Para estudiar las conductas de vuelo en un contexto de miedo, introducimos un protocolo modificado de condicionamiento del miedo. Este protocolo garantiza que los ratones exhiban consistentemente comportamientos de vuelo durante la presentación de la señal en el condicionamiento del miedo.
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Artículo de método
Condicionamiento del miedo modificado para inducir comportamientos de vuelo en ratones
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Resumen
Resumen
La manifestación apropiada del comportamiento defensivo en una situación amenazante es fundamental para la supervivencia. La teoría predominante sugiere que un comportamiento defensivo activo, como saltar o lanzarse rápidamente, se expresa bajo una inminencia de amenaza alta o una amenaza real, mientras que un comportamiento defensivo pasivo, como la congelación, se expresa cuando se predice la amenaza, pero la inminencia de la amenaza es relativamente baja. En el condicionamiento clásico del miedo, los sujetos suelen exhibir la congelación como una respuesta defensiva condicionada, con poca expresión de comportamiento defensivo activo en la mayoría de los casos. Aquí, introducimos un procedimiento modificado de condicionamiento del miedo para que los ratones observen la transición de la congelación al vuelo y viceversa, que involucra cinco emparejamientos repetitivos de estímulos condicionados (CS; tono continuo, 8 kHz, 95 dB SPL (niveles de presión sonora)) y estímulos incondicionados (US; choque del pie, 0,9 mA, 1,0 s) durante dos días. Este procedimiento modificado de condicionamiento del miedo requiere un número relativamente grande de sesiones de acondicionamiento y días de acondicionamiento, pero no requiere un choque de pie de alta intensidad para una expresión modesta del comportamiento de vuelo. El uso del mismo contexto para el acondicionamiento y las presentaciones destacadas de CS es esencial para provocar comportamientos de vuelo. Este procedimiento modificado de condicionamiento del miedo es un método fiable para observar las conductas defensivas activas en ratones, proporcionando una oportunidad para dilucidar los mecanismos finos y las características de dichas conductas en un contexto de miedo.
Introducción
La selección adecuada de comportamientos defensivos en circunstancias amenazantes es crucial para la supervivencia de todos los animales. Los comportamientos defensivos cambian gradualmente de uno a otro en función de la proximidad de la amenaza, como la transición entre los comportamientos de congelación y huida 1,2,3. La desregulación de estas conductas se observa a menudo en diversos trastornos mentales4. El trastorno de estrés postraumático (TEPT) es uno de esos trastornos caracterizados por comportamientos defensivos exagerados, como respuestas de pánico a estímulos no amenazantes.
El condicionamiento clásico del miedo en roedores se usa comúnmente como modelo para el TEPT 5,6,7, pero los roedores no expresan comportamientos de huida (similares al pánico) en este modelo8. En consecuencia, el modelo clásico de condicionamiento del miedo, a menudo denominado "modelo de TEPT en roedores", carece de validez aparente para el TEPT en humanos, particularmente en la captura de síntomas de huida o pánico, que no han sido bien estudiados.
Recientemente, varios protocolos modificados de condicionamiento del miedo han demostrado con éxito que los sujetos roedores exhiben un comportamiento de vuelo durante estos procedimientos. Por ejemplo, las asociaciones repetitivas de un estímulo condicionado (SC) y un estímulo incondicionado (US) siete veces al día permitieron a las ratas hembras exhibir comportamientos de lanzamiento similares a loscomportamientos de vuelo. En condicionamientos de miedo de dos días utilizando estímulos compuestos seriales (SCS; compuesto de tono seguido de ruido), los ratones comenzaron a mostrar comportamientos de vuelo durante la parte de ruido de las presentaciones de SCS 10,11,12. La descripción detallada del método SCS se proporciona en un informe de protocolo13. Un condicionamiento del miedo de tres días con SCS también funcionó para que las ratas indujeran comportamientos de huida14. Sin embargo, estos nuevos protocolos tienen algunas limitaciones. Por ejemplo, el uso de la presentación de señales en serie no permite excluir la influencia de la estimación de proximidad en el comportamiento defensivo. En el caso de la asociación siete veces de CS-US en ratas, la mayoría de las respuestas de huida se observaron en las hembras en lugar de en los machos.
A la luz de estas consideraciones, introducimos un protocolo modificado de condicionamiento del miedo para ratones con el fin de investigar las conductas de vuelo en un contexto de miedo. Los ratones machos exhiben consistentemente un comportamiento de vuelo durante nuestro condicionamiento de miedo modificado. En este protocolo, el tono saliente se utiliza como CS en lugar de SCS. Además, se requiere un mínimo de cinco emparejamientos de CS-US en un día durante al menos dos días, junto con la potenciación del miedo por el contexto condicionado. El protocolo proporciona otra opción para investigar los comportamientos de vuelo, complementando los protocolos anteriores, dependiendo del propósito de la investigación.
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Protocolo
Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con los principios rectores de la Sociedad Fisiológica de Japón y recibió la aprobación del Comité de Cuidado Animal de la Universidad Médica de Kanazawa (2021-32). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de ARRIVE. Para el estudio se utilizaron ratones machos adultos C57BL/6J (3-6 meses de edad), y se confirmó previamente que estos ratones exhibían los comportamientos de vuelo descritos en este manuscrito15.
1. Preparación animal
- Ratones de casa en grupo (3-4 por jaula; mantenidos a 23-27 °C; bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h; se les proporcionó acceso ad libitum a comida y agua) hasta el inicio de los experimentos.
- Aloje individualmente a cada ratón en una jaula de plexiglás (14 cm × 21 cm × 12 cm) durante al menos 3 días antes de someterse a este condicionamiento de miedo modificado.
2. Configuración de las herramientas/equipos
- Caja de condicionamiento del miedo (Figura 1A)
- Utilice una cámara de acondicionamiento del miedo (25 cm × 25 cm × 25 cm) encerrada en una caja de atenuación acústica (67 cm × 53 cm × 55 cm) (ver Tabla de Materiales).
- Se requieren dos contextos (A y B). Para el contexto A, crea rayas blancas y negras en las paredes pegando cartón plástico blanco con cintas negras (3 cm de ancho, 4 en un tablero). Usa una tabla de plástico lisa blanca para el piso.
- Limpie las paredes y el suelo con heptanol (1%) antes de cada sesión.
NOTA: No se utiliza ningún sistema de ventilación activo. La limpieza con alcohol al final de la sesión disminuye el olor a heptanol. - Para el contexto B, haga que la apariencia de las paredes sea completamente negra quitando el tablero utilizado en el contexto A. El suelo es de rejilla.
NOTA: No se presenta ningún olor específico que no sea un ligero olor a alcohol para la limpieza. - Ilumine la caja experimental con un diodo emisor de luz blanco en el techo (LED, 240 lux) (consulte la tabla de materiales).
- Sinvergüenza
- Conecte un amortiguador de revuelto (consulte la Tabla de materiales) a un piso de rejilla compuesto por varillas de acero inoxidable. Esto se utiliza para proporcionar descargas en los pies. La intensidad del choque del pie se fijó en 0,9 mA siguiendo los métodos comunes de condicionamiento del miedo 10,11,12,13.
- Generador de audio
- Coloque un altavoz (consulte la Tabla de materiales) en el techo. Todos los estímulos acústicos se amplifican.
- Modifique y calibre digitalmente las amplitudes generales de cada estímulo para obtener niveles de presión sonora (SPL, re: 20 μ Pa) en la parte frontal de 5 cm del altavoz con un micrófono de 1/4 de pulgada. Presente una ráfaga de tono continuo a través de este altavoz.
NOTA: La calibración del altavoz de sonido es crucial para examinar el impacto fino del estímulo sonoro en los comportamientos defensivos durante este condicionamiento modificado del miedo.
- Transductor
- Coloque el suelo de la cámara de prueba sobre un transductor (consulte la Tabla de materiales) para la detección de vibraciones. La señal del transductor se transmite a una tarjeta de sonido con una frecuencia de muestreo de 8 kHz para registrar las vibraciones de comportamiento.
- Cámara de video
- Coloque una cámara CMOS (consulte la Tabla de materiales) en el techo para seguir los movimientos del sujeto y grabar el sonido en la caja de acondicionamiento.
- Sistema de disparo
- Utilice un software de sonido (consulte la Tabla de materiales) para activar tonos o descargas de pie en los tiempos programados.
NOTA: Cualquier estimulador disponible en el mercado funcionará para esto.
- Utilice un software de sonido (consulte la Tabla de materiales) para activar tonos o descargas de pie en los tiempos programados.
3. Experimento conductual
- Planifique cuatro días de procedimientos de condicionamiento del miedo: habituación (1 día, 5 ensayos), condicionamiento (2 días, 5 ensayos cada uno) y sesiones de prueba/extinción (1 día, 5 o 15 ensayos). Los intervalos entre ensayos variaron entre 60-75 s (Figura 1B).
NOTA: Preferiblemente, incluya diez o más sujetos en un grupo para obtener tendencias conductuales confiables. Se requieren dos o tres grupos dependiendo del propósito del estudio.- Durante la sesión de acondicionamiento, presente el estímulo incondicionado (US) (1 s, 0,9 mA) inmediatamente después de la terminación del estímulo condicionado (CS) (ráfaga de tono continuo, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL) como se muestra en la Figura 1B. Entregue cinco pares CS-US en un día de acondicionamiento.
- Después de la terminación de la 5ª descarga de pies, deje al sujeto en el contexto durante 1 minuto antes de devolverlo a la jaula de origen. Limpie la cámara con alcohol al 70% para limpiarla después de cada prueba de comportamiento.
NOTA: La intensidad de CS y US puede modificarse según el propósito del estudio. Informes previos han demostrado que una mayor intensidad de CS desencadena comportamientos defensivos más activos que los más suaves15. Los días de acondicionamiento también se pueden extender.
- Inducir comportamientos de vuelo durante las presentaciones de CS siguiendo el cronograma que se menciona a continuación.
NOTA: En este experimento se utilizan un CS (95 dB SPL) y un US (0,9 mA).- El día 1, exponga a los sujetos a 5 ensayos de CS solos en el contexto A.
- En los días 2 y 3, condicionar a los sujetos con 5 ensayos de asociación CS-US en el contexto B.
- El día 4, exponga a los sujetos a 5 ensayos de CS solos para la sesión de recuerdo en el contexto B. En caso de probar la extinción de la memoria, exponer a los sujetos a 15 ensayos de CS solos.
NOTA: Para probar la estabilidad de la memoria, extender las sesiones de extinción durante 2-3 días ayudará. Además, probar la memoria una semana después en lugar del día 4 puede proporcionar una confirmación adicional de la estabilidad de la memoria.
4. Análisis de conductas defensivas
NOTA: Se analizan el movimiento, el porcentaje de congelación y el número de saltos durante las presentaciones de CS. Los detalles se describen a continuación. Si es posible, sería mejor analizar de manera doble ciego.
- Sincronice los tiempos de los eventos en el video y los tiempos de los estímulos (CS y US) utilizando el inicio del tono grabado en el video.
- Utilice un código personalizado para calcular los movimientos promedio y total de los ratones en función de la diferencia en el centro de masa de la silueta del sujeto a través de los fotogramas.
NOTA: Se utiliza una unidad arbitraria para esta medición, ya que la velocidad de movimiento depende de la frecuencia de muestreo de la película. - Para medir el porcentaje de congelación, utilice la señal del transductor a tiempo.
- Preprocese las señales del transductor utilizando un filtro de paso de banda de 20-500 Hz.
- Calcule la amplitud cuadrática media de la señal del transductor en el tiempo para cada intervalo de 50 ms.
- Establezca un umbral para la amplitud de la señal para detectar el período de inmovilidad. La duración de la inmovilidad es el período de la señal inferior al umbral durante más de 1 s.
- Mida manualmente la duración de la congelación viendo el video.
- Ajuste el umbral de amplitud de la señal para la congelación comparando el porcentaje de congelación medido manualmente y el porcentaje calculado a partir de la señal del transductor.
- Cuente el número de saltos manualmente desde archivos de vídeo.
NOTA: Contar el número de dardos también será útil para evaluar la respuesta de vuelo.
5. Análisis estadístico
- Establezca la significación estadística en p < 0,05.
- Para realizar comparaciones entre múltiples grupos y múltiples factores, realice un ANOVA multifactorial seguido de pruebas post-hoc. Si se prueba un día específico del programa de acondicionamiento, realice múltiples pruebas de comparación o pruebas de permutación.
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Resultados
Se presentan los resultados obtenidos con el condicionamiento del miedo modificado en ratones machos (C57BL/6J; 3-6 meses de edad), siguiendo el esquema que se muestra en la Figura 1C. El experimento fue diseñado para investigar cómo el contexto condicionado influye en la expresión de las conductas de vuelo. Se asignaron dos grupos: Grupo 1 (n = 10) y Grupo 2 (n = 10). En este experimento se utilizaron un CS (95 dB SPL) y un US (0,9 mA).
El día 1, todos los ratone...
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Discusión
El protocolo modificado de condicionamiento del miedo introducido en este artículo es un método estable para investigar los comportamientos de vuelo en un contexto de miedo. Al emplear este protocolo, hemos encontrado que los comportamientos de vuelo de los ratones en el contexto de miedo son desencadenados por estímulos destacados y dependen del contexto. Las características del comportamiento de vuelo no fueron bien investigadas, ya que no existía un protocolo adecuado para observar los comportamientos de vuelo. Este p...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por KAKENHI Grants JP22K15795 (a T.F.), JP22K09734 (a N.K.), JP21K07489 (a R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, a R.Y.) y The Naito Foundation (a T.F.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Altavoz de audio | Fostex | FT17H | |
| Amplificador | Sony | TA-F500 | |
| Cámara CMOS | Sanwa Supply Inc. | CMS-V43BK | |
| Cámara acondicionadora del miedo | Panlab S.L.U. | LE116 | |
| Pellets de comida | Nosan | Labo MR estándar | |
| LED | Yamazen | LT-B05N | |
| Micrófono | ACO | tipo 4156N | |
| Scramble shocker | Panlab S.L.U. | LE 100-26 | |
| Tarjeta de sonido | Behringer | UMC202 | |
| Software | de sonido Syntrillium Software | Cool Edit 2000 | |
| Transductor | Panlab S.L.U. | LE 111 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66266
