioso dorsal, donde forma sinapsis al paso que inervan el músculo dorsal y la neurona VD^22,23,24. Visualizamos el transporte axonal en la región asináptica; la mayoría de los eventos de transporte se pueden capturar con un solo plano focal (Figura 1A). Se implementa un primer paso de fotoblanqueo para reducir el fondo de las vesículas estacionarias en esta área, que a menudo tienden a detenerse en esta región (Figura 1B). Los vídeos time-lapse se graban durante 3 minutos y la señal RAB-3 a lo largo de la región asináptica se traza en un kymograph para extraer los eventos de transporte individuales (Figura 1C).

Ajuste del parámetro de adquisición para optimizar la visualización del transporte axonal
Para superar la baja intensidad de la señal de muchas proteínas marcadas con fluorescencia endógena, es necesario optimizar los parámetros de adquisición del microscopio. Para una cuantificación robusta de los eventos de transporte, la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales debe ser lo más brillante posible sobre el fondo citoplasmático o la carga estacionaria en pausa. Los precursores de vesículas sinápticas a menudo se detienen en la región asináptica en distintos grupos de vesículas, lo que interfiere con la detección de nuevas vesículas entrantes y dificulta el seguimiento de sus rastros de transporte⁷.

Un solo paso inicial de blanqueo de fluorescencia puede reducir en gran medida la señal de fluorescencia derivada de los grupos de vesículas para mejorar la detección de movimiento de nuevas vesículas entrantes (Figura 2A). La etapa de blanqueo solo mejoró ligeramente la señal de movimiento de las vesículas RAB-3 sobre la intensidad de fondo citoplasmática, probablemente porque la fracción citoplasmática de RAB-3 es muy baja (Figura 2D).

El uso de la discretización proporciona una capa adicional para mejorar la señal sobre el fondo de eventos de transporte individuales mediante la combinación de una matriz de píxeles en un solo píxel. Un agrupamiento de 2 x 2 reducirá a la mitad la resolución espacial (en este caso, de 108,33 nm/píxel a 216,7 nm/píxel), que sigue siendo suficiente para rastrear partículas de transporte RAB-3 individuales (Figura 2B), pero mejora considerablemente la intensidad de la señal de las vesículas individuales (Figura 2D). A menos que se requiera una resolución espacial muy alta, el binning también se puede aplicar para visualizar muchas otras cargas axonales.

A continuación, nos preguntamos cómo los cambios en el tiempo de exposición pueden mejorar la intensidad de la señal de eventos de transporte individuales. Incluimos especialmente el tiempo de exposición en el análisis para demostrar también que el tiempo de exposición de hasta 500 ms con 700 ms entre los puntos de tiempo de imagen posteriores aún proporciona una resolución temporal a la que se pueden rastrear los precursores de vesículas sinápticas (Figura 2C, D).

Generación y análisis de kymographs con Fiji
Para generar un kymograph y analizar eventos de transporte individuales, siga los pasos de la Figura 3.

Figura 1: Descripción general del sistema modelo para visualizar el transporte axonal de RAB-3 fluorescente endógeno. (A) Panel superior: Vista general del nematodo con eje posterior-anterior y ventral-dorsal indicado. La neurona motora DA9 está etiquetada como azul. Panel central: Acérquese a la región en caja que se muestra en el panel superior con la compartimentación DA9 indicada. Las sinapsis al paso se ilustran en verde, * indica el ano. Nótese que el axón continúa en el cordón nervioso dorsal hasta que pasa la vulva. El recuadro rojo indica la región de la zona asináptica. Panel inferior: Imagen de microscopía confocal de GFP endógena marcada con RAB-3 en el axón proximal en un solo plano focal. Nótese que hay sumideros de vesículas de RAB-3 en pausa más larga en la región asináptica, aunque la mayoría de las señales de RAB-3 se agrupan en la región sináptica. La región asináptica está representada en rojo. Escala: 20 μm. (B) Imágenes representativas de una grabación time-lapse para visualizar el transporte axonal. Para mejorar la trazabilidad de las partículas de transporte individuales sobre las partículas estacionarias, la región asináptica se fotoblanquea inicialmente. Los paneles inferiores en la región de cuadro púrpura muestran un ejemplo de un evento de movimiento anterógrado (punta de flecha naranja) y retrógrado (punta de flecha azul). Los paneles de arriba a abajo representan puntos de tiempo consecutivos. (C) El registro de lapso de tiempo en (B) se trazó como un quimógrafo (representación 2D del tiempo sobre la posición). Las líneas diagonales representan eventos de movimiento en los que la pendiente indica la velocidad. Las líneas verticales muestran eventos estacionarios. El cuadro púrpura es un acercamiento del cimógrafo para resaltar los eventos de transporte que también se muestran en (B) y se trazan los eventos de transporte anterógrados (naranja) y retrógrados (azul). Las líneas verticales discontinuas indican los eventos de pausa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Optimización de los pasos y parámetros de adquisición para mejorar la visualización de la carga axonal endógena. Las GFP::RAB-3 endógenas se visualizaron en la zona asináptica del axón DA9 tomando imágenes de un solo plano focal en un microscopio de disco giratorio confocal. Se adquirieron cimógrafos para visualizar eventos de transporte individuales en dirección anterógrada (de derecha a izquierda) y retrógrada (de izquierda a derecha) (A-C). (A) Los cismógrafos muestran los eventos de transporte de RAB3 sin (quimógrafos izquierdos) o con un paso de blanqueo integrado. Tenga en cuenta que el paso de blanqueo mejora la visualización de los eventos de pausa (indicados por puntas de flecha amarillas) entre eventos de transporte consecutivos (puntas de flecha naranjas). (B) La implementación de la agrupación 2 x 2 ayuda a mejorar la intensidad de la señal de los eventos de transporte RAB3 débiles. Las imágenes se adquirieron con un tiempo de exposición de 300 ms y, con (C), el aumento incremental del tiempo de exposición (de 100 ms en el extremo izquierdo a 500 ms en el extremo derecho) ayuda a mejorar la intensidad de la señal de los eventos de transporte individuales. Las imágenes se adquirieron en agrupación de 2 x 2 y utilizando un paso inicial de fotoblanqueo. Todos los kymographs muestran una duración total de 3 min y se dibujan a la misma escala, de modo que los kymographs con menos puntos de tiempo de adquisición debido a un lapso de tiempo más largo entre puntos de imagen consecutivos tienen una longitud total más corta del kymograph. (D) Cuantificación de la intensidad de la señal por evento de transporte después de la sustracción de la fluorescencia de fondo de los kymographs en (A-C). Tenga en cuenta que el agrupamiento y el paso de blanqueo fotográfico se adquirieron con un tiempo de exposición de 300 ms. Comparación estadística utilizando n eventos para 100 ms (n_eventos= 27 en n_animales= 2), 200 ms (n_eventos= 30 en n_animales= 2), 300 ms (n_eventos= 88 en n_animales= 6), 500 ms (n_eventos= 12 en n_animales= 1), 300 ms sin (w.o.) binning (n_eventos= 31 en n_animales= 3), 300 ms con (w) binning (n_eventos= 88 en n_animales= 6) y 300 ms, Binning 2 x 2 con blanqueo (n_eventos= 88 en_{n animales}= 6) y sin blanqueo. Cada punto de datos representa la intensidad de la señal de un evento de transporte RAB-3 individual después de la sustracción de fondo (citoplasma del axón) en un solo punto de tiempo a lo largo de su traza que se eligió al azar. El tiempo de exposición se comparó mediante una prueba de Kruskal-Wallis seguida de una comparación múltiple de Dunn, el binning y el fotoblanqueo se compararon mediante una prueba de Mann-Whitney por pares. Las barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Procedimiento paso a paso para generar un quimógrafo y medir eventos de transporte individuales. (A) Después de cargar la grabación de video en Fiji, se utiliza la herramienta de línea segmentada para trazar una línea a lo largo del segmento axonal que se va a analizar. (B) Se genera un kymograph (panel derecho) utilizando el plugin Kymoreslicewide con los parámetros representados en el panel izquierdo. (C) Los eventos de transporte individuales se rastrean con la herramienta de línea lineal y se almacenan en el administrador de ROI. El panel derecho muestra la configuración de medición que se utiliza para generar la tabla de resultados. (D) Los resultados de la tabla se utilizan para calcular el parámetro de transporte. Los cuadros indican parámetros importantes que se describen en la sección de métodos del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Limitaciones del método y métodos alternativos
En este protocolo, optimizamos los parámetros de adquisición para visualizar el transporte axonal de RAB-3 marcado endógenamente, que se asocia con precursores de vesículas sinápticas. Para visualizar el RAB-3, utilizamos una cepa⁶ de FLIP-on::GFP::RAB-3 publicada recientemente y expresamos la flippasa recombinasa bajo un promotor específico de la célula (glr-4p)²⁵. Esta estrategia nos permite marcar RAB-3 con un solo fluoróforo GFP. RAB-3 es relativamente fácil de visualizar porque está altamente expresado y fuertemente enriquecido en los precursores de vesículas sinápticas, de modo que los eventos de transporte individuales tienen una intensidad de señal brillante sobre una señal baja que se deriva del fondo citoplasmático. Otras proteínas axonales pueden requerir estrategias de optimización adicionales fuera de la configuración de la microscopía para permitir la visualización de eventos de transporte. Especialmente para las proteínas de baja expresión, el sistema de GFP dividido proporciona una excelente alternativa. En este sistema, la GFP₁₁ se inserta en el locus endógeno de la proteína de interés y la GFP_1-10 se expresa a partir de un promotor específico de la célula. Una gran ventaja de este sistema es el pequeño tamaño de la plantilla de reparación del ADN (aproximadamente 70 nucleótidos) que necesita ser insertada genómicamente, lo que hace que la recombinación homóloga sea más eficiente en comparación con la inserción del ORF de toda la etiqueta fluorescente^26,27. Debido a su pequeño tamaño, se pueden insertar múltiples fragmentos de GFP₁₁ en la proteína endógena, lo que amplifica el número de fluoróforos GFP reconstituidos por proteína y, por lo tanto, aumenta la señal fluorescente de la proteína endógena y, por lo tanto, del paquete de transporte²⁸.

Además de marcar la proteína con un enfoque de GFP dividido o GFP, se pueden utilizar otros fluoróforos codificados genéticamente que tienen ventajas y desventajas únicas con respecto a sus propiedades fotoquímicas, que se han comparado recientemente²⁹. Además, los fluoróforos químicos con más propiedades fotoestables se pueden utilizar marcando endógenamente la proteína de interés con una etiqueta HALO o SNAP³⁰.

Especialmente para las proteínas citoplasmáticas que son abundantes en todo el axón, podría ser necesario un enfoque de etiquetado condicional. Recientemente visualizamos una carga de este tipo, la espectrina endógena, mediante microscopía de fluorescencia utilizando un marcaje controlado en el tiempo para visualizar únicamente nuevas proteínas espectrinas sintetizadas. Para el etiquetado condicional con resolución de una sola neurona, combinamos la expresión de una recombinasa impulsada por el choque térmico con un sistema de GFP dividido³¹.

Si el objetivo de la investigación es comprender el transporte de orgánulos, la expresión de un dominio proteico que se asocia con el orgánulo puede proporcionar una alternativa a la expresión ectópica de la proteína de longitud completa.

Pasos críticos en el protocolo
Una preparación cuidadosa para optimizar la visualización de la proteína en función de los niveles de expresión esperados, así como para elegir la estrategia de etiquetado óptima, son especialmente críticas para la visualización exitosa de las proteínas marcadas endógenas. Los niveles de expresión de la mayoría de las proteínas en muchas neuronas se pueden estimar en función del conjunto de datos transcriptómicos de Cengen¹³. La baja intensidad de señal esperada de los eventos de transporte para proteínas citoplasmáticas o de baja expresión puede mejorarse mediante la unión de múltiples copias del fluoróforo. Tenga en cuenta, sin embargo, que con cualquier experimento de etiquetado, se debe tener cuidado de no interrumpir la función de la proteína marcada. En caso de que exista un fenotipo conocido para el mutante correspondiente, es importante verificar que el etiquetado no genere este fenotipo. En los casos en los que no se conoce el fenotipo, se requieren enfoques alternativos que variarían según el caso.

Un paso crítico en la obtención de imágenes de eventos de transporte axonal es el estado de salud del animal. Los animales deben ser tratados con la mayor delicadeza posible para la preparación de las imágenes, así como durante las imágenes (p. ej., uso de un palillo en lugar de un alambre metálico para transferir a los animales paralizados, minimizando el tiempo de incubación en el agente paralizante, minimizando el tiempo de obtención de imágenes para evitar la fototoxicidad).

Modificaciones y solución de problemas
Si bien pretendemos optimizar la visualización del transporte axonal de proteínas endógenas, las estrategias de optimización de los parámetros de adquisición también son aplicables a las proteínas expresadas ectópicamente. Especialmente si los niveles de expresión endógena son demasiado bajos para visualizar los eventos de transporte, la expresión ectópica de la proteína puede proporcionar una alternativa.

En caso de que no se puedan registrar eventos de transporte a pesar de una fuerte intensidad de señal de la proteína endógena marcada, los animales podrían estar en un estado poco saludable. Esto puede resolverse preparando a los animales para la microscopía bajo procedimientos de preparación más suaves (por ejemplo, reducir el tiempo de incubación en el agente paralizante). Como alternativa, los eventos de transporte pueden ser raros y una grabación de vídeo de 3 minutos puede no ser suficiente para capturar eventos. La captura de eventos de transporte raros se puede optimizar aumentando la duración de la grabación de vídeo, aumentando el número de animales fotografiados o tomando imágenes de los animales en una etapa de desarrollo diferente en la que los eventos de transporte podrían ser más frecuentes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539
Cubreobjetos (22 mm x 22 mm, Nº 1); Cubierta de vidrio Gold Seal Thomas	Scientific	6672A14
Levamisol	ChemCruz	sc-205730
Microscopio: Microscopio invertido Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, cámara Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA objetivo de inmersión en aceite, escáner de fotoestimulación Nikon a 488 nm con filtro de emisión ET525/36		Microscopio
NIS-elements AR	Nikon		Software para el Nikon Ti2
Portaobjetos de microscopía lisos prelimpios	Thermo Scientific	420-004T
nematodo fuerte	Identificador	Fuente
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Se depositará en CGC (https://cgc.umn.edu/)