La detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real es un método sensible y preciso para diagnosticar y controlar la infección por el VHB. Aquí, presentamos un protocolo para la detección de ADN del VHB y la medición de la carga viral de una muestra.
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Artículo de método
Detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
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Resumen
Resumen
El virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de enfermedad hepática en todo el mundo. Puede provocar infecciones agudas o crónicas, lo que hace que las personas sean muy susceptibles a la cirrosis mortal y al cáncer de hígado. La detección y cuantificación precisas del ADN del VHB en la sangre son esenciales para el diagnóstico y el seguimiento de la infección por el VHB. El método más común para detectar el ADN del VHB es la PCR en tiempo real, que se puede utilizar para detectar el virus y evaluar la carga viral para monitorear la respuesta a la terapia antiviral. Aquí, describimos un protocolo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD. El kit utiliza cebadores y sondas que se dirigen a la región central altamente conservada del genoma del VHB y pueden cuantificar con precisión todos los genotipos del VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I y J). El kit también incluye un control interno endógeno para monitorizar la posible inhibición de la PCR. Este ensayo tiene una duración de 40 ciclos y su punto de corte es de 38 Ct. Para la cuantificación del ADN del VHB en muestras clínicas, se proporciona un conjunto de 5 patrones de cuantificación con el kit. Los patrones contienen concentraciones conocidas de ADN específico del VHB que están calibradas con respecto al4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Los patrones se utilizan para validar la funcionalidad de la amplificación de ADN específica del VHB y para generar una curva estándar, que permite la cuantificación del ADN del VHB en una muestra. El ADN del VHB tan bajo como 2,5 UI/ml se detectó utilizando el kit de PCR. La alta sensibilidad y reproducibilidad del kit lo convierten en una poderosa herramienta en los laboratorios clínicos, ayudando a los profesionales de la salud a diagnosticar y manejar eficazmente las infecciones por VHB.
Introducción
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN parcialmente bicatenario del género Orthohepadnavirus y de la familia Hepadnaviridae 1. Puede desencadenar una infección crónica que persiste durante toda la vida, lo que puede conducir a cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular 2,3,4. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que en 2019 una población de 296 millones de personas vivía con una infección crónica por hepatitis B, y 1,5 millones de personas se infectaban cada año5.
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Protocolo
En este estudio no participaron participantes humanos ni muestras clínicas. El único material biológico utilizado fue el4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Esta norma es un material de referencia disponible públicamente que no contiene ninguna información personal ni datos identificables. Por lo tanto, no se requirió aprobación ética para este estudio.
1. Extracción de ADN
- Extraer el ADN viral de una muestra de suero o plasma humano. Almacenar el ADN extraído a -20 °C hasta su uso posterior en PCR.
NOTA: El volumen recomendad....
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Resultados
En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático del flujo de trabajo para detectar y cuantificar el ADN del VHB a partir de plasma/suero humano. En la Figura 2 se muestra un gráfico de amplificación del Estándar 2 (utilizado como PC) y NTC tanto para el VHB como para el CI. La Figura 3 muestra las curvas de amplificación para una muestra positiva para el VHB, una muestra negativa para el VHB y una muestra con inhibición por PCR. E.......
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Discusión
Al código NIBSC 10/266 se le ha asignado una unidad de 9,55.000 UI/mL cuando se reconstituye en 0,5 mL de agua libre de nucleasa, según la información del proveedor21. Esto puede considerarse una muestra positiva para el VHB de alta carga. La carga viral del VHB determinada por el kit de carga viral utilizado en este estudio fue de 6,65,900 UI/mL (Figura 4). Como la eficiencia de extracción de ADN de cualquier kit de extracción de ADN no es del 100%, a menudo se pierd.......
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Divulgaciones
Los autores están asociados con Kilpest India Limited, el fabricante del kit de carga viral del VHB utilizado en este estudio.
Agradecimientos
Agradecemos a Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita y Shikha por su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4th Norma internacional de la OMS para el virus de la hepatitis B ADN | NIBSC | Código nibsc: 10/266 | La 4ª Norma Internacional de la OMS para el ADN del virus de la hepatitis B (VHB), código NIBSC 10/266, está destinada a ser utilizada para la calibración de reactivos secundarios de referencia utilizados en las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) del VHB. |
| Máquinas de PCR en tiempo real ABI | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | Esta es una máquina de PCR en tiempo real |
| VHB, VHC y VIH Multiplex 14/198 | NIBSC | Código NIBSC: 14/198 | Este es un reactivo triplex de muy baja positividad para ensayos NAT que contienen hepatitis B (VHB), hepatitis C (VHC) y virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) |
| Máquina de PCR en tiempo real QIAGEN | Qiagen | Rotor-Gene Q | Esta es una máquina de PCR en tiempo real |
| Kit de carga viral TRUPCR HBV | Kilpest India Limited | 3B294 | Este es un kit basado en PCR en tiempo real utilizado en este estudio para la detección de ADN del VHB y la determinación de la carga viral |
| TRUPCR Kit de extracción de ácido nucleico viral | Kilpest India Limited | 3B214 | Este es un kit de extracción de ADN utilizado para la extracción de ADN viral del VHB de NIBSC: 10/266 y NIBSC: 14/198 |
Referencias
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....
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Reimpresiones y permisos
