Validación preliminar de las coordenadas de inyección estereotáxica mediante criosección

Resumen

El presente protocolo describe una estrategia práctica para acelerar la etapa de verificación de las coordenadas de inyección estereotáxica antes de realizar el rastreo viral utilizando tintes y secciones congeladas.

Resumen

La inyección estereotáxica de una región específica del cerebro constituye una técnica experimental fundamental en la neurociencia básica. Los investigadores suelen basar su elección de los parámetros de inyección estereotáxica en atlas cerebrales de ratón o en materiales publicados que empleaban varias poblaciones/edades de ratones y diferentes equipos estereotáxicos, lo que requiere una mayor validación de los parámetros de coordenadas estereotáxicas. La eficacia de las manipulaciones de imágenes de calcio, quimiogenéticas y optogenéticas se basa en la expresión precisa de los genes indicadores dentro de la región de interés, lo que a menudo requiere varias semanas de esfuerzo. Por lo tanto, es una tarea que requiere mucho tiempo si las coordenadas de la región del cerebro objetivo no se verifican de antemano. Utilizando un tinte apropiado en lugar de un virus e implementando la criosección, los investigadores pueden observar el sitio de inyección inmediatamente después de la administración del tinte. Esto facilita los ajustes oportunos de los parámetros de coordenadas en los casos en que existan discrepancias entre el sitio de inyección real y la posición teórica. Dichos ajustes mejoran significativamente la precisión de la expresión viral dentro de la región objetivo en experimentos posteriores.

Introducción

Casi todas las herramientas modernas de neuromodulación, incluido el registro de calcio in vivo, las herramientas optogenéticas y quimiogenéticas, requieren el uso de coordenadas estereotáxicas para dirigirse al área de interés del cerebro ^1,2,3, formando la base de la manipulación neuronal. Las coordenadas estereotáxicas para las regiones del cerebro del ratón se definen en relación con bregma y lambda, los puntos de referencia óseos en el cráneo, que forman el llamado sistema de coordenadas estereotáxica derivado del cráneo. Tanto el bregma como la lambda pueden servir como punto cero de las coordenadas tridimensionales. Los tres ejes son anteroposterior (AP), mediolateral (ML) y dorsoventral (DV), que representan los ejes y, x y z en la visualización digital de los instrumentos estereotáxicos. Para regiones cerebrales bien conocidas, los parámetros de coordenadas estereotáxicas de un área específica se pueden obtener de los atlas del cerebro del ratón⁴ (por ejemplo, el cerebro del ratón de Paxinos y el cerebro del ratón de Franklin en coordenadas estereotáxicas) y/o de la literatura publicada ^5,6. Sin embargo, es necesaria una mayor validación debido a las variaciones en el equipo estereotáxico y la edad/poblaciones de ratones utilizados por diferentes investigadores.

La estructura es la base de la función. Los circuitos neuronales forman la base de muchas funciones cerebrales, como las actividades cognitivas, la emoción, la memoria,^{las funciones} sensoriales y motoras. Etiquetar la estructura y manipular la actividad de los circuitos neuronales es vital para comprender la función de un circuito neuronal específico. En las últimas décadas, los rastreadores neuronales han evolucionado a lo largo de muchas generaciones; Las primeras investigaciones adoptaron la aglutinina de germen de trigo (WGA) y la aglutinina de phaseolus vulgaris (PHA) como trazadores anterógrados, y fluorogold (FG), subunidad B de la toxina del cólera (CTB) y carbocianina como trazadores retrógrados. Sin embargo, a diferencia de los trazadores virales, estos trazadores neuronales tradicionales no pueden integrar genes exógenos en el huésped, ni tienen selectividad del tipo de célula. Hoy en día, la estrategia viral se ha convertido en una propuesta importante durante la investigación básica en neurociencia. Para diferentes propósitos de investigación, se pueden seleccionar varias herramientas virales ^7,8. Hay virus no transsinápticos, virus transsinápticos (retrógrados y anterógrados) y virus transmonosinápticos (retrógrados y anterógrados). Cada categoría contiene varios tipos con características respectivas.

El proceso de administración y expresión viral requiere mucho tiempo y recursos, y a menudo tarda semanas o incluso más. Entre varios vectores virales, el virus adenoasociado ha sido identificado como un medio prometedor para la entrega de genes, proporcionando una amplia ventana que va de 3 a 8 semanas después de la inyección para el procedimiento experimental ^7,8. A medida que la VAA evoluciona, el análisis se puede realizar 2-3 semanas después de la administración ^9,10. Otros trazadores de circuitos neuronales, como el virus de la pseudorrabia (PRV) y el virus de la rabia (RV), también requieren un período de rastreo de al menos 2-7 días 11,12,13,14,15. Por lo tanto, una verificación preliminar del lugar de inyección antes de observar las señales de fluorescencia es rentable y en términos de tiempo.

Para facilitar una verificación sencilla y rápida de las inyecciones estereotáxicas, en este estudio, se administra un tinte antes de los vectores virales, y la criosección permite a los investigadores observar el lugar de la inyección y rastrearlo dentro de los 30 minutos posteriores a la inyección.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Informes de Investigación en Animales (ARRIVE) y la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad. Los animales fueron obtenidos comercialmente (ver Tabla de Materiales) y alojados en jaulas estándar (22 °C ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, alimento y agua ad libitum).

1. Selección de las regiones cerebrales objetivo

NOTA: Este es un procedimiento estéril. Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos estén esterilizados. Rocíe los guantes con alcohol antes de entrar en contacto con instrumentos quirúrgicos. Evite tocar la punta de los instrumentos o el área quirúrgica con guantes. Asegúrese de que el ratón esté adecuadamente anestesiado antes de comenzar el procedimiento comprobando si hay pérdida de reflejos de enderezamiento y ausencia de respuesta a la estimulación cutánea. Antes de la perforación y la inyección, controle de cerca la frecuencia respiratoria (60-220 respiraciones por minuto, promedio de 100-150 respiraciones por minuto) y la amplitud respiratoria (debe ser constante y no excesivamente superficial o profunda). Se debe anotar cualquier cambio significativo en la frecuencia o amplitud respiratoria.

1. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 1,25% (250 mg/kg) con una aguja de 29 G. Afeita el vello del cráneo una vez que desaparezca el reflejo de enderezamiento. Asegure el ratón en el marco estereotáxico (consulte la tabla de materiales) fijando los incisivos superiores con una pinza nasal y estabilizando la cabeza con dos barras para las orejas.
2. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular. Desinfecte el cuero cabelludo frotándolo tres veces con Anerdian (solución desinfectante; ver Tabla de Materiales). Inyecte 0,2 mL de lidocaína al 1% por vía subcutánea con una aguja de insulina de 29 g para proporcionar analgesia local.
3. Haga una incisión de 0,5 cm con unas tijeras oculares para exponer el cráneo. Utilice un hisopo de algodón humedecido con 3% H₂O₂ para frotar el cráneo expuesto y eliminar el periostio. Deja que el cráneo se seque.
4. Fije el taladro al instrumento estereotáxico. Con la ayuda de una lupa, ajuste los pomos de los brazos estereotáxicos para posicionar la punta del taladro con precisión en el bregma y registre el valor del eje z mediante la pantalla digital LCD.
   1. Ajuste las perillas y coloque la punta del taladro en la lambda y registre el valor del eje z. Ajuste la pinza nasal y las barras de la oreja para acercar dos valores z y repita los pasos anteriores hasta que la diferencia entre los dos valores z sea inferior a 0,1 mm.
      NOTA: Los ejes x, y y z de la pantalla digital LCD corresponden a los segmentos mediolateral (ML), anteroposterior (AP) y dorsoventral (DV), respectivamente. Se puede considerar que el bregma y la lambda están en el mismo plano horizontal una vez que la diferencia entre los dos valores z es inferior a 0,1 mm.
5. Asegure la nivelación izquierda-derecha del cerebro. Ajuste las barras de los oídos unidas al marco estereotáxico con la misma escala. Tomemos como ejemplo el núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral (LDTgV); sus coordenadas estereotáxicas son -5,2 para x, +0,8 para y, -4,0 para z, según el atlas cerebral de ratón¹⁶ de Paxinos y Franklin.
   1. Ajuste la barra de la oreja para hacer el taladro a (-5.2, +0.8) para medir el valor z en la dirección dorsal-ventral y mueva el taladro a (-5.2, -0.8) para medir el valor z.
      NOTA: Se considera que la izquierda-derecha está en el mismo nivel cuando la diferencia entre los dos valores z es inferior a 0,2 mm. Las barras de la oreja deben insertarse en el lugar correcto porque el meato auditivo externo es simétrico. Si la diferencia entre los dos valores z es superior a 0,5 mm, es posible que la barra de la oreja esté insertada en el lugar equivocado.
6. Vuelva a colocar el taladro en el bregma y ajuste tres coordenadas en la pantalla digital LCD a cero. Coloque el taladro por encima de la región de interés utilizando coordenadas de referencia. Inicie el simulacro.
   1. Baje gradualmente el taladro con el brazo vertical hasta que penetre en el cráneo. Limpie los escombros y la sangre con hisopos de algodón.
      NOTA: Tenga cuidado de no dañar el tejido cerebral.

2. Preparación de la solución de tinte y microinyección cerebral

1. Tome 25 μL de tampón de carga SDS-PAGE que contiene azul de bromofenol (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga de 200 μL. Añadir 50 μL de ddH₂O al tubo para preparar la solución de colorante.
2. Cubra la ventana craneal con una almohadilla de algodón humedecida con solución salina. Asegure la permeabilidad de la microjeringa aspirando y expulsando solución salina repetidamente. Cargue 0,3 μL de tinte en la microjeringa. Conecte la jeringa y el microinyector estereotáxico motorizado al brazo estereotáxico.
3. Coloque la punta de la jeringa en el bregma y ajuste las coordenadas a cero en la pantalla digital LCD. Ajuste la aguja en la región de interés de acuerdo con las coordenadas de referencia. Ajuste la velocidad de inyección a 0,1 μL/min y ponga en marcha el microinyector motorizado, suministrando 0,3 μL de tinte azul en la región objetivo. Deje la jeringa en su posición durante al menos 10 minutos antes de retirar lentamente el inyector.
   NOTA: Se pueden usar tintes de diferentes colores en los mismos ratones para distinguir regiones cercanas. Pruebe otros tintes para obtener concentraciones adecuadas en función de sus propiedades físicas. Se recomienda usar la fórmula de azul de bromofenol y enjuagar bien la jeringa antes y después de usarla para evitar obstrucciones. Ajuste los volúmenes de inyección en función de la difusión del tinte.

3. Recolección y criosección de tejido cerebral

1. Suelte el ratón del marco estereotáxico. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico con una aguja de 29 G. Asegure el mouse en un tablero de espuma con cinta adhesiva.
2. Abra ambos lados del tórax para inducir una asfixia rápida. Realice una incisión de 1-2 mm en el apéndice auricular derecho. Inserte una aguja de infusión en el ventrículo izquierdo. Infundir 20 mL de solución salina preenfriada y 20 mL de solución helada de paraformaldehído al 4%.
3. Decapitar al ratón con tijeras de disección de tejido (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Retire la piel haciendo una incisión a lo largo de la línea media desde el cuello hasta la nariz y luego exponga el cráneo. Limpie el músculo residual del cráneo con fórceps o tijeras.
4. Coloque la punta de una hoja de la tijera fina entre el foramen magnum y el cerebro, con el borde afilado hacia el hueso, en el extremo rostral de la sutura sagital media. Proceda a deslizar y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital media. Emplea fórceps para extraer el cráneo, revelando el cerebro expuesto.
   NOTA: Tenga cuidado para evitar causar cualquier daño al cerebro durante la operación. Antes de quitar las astillas de hueso, retire con cuidado cualquier meninge que pueda estar adherida al cráneo. Esta precaución es crucial para evitar el corte involuntario del tejido cerebral durante el proceso.
5. Encienda el criostato de micrótomo rotatorio (consulte la Tabla de materiales) y ajuste la temperatura de la cámara a -20 °C. Vierta un poco de compuesto OCT para cubrir la superficie del disco de muestra de manera uniforme. Colóquelo en la cámara criogénica y deje que la OCT se solidifique.
6. Fije el disco a la cabeza de la muestra. Acerque la cuchilla al bloque y recorte el bloque OCT para hacer un plano paralelo al disco.
7. Corte el cerebro en dirección coronal, lejos del sitio de inyección, en un molde de corte de cerebro con una cuchilla de afeitar. Coloque el tejido cerebral que contiene el sitio de inyección con el lado cortado hacia abajo en el plano OCT.
   1. Vierta OCT en el cerebro y coloque el disco en la cámara criogénica, permitiendo que el bloque de muestras se solidifique. Vierta OCT repetidamente en el cerebro hasta que el cerebro esté completamente integrado con OCT.
      NOTA: Agregue el compuesto OCT capa por capa. Una vez que la capa anterior de OCT esté congelada, vierta la capa posterior de compuesto de OCT en el cerebro.
8. Recorte el bloque de muestras hasta que se acerque la región objetivo. Haga varias secciones desde el nivel del sitio de inyección. Recoja los cortes de cerebro coronal en una placa de 6 pocillos que contenga PBS a temperatura ambiente utilizando un pincel de escritura pequeño mantenido a -20 °C.
   NOTA: Ajuste el grosor de corte a uno mayor para recortar el bloque y, a continuación, ajuste el grosor de corte a 40 μm a medida que la cuchilla se acerque al lugar de inyección. Si se utilizan trazadores de circuitos neuronales, los ratones no se sacrifican inmediatamente. Coloque al ratón en una jaula estéril de recuperación postoperatoria sobre una manta térmica para recuperarse de la anestesia. Regresa los ratones a la jaula original o a una jaula nueva una vez que estén despiertos.

4. Imágenes

1. Lave el OCT con PBS a temperatura ambiente. Use un pincel para recoger secciones del cerebro y colocarlas en un portaobjetos. Deje que las secciones se sequen al aire a temperatura ambiente.
2. Observe visualmente la región inyectada o use un microscopio cuando los núcleos objetivo sean minúsculos. Compara la ubicación del tinte inyectado con la región correspondiente en el atlas cerebral.
   NOTA: Ajuste los valores de los ejes x, y y z de acuerdo con la dirección y la distancia de la desviación del punto de inyección. Puede ser necesario repetir todos los pasos de este protocolo varias veces para determinar las coordenadas con precisión.

Resultados

Este estudio identificó con éxito el lugar de inyección en 30 minutos utilizando el método demostrado. Inicialmente, se inyectó una solución de carga de muestras SDS-PAGE que contenía azul de bromofenol en el LDTgV en los ratones C57/BL. La Figura 1A muestra una representación esquemática de la inyección de la solución de colorante. La distribución del tinte azul en el LDTgV se ilustra en la Figura 1B.

También se inyectó azul de bromofenol en la corteza prelímbica de mPFC, la corteza infralímbica de mPFC y la amígdala basomedial (BMA) para evaluar la universalidad de este protocolo. Como se muestra en la Figura 1C-E y la Figura 2A, el tinte azul se distribuyó en la corteza prelímbica de la CPFm, la corteza infralímbica de la CPFm y la BMA.

Además, se inyectó en el LDTgV un virus adenoasociado portador de una proteína mCherry fluorescente (las coordenadas se verificaron utilizando la solución de colorante). La expresión del virus tardó cuatro semanas. La distribución de las neuronas mCherry+ en el LDTgV se muestra en la Figura 2B.

Figura 1: Inyección de solución de colorante. (A) Un diagrama esquemático de la inyección de solución de colorante. (B) Distribución del colorante azul en LDTgV. (C) Distribución del colorante azul en la corteza prelímbica mPFC. (D) Distribución del tinte azul en la corteza infralímbica mPFC. (E) Distribución del tinte azul en BMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Distribución del colorante azul y distribución de mCherry vistos bajo el microscopio. (A) Distribución del colorante azul en la corteza prelímbica mPFC (aumento de 10x, barra de escala = 500 μm). (B) Imagen representativa de la distribución de mCherry en la región LDTgV adquirida por microscopía fluorescente (aumento de 10x, barra de escala = 500 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este artículo se describe una estrategia estable para verificar la precisión de las inyecciones cerebrales estereotáxicas ^5,6 de forma más rápida y sencilla antes del rastreo viral, pero el aspecto insustituible de la expresión del gen reportero en la región cerebral es crucial para el etiquetado de la región cerebral. El tinte azul que utilizamos permitió la visualización inmediata del lugar de la inyección.

Varios pasos críticos en este protocolo contribuyen a mejorar la precisión del sitio de inyección. En primer lugar, asegurar la nivelación izquierda-derecha del cerebro en el instrumento estereotáxico desde el paso 1.5; Este paso requiere que los operadores estén familiarizados con la anatomía del cráneo, asegurándose de que las barras de las orejas estén colocadas en la posición correcta. Las escalas de las orejeras y el marco estereotáxico también sirven como referencias. En segundo lugar, encontrar el punto cero exacto, el bregma, en los pasos 1.6 y 2.3. Ocasionalmente, una discrepancia significativa en las coordenadas encontradas en los pasos 1.6 y 2.3 se debe a una diferencia considerable en el posicionamiento del punto cero. Esto puede resultar en que la aguja del microinyector no pueda penetrar en la ventana craneal. En tales casos, es necesario reposicionar el punto cero y, si es necesario, se debe crear una nueva ventana craneal. A pesar de ello, sigue siendo imprescindible restablecer el punto cero y encontrar de nuevo las coordenadas en el paso 2.3; No se puede insertar directamente la microjeringa desde la ventana craneal previamente fabricada.

En comparación con cortar un cerebro no congelado en un molde de corte de cerebro de ratón, esta estrategia proporciona un resultado más preciso porque el bloque de muestra sólida evita que la cuchilla apriete el cerebro y haga que el tinte se desplace de los puntos de inyección. Además, las secciones del cerebro cortadas por un molde de corte de cerebro son relativamente más gruesas y no son factibles de localizar núcleos cerebrales pequeños. Sin embargo, en comparación con el proceso estándar de criosección de tejido cerebral 11,12,13,14,15, acortamos la duración del procesamiento en al menos 72 h al omitir los pasos de deshidratación, lo que resultó en que las secciones del cerebro fueran más frágiles y más difíciles de recoger en un portaobjetos de vidrio, lo que representa una debilidad importante de este protocolo.

Al hacer las ventanas craneales para la inyección de tinte, sujetar el taladro dental firmemente al brazo estereotáxico, en lugar de sostenerlo con la mano, facilita el control de la profundidad de perforación con la perilla de ajuste fino, lo que reduce la posibilidad de dañar el tejido cerebral.

En conclusión, este estudio ha proporcionado un método prometedor para verificar preliminarmente las coordenadas estereotáxicas exactas antes del rastreo viral, lo que hace que el posterior proceso de etiquetado y rastreo de neuronas sea más confiable.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.0 y micro; L, Jeringa Neuros, Modelo 7001 KH, 32 G, Punta Estilo 3	Hamilton	65458-01
200 μ Puntas de pipeta	L biosharp	BS-200-T
Jeringa de 20 ml	del grupo
Placa de 6 pocillos de	Lircon Company
Anerdian	Likang Placa antivuelco de alta tecnología	31001002
	Leica	14047742497
jeringa	Becton,Dickinson and Company	328421
Pinza de disección con dientes doblados	Jinzhong	JD1050
Cellsens software de dimensiones	Olympus
Hisopo de algodón	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Taladro	Longxiang
Cepillos finos	HWAHONG
Tijeras finas	Jinzhong	y00030
Microscopía fluorescente	Olympus	BX63
micrótomo de congelación	Leica	CM1950
Pinzas hemostáticas rectas con diente	Jinzhong	J31010
Aguja de infusión 0,7 mm	Grupo Kindly
Inyección de clorhidrato de lidocaína	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Lupa	M& G Chenguang Papelería
Macho C57 / BL	ratones El Instituto de Investigación de Planned Parenthood de Shanghai– BK Laboratorio
Ratones molde de corte de cerebro coronal	RWD Life Science	68713
Tubo de microcentrífuga	Biosharp	BS-02-P Cuchillas
micrótomo	Leica	819
Pomada oftálmica	Cisen Pharmaceutical Company G23HDM9M4S5
paraformaldehído	Biosharp	BL539A
Bombas peristálticas	Harvard Apparatus	70-4507
Solución salina tamponada con fosfato	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μ L	thermofisher	4642080
SDS-PAGE Carga de muestras que contiene azul de bromofenol	Beyotime	P0015A
Cuchillas de afeitar	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Aparato estereotáxico	RWD Life Science	68807
Pinza de disección de dientes rectos	Jinzhong	JD1060
Soporte de jeringa	RWD Life Science	68206
Tijeras de papel	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compuesto	Sakura	4583
Tribromoetanol	Aibei Biotechnology	M2910