Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Resumen

La principal célula de soporte de la retina es la célula glial de Müller de la retina. Cubren toda la superficie de la retina y están muy cerca tanto de los vasos sanguíneos de la retina como de las neuronas de la retina. Debido a su crecimiento, las células de Müller realizan varias tareas cruciales en una retina sana, incluida la absorción y el reciclaje de neurotransmisores, compuestos de ácido retinoico e iones (como el potasio K+). Además de regular el flujo sanguíneo y mantener la barrera hematorretiniana, también regulan el metabolismo y el suministro de nutrientes a la retina. En este manuscrito se presenta un procedimiento establecido para aislar células primarias de ratón Müller. Para comprender mejor los procesos moleculares subyacentes implicados en los diversos modelos de ratón de trastornos oculares, el aislamiento celular de Müller es un enfoque excelente. Este manuscrito describe un procedimiento detallado para el aislamiento de células de Müller de ratones. Desde la enucleación hasta la siembra, todo el proceso dura unas pocas horas. Durante 5-7 días después de la siembra, no se debe cambiar el medio para permitir que las células aisladas crezcan sin obstáculos. La caracterización celular mediante morfología y distintos marcadores inmunofluorescentes es la siguiente en el proceso. Los pasos máximos para las celdas son de 3 a 4 veces.

Introducción

Las células de Müller (MC) son las principales y más abundantes células gliales que se encuentran en el tejido de la retina. Son los actores clave en el suministro de integridad estructural y funciones metabólicas dentro de la retina¹. La estructura estratégica de los MC se extiende por todo el grosor de la retina, proporcionando así soporte a la retina. Además de sus propiedades de andamio, tienen funciones metabólicas para las neuronas de la retina, suministrándoles sustratos energéticos, como la glucosa y el lactato. Estas funciones son cruciales para mantener una función neuronal saludable. Se ha descrito que el deterioro de las MC contribu....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se ajustaron a la declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y se realizaron siguiendo nuestro protocolo animal aprobado por el Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y las políticas de la Universidad de Oakland (número de protocolo 2022-1160)

1. Preparación de medios y soluciones

1. Prepare la solución oftálmica de células de Müller complementando el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, detalles en la tabla de materiales) con penicilina/estreptomicina en la dilución 1:1000. Por ejemplo, para 10 ml de DMEM, ....

Resultados

Validación de la especificidad, pureza y función de barrera de células Müller aisladas
Para confirmar la viabilidad, la morfología y las cualidades distintivas de las células de Müller aisladas, las células se examinaron bajo un microscopio óptico. Se registraron las imágenes P0 y P1 (Figura 1A). Para comprobar la contaminación de las células de Müller aisladas con células EPR y confirmar su pureza, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) utilizando anticuerpos.......

Discusión

El aislamiento del epitelio pigmentado primario de la retina (EPR) de ratones fue documentado previamente por nuestro laboratorio. Este manuscrito describe un protocolo de demostración detallado para el aislamiento primario de células de Müller. Este procedimiento implica la enucleación, el tratamiento, la disección, la recolección, la siembra, el cultivo y la caracterización de células de Müller aisladas de ojos de ratón. Se basa en un protocolo exitoso que se encontró en publicaciones anteriores y en nuestro protocolo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vaso de precipitados: 100 ml	KIMAX	14000
IV	Worthington
Pipetas de transferencia graduadas desechables: 3,2 ml estériles		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media para cultivar Mü Células de Ller
Suero fetal bovino (FBS)	gibco	26140079	Para medios completos de cultivo celular Muller
Glutamina sintasa	Señalización celular	80636
Heracell VISO 160i Incubadora de CO2	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes Jeringa	Kimberly-Clark	34155
con aguja adjunta 21 G x 1 1/2 pulg., estéril, de un solo uso, 3 ml	B-D
Tubo de microcentrífuga: 2 mL	Grainger	11L819
Pluma Strep	gibco	15140-122	Para Mü Medios de cultivo celular ller
Solución salina de tampón de fosfato (PBS)	Thermo Scientific	J62851.
acción positiva AP, estilo 5/45	Dumont	72703-DZ
Tijeras Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrífuga	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscopio	Zeiss	n/a
Cuchilla quirúrgica, #11, acero inoxidable	Bard-Parker	371211
Plato de cultivo de suspensión 60mm x 15mm Estilo	Corning	430589
Plato de cultivo de tejidos: Estilo 100x20mm	Corning	353003
Tornado Tubos: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubos: 50mL	Midsci	C50R
Pinzas 5MS, 8.2cm, Rectas, 0.09x0.05mm Puntas	Dumont	501764
Pinzas de acción positiva estilo 5, biológicas, dumostar, acabado pulido, 110 mm OAL	Microscopía electrónica Dumont	50-241-57
Underpads, moderadas: 23" X 36"	McKesson	4033
Tijeras de resorte Vannas - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a

de colagenasa LS004188 Luer-Lok 309577Pinzas de