Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.
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Artículo de método
Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra es un organismo modelo intrigante conocido por su notable capacidad de regeneración cardíaca. El estudio de la contracción del corazón in vivo es esencial para obtener información sobre los cambios estructurales y funcionales en respuesta a las lesiones. Sin embargo, la obtención de imágenes de alta resolución y alta velocidad en 4 dimensiones (4D, 3D espacial + 1D temporal) del corazón del pez cebra para evaluar la arquitectura cardíaca y la contractilidad sigue siendo un desafío. En este contexto, se utiliza un microscopio de lámina de luz (LSM) interno y un análisis computacional personalizado para superar estas limitaciones técnicas. Esta estrategia, que implica la construcción del sistema LSM, la sincronización retrospectiva, el seguimiento de una sola célula y el análisis dirigido por el usuario, permite investigar la microestructura y la función contráctil en todo el corazón a la resolución de una sola célula en las larvas de pez cebra transgénicas Tg (myl7: nucGFP ). Además, somos capaces de incorporar aún más la microinyección de compuestos de moléculas pequeñas para inducir lesiones cardíacas de forma precisa y controlada. En general, este marco permite rastrear los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, así como la mecánica regional a nivel de una sola célula durante la morfogénesis y la regeneración cardíacas.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo, la fisiología y la reparación cardíaca debido a su transparencia óptica, trazabilidad genética y capacidad regenerativa 1,2,3,4. En el caso del infarto de miocardio, si bien los cambios estructurales y funcionales impactan la eyección cardíaca y la hemodinámica, las limitaciones técnicas continúan dificultando la capacidad de investigar el proceso dinámico durante la regeneración cardíaca con la alta resolución espacio-temporal. Por ....
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Protocolo
La aprobación de este estudio fue otorgada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas en Dallas, bajo el número de protocolo #20-07. Para el presente estudio se utilizaron larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP) 12. Toda la adquisición de datos y el post-procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando software de código abierto o plataformas con licencias de investigación o educativas. Los recursos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.
1. Cría de pez cebra y microinyección de embriones
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Resultados
El protocolo actual consta de tres pasos principales: preparación y microinyección del pez cebra, obtención de imágenes de lámina de luz y reconstrucción de imágenes 4D, y seguimiento celular e interacción de realidad virtual. Se permitió que los peces cebra adultos se aparearan, se recolectaron los huevos fertilizados y se realizó la microinyección según fuera necesario para los experimentos propuestos (Figura 1). Este paso proporciona un punto de entrada para explorar las aplicaciones del .......
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Discusión
La integración del modelo del pez cebra con métodos de ingeniería tiene un inmenso potencial para la exploración in vivo del infarto de miocardio, las arritmias y los defectos cardíacos congénitos. Aprovechando su transparencia óptica, capacidad regenerativa y similitudes genéticas y fisiológicas con los humanos, los embriones y larvas de pez cebra se han utilizado ampliamente en la investigación 1,2,4. La resolución es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Expresamos nuestra gratitud a la Dra. Caroline Burns del Boston Children's Hospital por compartir generosamente el pez cebra transgénico. Agradecemos a la Sra. Elizabeth Ibáñez por su ayuda en la cría del pez cebra en UT Dallas. También agradecemos todos los comentarios constructivos proporcionados por los miembros de la incubadora D en UT Dallas. Este trabajo fue apoyado por NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) y el programa UT Dallas STARS (Y.D.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models<> | |||
| em>Tg(myl7:nucGFP) Laboratorio transgénico de pez cebra | Burns en el Hospital Infantil de Boston | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software y | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | Corporación Nacional de Instrumentos | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unidad | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| Rebanadora 3D | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Lente cilíndrica | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Objetivo de iluminación | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Objetivo de detección | Cámara Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Etapa XYZ motorizada | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Platina de inclinación de dos ejes | Thorlabs | GN2/M | |
| Motor paso a paso de rotación | Pololu | 1474 | |
| Perlas fluorescentes | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microinyector y bomba de vacío | |||
| Microinyector | WPI | PV850 | |
| Bomba de vacío | Welch | 2522B-01 | |
| Pipetas de vidrio preestiradas | WPI | TIP10LT | |
| Punta capilar para carga de gel | Bio-Rad | 2239912 | |
| Auriculares de realidad virtual hardware | |||
| VR | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU solution | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 solución | de trabajo- | -< | |
| fuerte>1% Agarosa | - | - | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Agua desionizada | - | - | |
| 10 g / L solución madre de tricaína< / fuerte> | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Agua desionizada | - | - | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Solución de trabajo de tricaína | |||
| 10g/L Solución madre de tricaína | - | - | |
| Desionizada agua | - | - | |
| 60X E3 solución madre | |||
| sodio | Centro de Recursos para Animales de Laboratorio (LARC), Universidad de Texas en Dallas | ||
| Cloruro | potasio-KCL | ||
| Cloruro de calcio dihidratado-CaCL | sub>2 x 2H2O | ||
| Sulfato de magnesio Heptahidratado-MgSO | sub>4 x 7H2O | ||
| Agua | de RO- | - | |
| 1X E3 solución de trabajo | |||
| 60X E3 | solución madre Centro de Recursos para Animales de Laboratorio (LARC), Universidad de Texas en Dallas | - | |
| Agua de ósmosis inversa | : | ||
| metileno (opcional) y nbsp; | - | C16H18ClN3S |
Referencias
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, ....
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Reimpresiones y permisos
