Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.
Artículo de método
Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra es un organismo modelo intrigante conocido por su notable capacidad de regeneración cardíaca. El estudio de la contracción del corazón in vivo es esencial para obtener información sobre los cambios estructurales y funcionales en respuesta a las lesiones. Sin embargo, la obtención de imágenes de alta resolución y alta velocidad en 4 dimensiones (4D, 3D espacial + 1D temporal) del corazón del pez cebra para evaluar la arquitectura cardíaca y la contractilidad sigue siendo un desafío. En este contexto, se utiliza un microscopio de lámina de luz (LSM) interno y un análisis computacional personalizado para superar estas limitaciones técnicas. Esta estrategia, que implica la construcción del sistema LSM, la sincronización retrospectiva, el seguimiento de una sola célula y el análisis dirigido por el usuario, permite investigar la microestructura y la función contráctil en todo el corazón a la resolución de una sola célula en las larvas de pez cebra transgénicas Tg (myl7: nucGFP ). Además, somos capaces de incorporar aún más la microinyección de compuestos de moléculas pequeñas para inducir lesiones cardíacas de forma precisa y controlada. En general, este marco permite rastrear los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, así como la mecánica regional a nivel de una sola célula durante la morfogénesis y la regeneración cardíacas.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo, la fisiología y la reparación cardíaca debido a su transparencia óptica, trazabilidad genética y capacidad regenerativa 1,2,3,4. En el caso del infarto de miocardio, si bien los cambios estructurales y funcionales impactan la eyección cardíaca y la hemodinámica, las limitaciones técnicas continúan dificultando la capacidad de investigar el proceso dinámico durante la regeneración cardíaca con la alta resolución espacio-temporal. Por ejemplo, los métodos convencionales de imagen, como la microscopía confocal, tienen limitaciones en cuanto a la profundidad de la imagen, la resolución temporal o la fototoxicidad para capturar los cambios dinámicos y evaluar la función contráctil cardíaca durante múltiples ciclos cardíacos5.
La microscopía de lámina de luz representa un método de imagen de última generación que aborda con éxito estos problemas al barrer rápidamente el láser a través del ventrículo y la aurícula del corazón, logrando imágenes detalladas con una resolución espacio-temporal mejorada y efectos foto-blanqueadores y fototóxicos insignificantes 6,7,8,9,10,11.
Este protocolo introduce una estrategia integral de imágenes que incluye la construcción del sistema LSM, la reconstrucción de imágenes 4D, el seguimiento celular en 3D y el análisis interactivo para capturar y analizar la dinámica de los cardiomiocitos en todo el corazón durante múltiples ciclos cardíacos12. El sistema de imágenes personalizado y la metodología computacional permiten rastrear la microestructura miocárdica y la función contráctil a nivel de una sola célula en larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP). Además, se administraron compuestos de moléculas pequeñas en los embriones mediante microinyecciones para evaluar la lesión cardíaca inducida por fármacos y la posterior regeneración. Esta estrategia holística proporciona un punto de entrada para investigar in vivo las propiedades estructurales, funcionales y mecánicas del miocardio a nivel de una sola célula durante el desarrollo y la regeneración cardíaca.
Protocolo
La aprobación de este estudio fue otorgada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas en Dallas, bajo el número de protocolo #20-07. Para el presente estudio se utilizaron larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP) 12. Toda la adquisición de datos y el post-procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando software de código abierto o plataformas con licencias de investigación o educativas. Los recursos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.
1. Cría de pez cebra y microinyección de embriones
Duración: 2 días
- Mantener y criar peces cebra adultos a través de procedimientos estándar de cuidado y cría. Para conocer los métodos detallados, véase el informe anterior13.
- Realizar la microinyección siguiendo el protocolo establecido14. Para el presente estudio, la microinyección se realizó en la etapa 1-2 de células (cigoto).
NOTA: Es crucial identificar con precisión esta etapa para una microinyección efectiva y garantizar la consistencia del desarrollo. Durante la etapa de una célula, se forma una pequeña cúpula en la parte superior de la yema, y esta etapa suele durar aproximadamente 12 minutos. Al progresar a la etapa de dos células, dos cúpulas adyacentes se hacen visibles, y esta etapa dura durante aproximadamente 45 minutos después de la fertilización15. Se puede encontrar información más detallada sobre la construcción del sistema en otros informes o protocolos 12,16,17.
2. Preparación y montaje de embriones/larvas de pez cebra
Duración: 7 días
- Transfiera los embriones 1 día después de la fertilización (dpf) a agua E3 con 0,2 mM de 1-fenil-2-tiourea (PTU) (ver Tabla de materiales) para evitar la formación de pigmento.
- Reemplace el medio con agua fresca E3 con PTU todos los días hasta la obtención de imágenes LSM.
- Tome imágenes de embriones o larvas con el microscopio estereoscópico para registrar su desarrollo en los puntos de tiempo deseados entre 0 y 7 dpf.
- Preparar tubos segmentados de etileno propileno fluorado (FEP) con un diámetro interior de 2 mm para incluir larvas de pez cebra bajo el sistema LSM12.
NOTA: El tubo FEP se utiliza para asegurar la muestra con materiales que coincidan con el índice de refracción y que se parezcan mucho al medio circundante, como el agua. - A partir de 3 dpf, transfiera los peces a una solución de 150 mg/L de tricaína (MS-222) (consulte la Tabla de materiales) para inmovilizar a los peces antes de la toma de imágenes.
- Preparar agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 % con 150 mg/L de tricaína y utilizar una pipeta de transferencia para trasladar el pescado anestesiado a la agarosa una vez que se haya enfriado a temperatura ambiente18.
- Utilice otra pipeta de transferencia para montar los peces con agarosa en tubos FEP (Figura 1).
NOTA: Para determinar el estrés mínimo en los embriones en desarrollo, se realizaron exámenes de la actividad cardíaca antes y después de la fijación, como la frecuencia cardíaca, bajo observación microscópica. Estas evaluaciones tuvieron como objetivo identificar cualquier diferencia significativa antes y después de la anestesia con tricaína. También se podría realizar un examen adicional de la piel y la musculatura para detectar irregularidades en la estructura cardíaca, como edema, después de la fijación. La concentración de tricaína también juega un papel crucial en la obtención de imágenes cardíacas19 y, por lo tanto, la solución de tricaína de concentración de 150 mg/L se utilizó para la obtención de imágenes de la contracción en larvas de pez cebra en este proyecto. Si bien la sincronización retrospectiva actual nos permite abordar los latidos cardíacos irregulares20, aún se está desarrollando una solución integral para la obtención de imágenes 4D de arritmias cardíacas y la obtención de imágenes a largo plazo en el pez cebra.
3. Configuración y configuración del sistema de imágenes de hoja de luz
Tiempo: 3-14 días
- Construya un sistema LSM interno basado en una lente cilíndrica utilizando sistemas láser de estado sólido bombeados por diodos de onda continua (DPSS) en longitudes de onda específicas, como 473 nm y 532 nm, como fuentes de iluminación (Figura 2A).
- Personalice los códigos de control de LabVIEW (ver Tabla de Materiales) para la sincronización de la etapa de muestra traslacional, la iluminación de la hoja de luz y la exposición de la cámara sCMOS para capturar secuencias de imágenes.
NOTA: Se puede encontrar información más detallada de la construcción del sistema en otros informes o protocolos 12,16,17. Alentamos a los grupos de investigación a buscar oportunidades de colaboración con laboratorios que posean experiencia establecida en imágenes ópticas durante la construcción del sistema.
4. Preparación de imágenes de pez cebra y recopilación de datos
Duración: 1 día
- Calibra la resolución espacial del sistema LSM y minimiza la variación de la opacidad a diferentes profundidades midiendo las perlas de fluorescencia.
- En primer lugar, diluir las perlas fluorescentes (véase la tabla de materiales) que tengan un diámetro de 0,53 μm a una concentración de 1:1,5 x 105 utilizando agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 % y transferir la solución al tubo de FEP segmentado.
- En segundo lugar, utilice el sistema LSM para obtener imágenes de las cuentas y medir la función de dispersión de puntos (PSF) en toda la muestra, validando la resolución espacial y la alineación del sistema12.
NOTA: En este sistema, el análisis de los resultados representativos para todo el ancho a la mitad del máximo (FWHM) indica resoluciones laterales y axiales de 1,26 ± 0,15 y 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 cuentas), respectivamente. Esto sugiere una resolución espacial consistente en toda la profundidad de la imagen.
- Fije el tubo FEP con la larva de pez cebra montada de forma segura a la etapa de muestra motorizada de 6 ejes (x, y, z, cabeceo, guiñada y balanceo) y sumerja los tubos en la cámara de muestra llena de agua E3. Para evitar la dispersión de la luz por el saco vitelino y ubicar mejor la posición del corazón, gire la larva de pez cebra para tomar la imagen desde el lado ventral (Figura 2B). En este caso, la mayoría de las imágenes capturadas incluirían tanto el ventrículo como la aurícula (Figura 2C).
NOTA: Dado que los procedimientos actuales de obtención de imágenes suelen durar menos de una hora por pez y se realizan en un entorno de temperatura ambiente controlada, el control de la temperatura de la cámara y la regulación del nivel de oxígeno se consideran opcionales para este proyecto. Sin embargo, para los estudios de imágenes time-lapse a largo plazo, en particular los centrados en los procesos de desarrollo, se sugiere un control continuo de la temperatura y una regulación a 27 °C dentro de la cámara de muestras para garantizar el entorno fisiológico del pez cebra y prevenir cualquier posible anomalía del desarrollo. - Conecte la platina de muestra motorizada a la estación de trabajo y configure todos los parámetros necesarios, incluido el modo de movimiento deseado.
- Establezca una conexión entre la cámara sCMOS y la estación de trabajo. Ajuste todos los ajustes esenciales, como un tiempo de exposición de 5 ms y la región de interés deseada.
- Configure el número de secuencias de imágenes y fotogramas dentro del programa de control personalizado de LabVIEW.
- Encienda el láser e inicie la obtención de imágenes LSM de la muestra. Mantenga el proceso hasta que todas las secuencias de imágenes se hayan grabado correctamente.
- Grabe 300 fotogramas como una secuencia de imágenes 2D para cubrir de 3 a 5 ciclos cardíacos de la larva con una velocidad de fotogramas de 200 fotogramas por segundo. El registro capta la contractilidad cardíaca en el plano selectivo iluminado por la lámina de luz.
- Mueva la larva con un tamaño de paso de 1 μm a través de la iluminación de la lámina de luz para cortar virtualmente la muestra.
NOTA: El tamaño del paso de la etapa de muestra debe establecerse en función de la resolución axial del sistema de lámina de luz, siguiendo el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon12. - Repita el paso 7 para grabar otra secuencia de imágenes del nuevo corte de muestra hasta que se cubra todo el corazón. Generalmente, 100-200 secuencias de imágenes con un tamaño de paso de 1 μm aseguran la cobertura de todo el corazón de una larva de pez cebra (Figura 2D).
NOTA: Los pasos 4.7-4.9 son controlados por el programa LabVIEW y realizados automáticamente por el sistema LSM (Figura 3). Dado el gran volumen de datos de imagen generados, se recomienda una convención de nomenclatura estandarizada para las secuencias de imágenes. Por ejemplo, designe carpetas con nombres como "z-1", "z-2", etc., para clasificar los datos en varias secuencias de imágenes. Dentro de cada secuencia, las imágenes deben nombrarse secuencialmente (por ejemplo, "1", "2", ...) para denotar distintos puntos de tiempo. El tiempo total para montar los peces, ajustar el ángulo de imagen y recopilar todos los datos de una larva de pez cebra es de alrededor de 1 h.
5. Reconstrucción de imágenes 4D con cálculo paralelo
Duración: 1 día
NOTA: El algoritmo de reconstrucción 4D desarrollado por nuestro grupo y los datos de muestra son de acceso público21. Este método permite reconstruir la imagen del corazón 4D a partir de las secuencias de imágenes recogidas en los pasos anteriores (Tabla 1).
- Abra el archivo test_Parallel.m en MATLAB (consulte Tabla de materiales). Especifique la ubicación de la carpeta donde se almacenan las secuencias de imágenes sin procesar en la variable "baseDir".
- Asigne la variable "numOfSlice" con el número total de secuencias de imágenes (normalmente 100-150) y la variable "numOfImage" con el número de imágenes (normalmente 300-500) en cada secuencia.
- Inspeccione la secuencia de imágenes que muestra el plano medio del corazón del pez cebra (por ejemplo,la secuencia 51 de un total de 101). Identifique los números de trama de la primera y cuarta sístoles de esta secuencia y asígnelos a las variables systolicPoint_1st y systolicPoint_4th.
- Haga clic en Ejecutar para iniciar el proceso.
NOTA: La duración del ciclo cardíaco en cada secuencia de imágenes se identificará primero mediante el programa MATLAB mediante una comparación de la similitud (suma de diferencias al cuadrado) entre imágenes en diferentes puntos temporales. Posteriormente, se estimará el ciclo cardíaco utilizando el promedio de las duraciones de los ciclos de todas las secuencias de imágenes. A continuación, el programa alineará los puntos de inicio de las secuencias de imágenes en diferentes ubicaciones axiales a través de una comparación iterativa de la similitud de la imagen desde la primera secuencia de imágenes hasta la última secuencia de imágenes. - Compruebe los resultados en la carpeta de salida. El programa guardará las imágenes como archivos ".tif" con marcas de tiempo. Cada archivo ".tif" es una imagen de corazón en 3D en un punto de tiempo específico. El intervalo de tiempo entre dos imágenes 3D es igual al tiempo de exposición establecido.
NOTA: Reconstruya las imágenes adquiridas de los pasos anteriores para representar las contracciones cardíacas 4D (3D espacial + 1D temporal). Para mejorar la competencia en las investigaciones de alto rendimiento durante la sincronización retrospectiva, este enfoque permite operaciones computacionales simultáneas en una GPU aprovechando varios núcleos de CPU a través de la caja de herramientas de computación paralela de MATLAB y transformando las imágenes al formato gpuArray.
6. 3D segmentación celular y seguimiento celular
Duración: 1 día
- Descargue el paquete 3DeeCellTracker (consulte la Tabla de materiales) y configure el entorno de Python22.
- Descargue el software de anotación ITK-SNAP23 (ver Tabla de materiales) y utilícelo para etiquetar manualmente la imagen 3D del corazón en dos puntos de tiempo seleccionados, uno en la diástole ventricular y el otro en la sístole ventricular, para crear los conjuntos de datos de entrenamiento y validación.
NOTA: También puede aplicarse otro software de etiquetado. - En Python, ejecute el programa de entrenamiento 3DeeCellTracker e inicialice los parámetros noise_level(100 en este caso), folder_path y modelo en la función TrainingUNet3D para establecer el modelo U-Net 3D predefinido.
- En MATLAB, utilice el programa imageDimConverter.m para convertir y cambiar el nombre del conjunto de datos de entrenamiento y validación al formato adecuado para su carga.
- En Python, cargue los conjuntos de datos de entrenamiento y validación mediante las funciones trainer.load_dataset() y trainer.draw_dataset().
- En Python, ejecute la primera parte del programa de seguimiento 3DeeCellTracker e inicialice los parámetros.
NOTA: Esto incluye la definición de parámetros de imagen para caracterizar las dimensiones de la imagen, los parámetros de segmentación para seleccionar el modelo de aprendizaje automático aplicado para la segmentación de células y los parámetros de seguimiento para seleccionar los modelos de redes neuronales profundas previamente entrenados empleados para el registro de células. Para su uso por primera vez, se recomienda emplear el modelo U-Net para la segmentación celular y FFN+ PR-GLS para el registro celular. Es necesario almacenar los datos, el modelo y los resultados en carpetas que se crearán automáticamente en este paso. - En MATLAB, utilice el programa imageDimConverter.m para convertir y cambiar el nombre de todas las imágenes de corazón 3D al formato adecuado y transferirlas a la carpeta de datos creada en el último paso.
- En Python, ejecute la segunda parte del programa 3DeeCellTracker para iniciar la segmentación.
- Una vez segmentada la primera imagen 3D, compare el resultado de la segmentación con la imagen RAW y realice una corrección manual si se encuentra alguna segmentación incorrecta. Mueva la segmentación corregida a la carpeta "/manual_vol1" creada.
- En Python, ejecute la tercera parte del programa 3DeeCellTracker para segmentar todas las imágenes.
- Utilice Amira (consulte la Tabla de materiales) para realizar una evaluación visual de los resultados del seguimiento comparando las posiciones de las celdas rastreadas con sus correspondientes imágenes sin procesar. Si los resultados de las pruebas no son satisfactorios, vuelva a iniciar el procedimiento desde el paso 6.6, emplee un modelo de aprendizaje automático alternativo para la segmentación o el registro de celdas y, a continuación, vuelva a iniciar el proceso de seguimiento.
NOTA: Después de la segmentación, los datos de las etiquetas de celda se almacenan como una imagen de 8 bits (0 a 255) de forma predeterminada, lo que significa que solo se proporcionan 256 escalas como etiquetas para la clasificación de celdas. Hay dos soluciones para abordar este problema cuando se necesitan clases adicionales. Una solución es establecer el formato de los datos de las etiquetas de celda como una imagen de 16 bits en el programa de seguimiento, lo que provocará un aumento exponencial en el tiempo de procesamiento, más de dos días en el presente caso. La otra solución es usar el programa "separateTrackingResults.py" para posprocesar las etiquetas de las celdas, que separará las celdas con las mismas etiquetas en función de su ubicación física y asignará a cada celda una etiqueta diferente. Este proceso tarda alrededor de 10 minutos en este caso.
7. Análisis de la contractilidad cardíaca en la modalidad de realidad virtual
Duración: 1 día
- Adquiera el resultado del seguimiento de celdas de los pasos anteriores.
- Valide manualmente los datos y seleccione celdas con una intensidad de imagen uniforme en todos los volúmenes (aproximadamente 500 celdas de aproximadamente 600).
- Utilice el script21 de cellLabelsToObj.ipynb para generar una malla de superficie para cada celda individual a través del software 3D Slicer24 (consulte Tabla de materiales) y asigne un código de color único a cada celda.
- Exporte cada modelo 3D, que consta de todas las celdas en un solo punto de tiempo, como un único archivo .obj que consta de varios subobjetos acompañados de un archivo .mtl para describir la etiqueta de la celda.
- Importa los modelos a Unity usando la licencia educativa, un motor de desarrollo utilizado para la realidad extendida.
- Aplique los scripts personalizados que consisten en funciones escritas en C# a los modelos y elementos de la interfaz de usuario para permitir la visualización 4D y el análisis interactivo. Realice la interacción de realidad virtual siguiendo el paso 7.7.
- Interactúe con los modelos en realidad virtual (VR) mediante las siguientes funciones (Figura 4):
- Selección de celdas: seleccione hasta dos celdas a la vez y vea sus trayectorias, velocidades, volúmenes, áreas de superficie y distancias relativas.
- Selección de punto de tiempo: elija un punto de tiempo específico en los datos para analizar las salidas de las celdas seleccionadas, como en t = 0 ms durante la diástole o en t = 200 ms durante la sístole.
- Pausa de tiempo: congele el modelo dinámico para centrarse en las celdas seleccionadas y sus salidas.
- Contraste: Modula el contraste entre las celdas seleccionadas y las celdas circundantes en el modelo.
Resultados
El protocolo actual consta de tres pasos principales: preparación y microinyección del pez cebra, obtención de imágenes de lámina de luz y reconstrucción de imágenes 4D, y seguimiento celular e interacción de realidad virtual. Se permitió que los peces cebra adultos se aparearan, se recolectaron los huevos fertilizados y se realizó la microinyección según fuera necesario para los experimentos propuestos (Figura 1). Este paso proporciona un punto de entrada para explorar las aplicaciones del pez cebra en la investigación del desarrollo y la regeneración cardíaca, y también desempeña un papel crucial en las imágenes y análisis posteriores. Se obtuvieron imágenes del corazón en contracción en diferentes etapas (de 3 dpf a 7 dpf) utilizando el sistema LSM personalizado y alineó las secuencias de imágenes a lo largo del eje z para reconstruir el modelo de corazón de pez cebra 4D (Figura 2 y Figura 3). Estos modelos proporcionan una base para caracterizaciones fenotípicas profundas y son fundamentales para revelar la dinámica de la morfología y la función cardíacas a lo largo de las líneas de tiempo del desarrollo. Se realizó un seguimiento de las células individuales del corazón del pez cebra y se cuantificó su movimiento e interacción utilizando la plataforma de realidad virtual personalizada. También se compararon los cambios en la velocidad y la distancia relativa de las células seleccionadas durante un ciclo cardíaco en la aurícula y el ventrículo para evaluar la contractilidad regional e investigar la tensión local (Figura 4). La cepa regional se determinó a partir de la variación en el desplazamiento entre dos células miocárdicas adyacentes en la región de interés. El acortamiento fraccional (FS) y la fracción de eyección (FE) se estimaron utilizando metodologías descritas en la literatura publicada25. Las ecuaciones para el servicio fijo y el EF son las siguientes:
donde Dd y Ds son los diámetros de los ventrículos (eje corto, medidos por las distancias entre las diferentes células ventriculares) en las etapas diastólica y telesistólica, respectivamente, y Vd y V s son los volúmenes ventriculares (calculados por losdiámetros de los ejes largo y corto del ventrículo) en las etapas diastólica final y telesistólica, respectivamente.
En conjunto, estos resultados muestran una nueva estrategia que integra tanto la fisiología como la ingeniería para facilitar la obtención de imágenes volumétricas y la interpretación de datos en modelos de pez cebra, lo que es muy prometedor para avanzar en la exploración de la morfogénesis y la mecánica cardíacas.
Figura 1: Recolección de huevos de pez cebra y proceso de microinyección. El proceso consiste en aparearse con peces cebra adultos, recolectar huevos fertilizados y realizar la microinyección opcional. Durante la microinyección, la pipeta de vidrio preextraída se carga con los materiales deseados. Los óvulos fertilizados se alinean en filas rectas dentro de las ranuras del molde de agarosa y se colocan perpendicularmente a la aguja. La microinyección se lleva a cabo bajo observación microscópica constante tanto de los huevos como de la punta de la aguja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proceso de obtención de imágenes con láminas de luz y reconstrucción de imágenes en 4D. (A) Esquema de la estructura interna del sistema de imágenes de láminas de luz. CL: lente cilíndrica. EO: objetivo de excitación. DO: objetivo de detección. TL: lente de tubo. FL: filtro. CAM: cámara sCMOS. (B) Esquema de un pez cebra montado en el tubo FEP e incrustado por agarosa. (C) Secuencia de imágenes 2D sin procesar capturada de una larva de pez cebra de 4 dpf. El reloj en la parte superior izquierda de cada fotograma indica la fase cardíaca a partir del final de la sístole. (D) Ilustración de la sincronización retrospectiva para el registro de imágenes de pez cebra 4D. La secuencia de imágenes indica una grabación continua a una cierta profundidad a lo largo del eje z. Cada fotograma de la secuencia de imágenes está representado por un punto rojo, y las fases inicial y final desde el final de la diástole hasta el final de la sístole se resaltan en el cuadro amarillo. (E) Modelos cardíacos reconstruidos en 4D a partir de las secuencias de imágenes en 2D. Dpf: días después de la fecundación. Esta figura es una adaptación de Zhang et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Panel de control de LabVIEW. (A) Los ajustes utilizados en el panel de control abarcan la configuración del láser, la cámara, la ruta de la imagen y el patrón del motor. (B) Un ejemplo de una imagen cruda del corazón de un pez cebra capturada por el programa LabVIEW. Barra de escala: 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El seguimiento celular y la interacción de realidad virtual ayudan a revelar la contractilidad cardíaca del pez cebra. (A) Células rastreadas del corazón de pez cebra Tg (myl7: nucGFP) a 3 dpf. (B) La plataforma de realidad virtual proporciona a los usuarios una visualización inmersiva y una experiencia interactiva de un modelo de corazón de pez cebra en 4D, lo que permite visualizar la función cardíaca a lo largo del tiempo a través de un análisis definido por el usuario. (C) Después de recolectar mediciones de la plataforma VR, se compararon los cambios de velocidad y distancia relativa durante un ciclo cardíaco entre células seleccionadas a 3 dpf y 7 dpf. Las dos primeras figuras presentan los cambios de velocidad promedio en cinco células ventriculares y cinco células auriculares, y las otras ilustran los cambios de distancia relativa entre tres grupos de células, es decir, dos células ventriculares, una célula ventricular y una célula auricular, y dos células auriculares. (D) Evaluaciones de la función cardíaca de corazones de pez cebra de 3 dpf y 7 dpf. Se rastrearon un total de 370 células en corazones de pez cebra a 3 dpf, y 580 células se rastrearon a 7 dpf. Esta figura es una adaptación de Zhang et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| NOMBRE | USO | IDENTIFICADOR | |
| Programas y algoritmos personalizados | |||
| PSF.m | Calcular PSF a partir de los resultados de las mediciones de FWHM de las perlas de fluorescencia. | Programa de MATLAB | |
| 4D Imaging.vi de pez cebra | Para controlar y sincronizar el hardware en el sistema LSM. | Programa LabVIEW | |
| test_Parallel.m, etc. | Reconstruir imágenes 4D a partir de secuencias de imágenes 2D. | Programa de MATLAB | |
| imageDimConverter.m | Para convertir los datos de imagen en un formato especificado para el seguimiento de celdas. | Programa de MATLAB | |
| separateTrackingResults.py | Para publicar los resultados del seguimiento de celdas de proceso para separar celdas con las mismas etiquetas. | Programa Python | |
| cellTracking_All.py | Para seleccionar celdas con una intensidad de imagen uniforme en todos los volúmenes. | Programa Python | |
| cellLabelsToObj.ipynb | Para generar una malla de superficie para cada celda individual a través de la segmentación 3D. | Programa Python | |
| DynamicHeartModel.cs, etc. | Para crear un entorno de realidad virtual e interactuar con objetos. | Programa de C# | |
| Diseño de hardware personalizado | |||
| Cámara de muestras impresa en 3D | Para usar con objetivos de inmersión en agua. | Diseño de SolidWorks | |
| Portamuestras impreso en 3D | Para adaptarse a la etapa de muestra y mantener la muestra. | Diseño de SolidWorks | |
Tabla 1: Tabla de recursos personalizados. Los códigos y datos de muestra se cargan en Zenodo21.
Discusión
La integración del modelo del pez cebra con métodos de ingeniería tiene un inmenso potencial para la exploración in vivo del infarto de miocardio, las arritmias y los defectos cardíacos congénitos. Aprovechando su transparencia óptica, capacidad regenerativa y similitudes genéticas y fisiológicas con los humanos, los embriones y larvas de pez cebra se han utilizado ampliamente en la investigación 1,2,4. La resolución espacio-temporal superior, el fotodaño mínimo y las capacidades de seccionamiento óptico de las imágenes de láminas de luz lo distinguen para la investigación 4D de la morfología cardíaca y la función contráctil en larvas de pez cebra 12,26,27,28. Este protocolo presenta un enfoque integral que integra imágenes de láminas de luz, sincronización retrospectiva, seguimiento celular en 3D y una plataforma interactiva de realidad virtual (VR) para evaluaciones cuantitativas. Proporciona un punto de entrada para capturar y reconstruir la contracción cardíaca, rastrear y cuantificar la dinámica celular y evaluar los cambios estructurales, funcionales y mecánicos durante el desarrollo y la regeneración cardíaca. Este método también podría ser potenciado por imágenes de fluorescencia multicanal para rastrear varios tipos de células y linajes para investigar la heterogeneidad celular y la interacción intercelular. Si bien la dicotomía del modelo del pez cebra con respecto a los sistemas de mamíferos y su limitación como modelo agudo justifican una cuidadosa consideración, los avances en ingeniería genética pueden permitir el desarrollo de líneas transgénicas de pez cebra que se asemejan más a los estados de enfermedad humanos, mejorando así el valor traslacional de los hallazgos derivados de los estudios del pez cebra29.
Esta sincronización retrospectiva basada en la suposición de un ciclo cardíaco periódico se utiliza para reconstruir las imágenes de lámina de luz del corazón del pez cebra en contracción. La implementación de este método en imágenes de láminas de luz permite visualizar y analizar el corazón en contracción a más de 200 volúmenes por segundo. Para abordar el desafío planteado por el gran volumen de datos en el análisis actual, se utilizó el cálculo paralelo con CPU y GPU de varios núcleos, lo que resultó en una mejora de más de diez veces en la eficiencia de la reconstrucción de imágenes. Durante la sincronización retrospectiva, se presuponía que los cardiomiocitos volvían a sus posiciones basales con cada latido del corazón. Si bien esta suposición es relativamente segura dada la baja variabilidad en los latidos del corazón observada en el pez cebra26 , como se demuestra en las Figuras 4C, sigue siendo una simplificación que puede no tener en cuenta todos los matices biológicos. Las innovaciones en la obtención de imágenes, como la fluorescencia compresiva y la microscopía de campo de luz, podrían mitigar los efectos derivados de esta suposición al disminuir la redundancia de cortes.
Para permitir el análisis en profundidad en el intrincado modelo cardíaco 4D, se desarrolló un marco computacional que incluye tanto la segmentación celular basada en 3DeeCellTracker como la plataforma de realidad virtual para investigaciones dirigidas por el usuario. Las capacidades inherentes de este marco, incluida la alta eficiencia y la manipulación interactiva, permiten cuantificar el cambio de velocidad celular, investigar las interacciones célula-célula y evaluar la mecánica miocárdica regional y global, como el acortamiento fraccional, la fracción de eyección y la cepa regional30 (Figura 4). Se observa la ausencia de evaluaciones previas de la función cardíaca del pez cebra a 7 dpf en la literatura existente. Sin embargo, cuando se comparan con los datos a 3 dpf proporcionados por otros investigadores, los resultados actuales son consistentes con las indicaciones previas de una disminución tanto en la fracción de eyección (FE) como en el acortamiento fraccional (FS) durante el intervalo de 3 dpf a 7 dpf25,31. Estos métodos analíticos poseen un potencial significativo para dilucidar la dinámica cardíaca en modelos de lesión cardíaca de pez cebra12,25.
Dado que la tecnología y el software de realidad virtual contienen características únicas, como la visión estereoscópica y el registro automático de las posiciones de las células, esta plataforma permite un método inmersivo y optimizado para seleccionar células específicas y analizar su trayectoria a lo largo del ciclo cardíaco. La utilización de la realidad virtual proporciona una forma intuitiva de realizar tareas complejas como la segmentación y anotación de celdas, con mayor eficiencia y precisión 32,33,34. También permite que varios usuarios utilicen herramientas únicas cuando trabajan juntos en conjuntos de datos grandes y complicados34. Aunque el uso prolongado de la realidad virtual puede inducir efectos secundarios como mareos, esto puede mitigarse mejorando los diseños ergonómicos y los auriculares sin ataduras. Además, para abordar la considerable potencia computacional requerida para representar estructuras biológicas complejas en tiempo real, la optimización del software para el procesamiento instantáneo y el aprovechamiento de las soluciones informáticas basadas en la nube podrían mejorar la capacidad del sistema para administrar visualizaciones complejas.
Con el avance de los dispositivos de hardware y la potencia de cómputo, esta estrategia puede ampliarse para investigar las arritmias cardíacas en el miocardio tanto a nivel celular como tisular, lo que en última instancia tiene el potencial de desentrañar el mecanismo subyacente de la morfogénesis cardíaca y avanzar en el desarrollo de intervenciones terapéuticas.
Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Expresamos nuestra gratitud a la Dra. Caroline Burns del Boston Children's Hospital por compartir generosamente el pez cebra transgénico. Agradecemos a la Sra. Elizabeth Ibáñez por su ayuda en la cría del pez cebra en UT Dallas. También agradecemos todos los comentarios constructivos proporcionados por los miembros de la incubadora D en UT Dallas. Este trabajo fue apoyado por NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) y el programa UT Dallas STARS (Y.D.).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models<> | |||
| em>Tg(myl7:nucGFP) Laboratorio transgénico de pez cebra | Burns en el Hospital Infantil de Boston | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software y | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | Corporación Nacional de Instrumentos | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unidad | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| Rebanadora 3D | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Lente cilíndrica | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Objetivo de iluminación | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Objetivo de detección | Cámara Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Etapa XYZ motorizada | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Platina de inclinación de dos ejes | Thorlabs | GN2/M | |
| Motor paso a paso de rotación | Pololu | 1474 | |
| Perlas fluorescentes | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microinyector y bomba de vacío | |||
| Microinyector | WPI | PV850 | |
| Bomba de vacío | Welch | 2522B-01 | |
| Pipetas de vidrio preestiradas | WPI | TIP10LT | |
| Punta capilar para carga de gel | Bio-Rad | 2239912 | |
| Auriculares de realidad virtual hardware | |||
| VR | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU solution | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 solución | de trabajo- | -< | |
| fuerte>1% Agarosa | - | - | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Agua desionizada | - | - | |
| 10 g / L solución madre de tricaína< / fuerte> | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Agua desionizada | - | - | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Solución de trabajo de tricaína | |||
| 10g/L Solución madre de tricaína | - | - | |
| Desionizada agua | - | - | |
| 60X E3 solución madre | |||
| sodio | Centro de Recursos para Animales de Laboratorio (LARC), Universidad de Texas en Dallas | ||
| Cloruro | potasio-KCL | ||
| Cloruro de calcio dihidratado-CaCL | sub>2 x 2H2O | ||
| Sulfato de magnesio Heptahidratado-MgSO | sub>4 x 7H2O | ||
| Agua | de RO- | - | |
| 1X E3 solución de trabajo | |||
| 60X E3 | solución madre Centro de Recursos para Animales de Laboratorio (LARC), Universidad de Texas en Dallas | - | |
| Agua de ósmosis inversa | : | ||
| metileno (opcional) y nbsp; | - | C16H18ClN3S |
Referencias
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