Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Las células de Müller (MC) son las principales y más abundantes células gliales que se encuentran en el tejido de la retina. Son los actores clave en el suministro de integridad estructural y funciones metabólicas dentro de la retina¹. La estructura estratégica de los MC se extiende por todo el grosor de la retina, proporcionando así soporte a la retina. Además de sus propiedades de andamio, tienen funciones metabólicas para las neuronas de la retina, suministrándoles sustratos energéticos, como la glucosa y el lactato. Estas funciones son cruciales para mantener una función neuronal saludable. Se ha descrito que el deterioro de las MC contribuye a diversas enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética y el glaucoma ^2,3. Las MC pueden ser fuentes celulares endógenas para la terapia regenerativa en la retina¹. También comprenden una porción significativa de la retina, y una fuerte evidencia sugiere que en varias especies, estas células pueden ser estimuladas para reemplazar las^neuronas faltantes. Colaboran de manera beneficiosa con las neuronas, y los extremos de las células de Müller que se ramifican cónicamente desenvainan densamente los vasos sanguíneos y conectan los componentes neuronales de la retina. Con el fin de mantener el desarrollo neuronal y la plasticidad neuronal, las células de Müller actúan como un sustrato blando para las neuronas, protegiéndolas de los traumatismos^mecánicos. Además, en circunstancias patológicas, las células de Müller pueden diferenciarse en progenitores neurales o células madre que replican o regeneran los fotorreceptores y neuronas perdidos ^2,3,4. Las células de Müller conservan las características de las células madre de la retina, incluyendo diferentes niveles de potencial de autorrenovación y diferenciación ^5,6. La célula glial de Müller tiene un linaje retiniano significativo que produce factores neurotróficos, absorbe y recicla neurotransmisores, amortigua espacialmente los iones y mantiene la barrera hematorretiniana para mantener la retina en homeostasis ^7,8,9. Esto pone de manifiesto el potencial de las células de Müller como una herramienta prometedora en las terapias basadas en células para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina. Las células de Müller son la glía principal distribuida por toda la retina, conectándose tanto con las neuronas como con los vasos sanguíneos. Desempeñan un papel protector crucial, proporcionando un soporte estructural y metabólico esencial para mantener la viabilidad y la estabilidad de las células de la retina. Desafortunadamente, se encuentran muy pocos protocolos en la literatura para el aislamiento primario de células de Müller de la retina^10,11.

Presentamos un enfoque mejorado para aislar y cultivar de forma fiable células primarias de Müller de ratón. Este protocolo se utilizó en nuestro grupo para aislar células de Müller de ratones salvajes C57BL/6 y ratones transgénicos^12,13. Para este protocolo se utilizan ratones de entre 5 y 11 días de edad, sin preferencia de sexo. Las celdas han sido pasadas hasta 4 veces; sin embargo, en P4 dejan de adherirse al matraz y se hace difícil cultivar un cultivo saludable. El cultivo a menudo está contaminado con células epiteliales pigmentadas de la retina (EPR), por lo que las células deben pasar al menos una vez antes de realizar cualquier experimento adicional en la línea celular. El paso permite un mayor aislamiento de los contaminantes. Por lo tanto, el protocolo presentado ofrece una forma rápida y eficaz de aislar células de Müller de ratón, que luego pueden utilizarse como una plataforma fiable para investigar dianas terapéuticas y evaluar posibles tratamientos para las enfermedades de la retina¹⁴.

Todos los experimentos con animales se ajustaron a la declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y se realizaron siguiendo nuestro protocolo animal aprobado por el Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y las políticas de la Universidad de Oakland (número de protocolo 2022-1160)

1. Preparación de medios y soluciones

1. Prepare la solución oftálmica de células de Müller complementando el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, detalles en la tabla de materiales) con penicilina/estreptomicina en la dilución 1:1000. Por ejemplo, para 10 ml de DMEM, agregue 10 μl de penicilina/estreptomicina.
   NOTA: Este es un medio simple sin suero preparado. Además, caliente el medio completo en un baño de agua a 37 °C antes de utilizarlo para el trabajo de cultivo celular.
2. Prepare medios completos de crecimiento de células primarias de Müller complementando DMEM con un 10% de suero fetal bovino (FBS, inactivado por calor) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Por ejemplo (500 mL de medio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).
3. Prepare una solución de tripsina-EDTA al 0,05% con colagenasa IV a una concentración de 200 U/mL (la tripsina-EDTA se utiliza para disolver la cantidad calculada de polvo de colagenasa IV para alcanzar la concentración necesaria).

2. Enucleación

1. Sacrificar éticamente al ratón mediante la inhalación de CO₂ siguiendo las directrices de la IACUC.
   1. Brevemente, coloque el (los) animal (s) en la cámara de CO₂ para introducir 100% de CO₂ a una tasa de llenado del 30-70% de la cámara vol / min con CO₂ para lograr el objetivo de inconsciencia rápida dentro de 2-3 min con un sufrimiento mínimo para los ratones.
   2. Dado que los ratones están en una edad temprana (~ 10 días), realice la dislocación cervical como método secundario para garantizar una eutanasia adecuada.
2. Después de esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%, coloque el mouse en una almohadilla inferior estéril.
3. Extraiga los ojos colocando los brazos de las pinzas en la parte posterior del ojo, tirando suavemente del área orbital y enucleando los ojos aplicando presión con pinzas estilo 5/45 en el área orbital para causar proptosis.
   NOTA: Esterilice las herramientas de disección con etanol al 70% seguido de solución salina tampón de fosfato antes de la disección.
4. Asegúrese de que el nervio óptico siga conectado al ojo enucleando el ojo lentamente. Asegúrese de tirar del nervio óptico (identificado visualmente como un cordón blanco) detrás del ojo.
   NOTA: Este paso no necesita realizarse bajo un microscopio y se puede realizar en un banco esterilizado.

3. Tratamiento de los ojos enucleados

1. Cubra un tubo de centrífuga de 15 ml con papel de aluminio y llene el tubo con 10 ml de la solución ocular de células de Müller.
2. Coloque los ojos disecados en el tubo de 15 ml que contiene la solución ocular de células de Müller y déjelos reposar toda la noche, o aproximadamente 18 horas, a temperatura ambiente.
3. Después de 18 h, decantar la solución ocular y enjuagar brevemente los ojos con 2-3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) tibia (37 °C).
4. Decantar el PBS y mover los ojos a una placa de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de solución de tripsina. (preparado en el paso 1.3).
   NOTA: La tripsina se utiliza en todo el ojo enucleado, actuando como un agente disociativo para facilitar la separación celular de las capas de la retina durante la disección. La retina disecada tiene muchas células, incluidas las células EPR, que son pegajosas y tienen más probabilidades de contaminar el cultivo de células de Müller¹⁴. El examen microscópico demostró claramente que después de 5 días de aislamiento (durante el primer cambio de medio), las células del EPR se desprendieron de la placa y murieron¹³. El medio utilizado para el aislamiento del EPR es DMEM/F-12, con una composición diferente al DMEM (utilizado en el aislamiento de células de Müller), que contiene piruvato de sodio y glucosa baja.
5. Coloque la placa en una incubadora e incube durante 1,5 a 2 h a 37 °C y 5% de_CO2.
6. Después de la incubación, transfiera los ojos a una placa de Petri de 60 mm que contenga aproximadamente 5 ml de medio de crecimiento de células primarias de Müller completas.

4. Disección

NOTA: Este procedimiento debe llevarse a cabo dentro del ambiente estéril de la campana de cultivo. Por lo tanto, es esencial esterilizar a fondo las superficies de la campana con alcohol al 70%, junto con todas las herramientas y el microscopio de disección. Vale la pena señalar que el video se grabó fuera del capó para una mejor visibilidad y una demostración más clara.

1. Coloque un pequeño trozo de tejido esterilizado de laboratorio en el plato para ayudar a estabilizar los ojos durante la disección. Coloque los ojos bajo un microscopio de disección para comenzar la disección.
   NOTA: El uso de tejido de grado de laboratorio facilita las maniobras de los ojos en un plato lleno de líquido (medio completo), lo que garantiza una disección precisa.
2. Use tijeras Vannas y pinzas estilo M5S para extirpar el tejido conectivo, los músculos extraoculares y el nervio óptico.
   1. Agarre el ojo con pinzas estilo M5S y haga una incisión en la sección de ora serrata con unas tijeras Vannas o una aguja de jeringa.
      NOTA: Hay una línea circular de color azul claro entre la parte anterior y posterior del ojo llamada ora serrata, que se puede usar como punto de referencia para una dirección precisa durante la disección.
   2. Sujete la incisión con pinzas estilo M5S y tire o desgarre la córnea de la parte posterior del ojo. Tire en pequeños incrementos para garantizar que la integridad de la retina permanezca intacta.
      NOTA: Estos pasos consisten en extirpar la parte anterior del ojo (córnea, iris y cristalino) de la parte posterior de la copa del ojo (retinas neurales y pigmentadas).
   3. Para mantener la integridad de las capas de la retina, tire suavemente y retire el epitelio pigmentado de la retina neural. La retina neural debe estar libre de manchas negras para garantizar la pureza del aislamiento tanto como sea posible, ya que la capa de EPR suele ser pegajosa y adherida a la retina neuronal.
   4. Corta la retina neural diseccionada en trozos pequeños antes de recogerla en una placa para asegurar una distribución homogénea de las células en la placa.
3. Coloque las retinas neurales en un matraz T25 que contenga 4 ml de medio de crecimiento primario completo de células de Müller.
4. Por último, coloque el matraz en una incubadora e incube a 37 °C y 5% de_CO2.

5. Cultivo de células gliales primarias de Müller

1. No mueva el matraz durante 3-5 días para promover el crecimiento celular.
2. Cambie el medio después del quinto día y cada dos días a partir de entonces hasta que las células estén confluentes en un 90%.

6. Pasaje de células gliales primarias de Müller

1. Aspire el medio de cultivo celular de Müller, seguido de 2 mL de lavado en PBS, y aspire fuera el PBS. Agregue 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (1x), o lo suficiente para cubrir la placa.
2. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
3. Asegúrese de que las células se separen de la placa bajo el microscopio. A continuación, recoja la suspensión celular y añada 4 ml de medios de crecimiento de células primarias de Müller precalentados (37 °C) (preparados en el paso 1.2) al tubo de recogida.
4. Centrífuga durante 7 min a 300 x g. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio de crecimiento de células primarias de Müller completo. Debido a que el número de células puede variar según la cantidad de ojos disecados, por lo tanto, es mejor contar las células antes de la siembra y la incubación. La densidad de siembra recomendada es de 3,0 x 10⁶ celdas en un matraz T75.
   NOTA: Las celdas se pueden pasar hasta 4-5 veces. Sin embargo, los resultados más consistentes del experimento se encuentran después de 1-2 pasajes.

7. Inmunofluorescencia

NOTA: Utilice el protocolo de inmunofluorescencia para teñir y validar la especificidad de las células de Müller. A continuación, se ofrece una breve descripción del protocolo de inmunofluorescencia. Este paso se realiza después del primer paso¹².

1. Siembre las células en un portaobjetos de cámara de cultivo celular (30.000 células por pocillo para un portaobjetos de cámara de 8 pocillos).
2. Cultivar las células aisladas durante 24-48 h en un medio de cultivo celular Müller completo (preparado en el paso 1.2) a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Aspire el medio y lave el portaobjetos de la cámara con 250-300 μL de 1x PBS en cada pocillo cuando las celdas tengan un 80-90% de confluente.
4. Fije el portaobjetos durante 10 a 15 minutos en 250-300 μL de paraformaldehído al 4% en cada pocillo, seguido de un lavado con PBS/TX-100 (5 min cada uno/3x).
5. Añadir tampón de bloqueo durante 1 h a 37 °C (ver tabla de materiales).
6. Aspire la solución de bloqueo, luego agregue los anticuerpos primarios específicos para las células de Müller para confirmar la pureza de las células aisladas usando glutamina sintetasa y vimentina ^5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando una concentración de anticuerpos de 1:100-1:200 en tampón de bloqueo en un volumen de 150-200 μL/portaobjetos). Lave el portaobjetos con lavados PBS/TX-100 (5 y 10 min cada uno).
   NOTA: Se eligieron estos anticuerpos porque son características distintivas para identificar las células de Müller y garantizar el éxito y la pureza del cultivo de células de Müller.
7. Añadir el anticuerpo secundario (con una concentración de anticuerpos que oscila entre 1:1000 en tampón de bloqueo en un portaobjetos de 150-200 μL) e incubar durante 1 h a 37 °C. A continuación, lavar con PBS/Triton X-100, tres veces (5-10 min cada una).
8. Aplique una gota de medio de montaje DAPI para etiquetar los núcleos antes de cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos. Evite las burbujas de aire al colocar el cubreobjetos.
9. Use un microscopio fluorescente para revisar el portaobjetos y capturar imágenes (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Las celdas se ubican con DAPI a ex/em 359/461 con un aumento de 10x para ubicar las celdas; Un aumento mayor puede capturar células. Otras longitudes de onda dependerían del color elegido. Color verde (GFP)- ex/em 488/510. Color rojo (Cy3)- ex/em 555/569.

Validación de la especificidad, pureza y función de barrera de células Müller aisladas
Para confirmar la viabilidad, la morfología y las cualidades distintivas de las células de Müller aisladas, las células se examinaron bajo un microscopio óptico. Se registraron las imágenes P0 y P1 (Figura 1A). Para comprobar la contaminación de las células de Müller aisladas con células EPR y confirmar su pureza, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) utilizando anticuerpos específicos contra el marcador celular EPR, RPE65. Se utilizaron células pigmentadas de la retina humana (ARPE-19) como control positivo. Las células RPE teñidas con RPE65 (rojo y azul para la tinción nuclear) se muestran en la Figura 1B (panel inferior). Los anticuerpos específicos contra RPE65 no tiñeron las células de Müller aisladas (Figura 1B, panel superior). El hecho de que el RPE65 tiñera las células ARPE-19 (rojo) y no tiñera las células aisladas, indica que las células aisladas no son células EPR. La presencia de piruvato y glucosa baja en el medio establece condiciones desfavorables para el crecimiento de las células EPR. En consecuencia, incluso en el caso de contaminación de las células RPE, eventualmente se desprenderán del matraz.

Además, para confirmar la identidad de las células aisladas, se utilizó una tinción de inmunofluorescencia de células de Müller para marcadores específicos de células de Müller para confirmar el aislamiento exitoso de las células de Müller. Se utilizó la proteína del filamento intermedio del citoesqueleto denominada vimentina12,13. Además, también se utilizó la glutamina sintetasa (GS), que cataliza la reacción de condensación de glutamato y amoníaco para formar glutamina, como una función clave de las células de Müller gliales de la retina5.

En conjunto, las células aisladas dieron negativo para RPE65 (rojo, Figura 1B), positivo para vimentina (verde, Figura 1C) y GS (verde, Figura 1D). La tinción de FI confirma el aislamiento exitoso (pureza y especificidad) de las células de Müller aisladas. En la figura 1E, se muestra un control negativo para vimentina (panel superior) y GS (panel inferior), lo que confirma la especificidad de los anticuerpos.

Figura 1: Validación del aislamiento celular de Müller (pureza y especificidad). (A) Imagen de microscopía óptica para pasajes: paso cero (P0) y (P1) morfología. (B) Inmunotinción de RPE65 combinada con tinción nuclear DAPI. (C) Inmunotinción de vimentina con tinción nuclear DAPI a gran aumento. (D) Inmunotinción de GS con el mismo aumento alto. (E) controles negativos para confirmar la especificidad de la tinción de vimentina y anticuerpos GS. barra de escala = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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