Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

Los adyuvantes se utilizan a menudo para mejorar la eficacia de una vacuna al estimular el sistema inmunitario para que responda con más fuerza a la vacuna, aumentando así la inmunidad contra un patógeno en^particular. El adyuvante de nanoemulsión (NE) se refiere a un sistema de dispersión coloidal con estabilidad termodinámica mediante la emulsión de una cierta proporción de fase oleosa y fase acuosa para producir una emulsión en forma de agua en aceite (W/O) o aceite en agua (O/W)². El adyuvante de nanoemulsión O/W puede producir citocinas y quimiocinas en el lugar de la inyección, inducir la rápida agregación y proliferación de células inmunitarias importantes como monocitos, neutrófilos y eosinófilos, y mejorar la respuesta inmunitaria y mejorar la inmunogenicidad de los antígenos³. Actualmente, tres adyuvantes de nanoemulsión (MF59, AS03 y AF03) han sido autorizados para su uso en vacunas y han demostrado una buena seguridad y eficacia⁴.

Sin embargo, la inmunidad de la mucosa ha sido mal abordada por las formulaciones adyuvantes actualmente autorizadas en la vacunación parenteral convencional⁵. Se ha informado que el ácido retinoico (AR) induce la localización intestinal de las células inmunitarias, pero su baja polaridad, su escasa solubilidad en agua y su escasa estabilidad lumínica y térmica limitan su uso para una vacunación entérica robusta. Las nanoemulsiones ofrecen oportunidades para aumentar la biodisponibilidad de fármacos altamente lipofílicos, y el núcleo de aceite de los adyuvantes de emulsión O/W es adecuado para disolver sustancias no polares como RA⁶. Por lo tanto, las nanoemulsiones se pueden utilizar como portadores de la AR con el fin de lograr el efecto de doble respuesta de la inmunidad sistémica y la inmunidad de la mucosa.

En comparación con los sistemas de administración neutros o aniónicos, los sistemas de administración catiónica tienen capacidades de encapsulación y administración de antígenos relativamente eficientes, lo que puede mejorar la inmunogenicidad de los antígenos ^7,8,9. La carga superficial catiónica de una variedad de sistemas adyuvantes es importante por sus efectos adyuvantes 10,11,12. La carga catiónica es un factor importante para prolongar la retención de la vacuna en el lugar de la inyección, aumentando la presentación de antígenos y prolongando la estimulación de la inmunidad celular en el cuerpo¹².

Sobre la base de las consideraciones anteriores, desarrollamos una nanoemulsión catiónica para administrar conjuntamente ARA y antígenos de manera efectiva. El tamaño de partícula y el potencial zeta de la nanoemulsión se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS), y las respuestas inmunes sistémicas y mucosas de la nanoemulsión combinada con OVA se evaluaron mediante inyección intramuscular¹³.

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar.

1. Preparación de nanoemulsiones (NEs)

1. Para la preparación de la fase acuosa, disuelva 0,15 g de polisorbato 80 en 28,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mientras se agita a 40 °C.
2. Para la preparación de la fase oleosa, utilice la formulación de la nanoemulsión en fase oleosa que se muestra en la Tabla 1. Disolver el sornitano trileado 85, DOTAP y RA en escualeno agitando a 40 °C.
3. Para la preparación de la emulsión O/W primaria, agite la fase oleosa magnéticamente a 1400 rpm mientras agrega el acuoso lentamente y gota a gota a una velocidad de 1 mL/min. Preemulsionar la mezcla con un emulsionante de alto cizallamiento a 30.000 rpm durante 6 min.
4. Para la homogeneización a alta presión (HPH), trate la emulsión O/W primaria preparada anteriormente con un homogeneizador de alta presión durante 12 ciclos a 900 bar para obtener una nanoemulsión homogénea en el rango de 160-190 nm.
5. Al final del proceso, recoja la emulsión en un matraz de 50 ml y filtre la emulsión a través de una membrana filtrante de PES de 0,2 μm.
6. Conecte el matraz a la línea Schlenk a través del catéter, girando la llave de paso de tres vías para conectar el sistema al tubo de vacío y encienda la bomba de vacío para crear vacío en el matraz. Luego, girando la llave de paso de tres vías, conecte el sistema al tubo de argón y llénelo con argón. Repita este paso 3 veces para asegurarse de que el matraz esté lleno de argón.
7. Sustituya el corcho y séllelo con una película de parafina, envuelva el matraz en papel de aluminio y guárdelo a 4 °C.

2. Caracterización de las nanoemulsiones

1. Detección de tamaño de partícula y potencial zeta
   1. Encienda el instrumento y espere 30 minutos para que la fuente de luz láser se estabilice.
   2. Diluir el NE 50 veces con agua ultrapura y añadir 1 mL de muestra a la celda de muestra correspondiente.
   3. Para medir el tamaño de partícula, ajuste la temperatura a 25 °C, seleccione agua como medio de dispersión y seleccione platos de plástico desechables como celda de medición. Cargue las muestras y mida automáticamente. Indique el valor medio de tres mediciones repetidas para cada muestra como resultado final.
   4. Para medir el potencial zeta, ajuste la temperatura a 25 °C. Debido a la elección de la fase acuosa como medio de dispersión, seleccione el modelo Smoluchowsi y la celda capilar plegada como celda de medición. Cargue las muestras y mida automáticamente. Indique la media de tres mediciones repetidas para cada muestra como resultado final.
2. Determinación de la tasa de encapsulación y la tasa de carga del fármaco
   1. Para determinar la cantidad de RA cargada en el NE, utilice etanol absoluto para desemulsionar y extraer el RA del NE. A 5 μL de muestra, añadir 995 μL de etanol y determinar el contenido de RA de la solución utilizando un espectrofotómetro a 355 nm. Compare la absorbancia con una curva estándar. Utilice la siguiente ecuación:
      Encapsulación = carga real de AR/peso del fármaco añadido
      Tasa de carga del fármaco = carga real de AR / calidad de la muestra

3. Procedimientos de inmunización y recogida de muestras

1. Procedimiento de inmunización y agrupamiento
   1. Grupo de ratones Balb/C hembra de 6-8 semanas de edad y con un peso aproximado de 18-21 g en grupos de 5 para la inmunización en el día 0, día 14, día 28 de acuerdo con los siguientes grupos experimentales: (1) grupo PBS, (2) grupo de ovoalbúmina (OVA), (3) grupo OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA), (4) grupo OVA+CNE-RA (OVA/CNE-RA).
   2. Inmunizar a todos los ratones mediante inyección intramuscular en los músculos del cuádriceps superior con 200 μL de diferentes formulaciones de vacunas: 100 μL de emulsión y 15 μg de OVA absorbidos en 100 μL de PBS, mezclados antes de la administración. Inyectar 100 μL/pata trasera. En el caso de los ratones del grupo de control, administre PBS solo.
   3. Eutanasia: Eutanasia a todos los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1% 2 semanas después de completar las tres vacunas.
   4. Recolección y procesamiento de muestras: Después de la eutanasia, use tijeras para abrir el pecho de los ratones e inserte una jeringa directamente en el corazón para aspirar aproximadamente 0,5 ml de sangre completa. Deje reposar la sangre durante 2 h a temperatura ambiente y luego centrifugar a 1800 x g durante 5 min a 4 °C. Recoja el suero, la alícuota y guárdela a -80 °C para su posterior análisis.
   5. Recolectar sangre entera, bazo, líquido de lavado vaginal (VLF), líquido de lavado broncoalveolar (BALF), líquido de lavado nasal (NLF) y líquido de lavado del intestino delgado (SILF).
2. Aislamiento de linfocitos esplénicos
   1. Remoje los ratones en etanol al 75% (v/v) para una breve esterilización, transfiera los ratones a un banco limpio. Cortar la piel del abdomen izquierdo con unas tijeras, exponer y retirar el bazo.
   2. Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga 3 mL de PBS, muela y filtre en un tubo de centrífuga de 15 mL usando un tamiz (malla 200, 70 μm) y una varilla de molienda.
   3. Centrifugar las células a 650 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y suspenda el precipitado con 3 mL de solución de lisis de glóbulos rojos, incube a temperatura ambiente durante 5 min.
   4. Agregue 10 mL de PBS al tubo y agite bien para finalizar la reacción, luego centrifugue a 650 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mL de PBS, agregue 20 μL de la dilución celular al contador de células automatizado para el recuento de células.
   6. Centrifugar las células a 650 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y diluya las células a 1 x 10⁶ células/mL con medio completo 1640 (1% de penicilina-estreptomicina, 10% suero fetal bovino).
3. Recolección de VLF: Enjuague la vagina 4 veces con 75 μL de 1%BSA/PBST, combine la solución de lavado y recoja en tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrifugue a 5000 x g a 4 °C durante 20 min y recoja el sobrenadante con una pipeta y almacene a -80 °C.
4. Colección BALF y NLF
   1. Desinfectar los ratones después del sacrificio con etanol al 75% (v/v). Sostenga el vientre del ratón hacia arriba y enderece el cuello. Use tijeras para hacer una incisión longitudinal en la piel del cuello del ratón y use pinzas para separar los músculos y exponer la tráquea adecuadamente.
   2. Corte la tráquea a través de una pequeña abertura transversal e inserte la manguera hacia los pulmones, conecte la jeringa a la manguera e inyecte 0,5 mL de PBS en los pulmones y retírelo, repita el enjuague 3 veces y centrifugue a 650 x g a 4 °C durante 5 min, almacene el sobrenadante (BALF) a -80 °C.
   3. Invierta la manguera a la cavidad nasal, conecte la jeringa a la manguera e inyecte 0,5 ml de PBS, el líquido fluirá a través de la cavidad nasal hacia el tubo de centrífuga de 1,5 ml. Aspire el lavado del tubo de centrífuga y repita el enjuague 2 veces, luego centrifugar a 650 x g a 4 °C durante 5 min, almacene el sobrenadante (NLF) a -80 °C.
5. Colección SILF
   1. Prepare una solución de PBS que contenga 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina, 50 mM/L de EDTA-2Na, 1 mM/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como solución de lavado del intestino delgado. Remover a temperatura ambiente para disolver y almacenar a 4 °C.
   2. Corte el intestino delgado a lo largo del tubo intestinal y sumérjalo en 3 ml de líquido de lavado del intestino delgado. Mezclar agitando verticalmente a 15 rpm durante 30 min a 4 °C. Centrifugar a 1440 x g a 4 °C durante 20 min y recoger el sobrenadante con una pipeta, luego centrifugar a 5000 x g a 4 °C durante 20 min. Almacene el sobrenadante (SILF) a -80 °C.

4. Evaluación de la respuesta de anticuerpos específicos de OVA tras la administración intramuscular

1. Determinar los niveles séricos de IgG, las subclases de IgG1, IgG2a y los niveles de sIgA específica en VLF, BALF, NLF y SILF mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA).
2. Para el recubrimiento de antígenos, diluya OVA a 5 μg/mL con tampón de recubrimiento y cubra placas ELISA de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con 100 μL de solución de OVA por pocillo.
3. Lave las placas ELISA 5x con PBST y bloquee por incubación con 250 μL de 1%BSA/PBST a 37 °C durante 2 h.
4. Lave las placas ELISA 5 veces con PBST, luego agregue 100 μL de la muestra diluida como se describe a continuación para analizar e incubar a 37 °C durante 1 h. Suero diluido, VLF, BALF, NLF con 0,5% BSA/PBST, SILF diluido con 20% de suero fetal de ternera (FCS)/PBST.
   1. Comience diluyendo el suero 1000x utilizando un procedimiento de dilución de dos pasos: diluya 20 μL de suero a 1 mL, luego diluya 25 μL de este suero diluido a 500 μL. Utilice esta dilución de suero para la detección de IgG1, IgG2a.
5. Agregue 200 μL del suero diluido a 1000x a la primera fila de la placa recubierta y agregue 100 μL de 0.5% BSA/PBST a todos los pocillos excepto a la primera fila. Transfiera 100 μL de la primera fila a la segunda fila y mezcle 10x con la pipeta. Repetir este paso hasta la fila 8 y desechar 100 μL de líquido, se ha obtenido el suero de diferentes concentraciones para la detección de IgG.
6. Realice una dilución 1:1 de BALF, NLF y SILF para detectar IgA. Utilice el mismo procedimiento de dilución para VLF que para el suero.
7. Lave las placas ELISA 5 veces con PBST. Añadir 100 μL de IgG/IgG1/IgG2a/IgA anti-ratón de cabra conjugada con HRP (diluida 1:10000 con PBST) a los pocillos apropiados e incubar a 37 °C durante 40 min.
8. Lavar las placas ELISA 5 veces con PBST, añadir 100 μL de sustrato ELISA de TMB (altamente sensible) y trasladar la placa a un lugar protegido de la luz durante 5 min. Añadir inmediatamente 100 μL de solución de parada de 450 nm para el sustrato TMB para detener la reacción.
9. Mida la absorbancia (OD) a 450 nm para cada pocillo y calcule el título de anticuerpos tomando 2,1 veces el valor sérico del ratón del grupo en blanco como valor de respuesta positiva.

5. Ensayo ELISpot

1. Siga las directrices de ELISpot Plus, utilice el IFN-γ de ratón (ALP) del kit para realizar los ensayos.
2. Retire la placa del paquete sellado y lave 4 veces con PBS estéril (200 μL/pocillo). Acondicione la placa con medio completo 1640 (200 μL/pocillo) e incube durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Retire el medio y agregue la concentración ajustada de suspensión de linfocitos preparada en el paso 3.2.2 (100 μL/pocillo) a la placa, luego agregue 100 μL del estímulo, es decir, 1640 medio completo que contiene 20 μg/mL OVA257 ~ 264 o OVA323 ~ 339 o 1640 medio completo. Coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂ durante 48 h. Envuelva el plato con papel de aluminio para evitar la evaporación.
4. Deseche la suspensión celular y lave la placa 5 veces con PBS (200 μL/pocillo). Diluir el anticuerpo de detección (R4-6A2-biotina) a 1 μg/mL en PBS que contenga 0,5% de suero fetal de ternero (PBS-0,5% FCS). Añadir 100 μL/pocillo e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
5. Lave la placa como en el paso 5.2. Diluir la estreptavidina-ALP (1:1000) en PBS-0,5%FCS y añadir 100 μL/pocillo, incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lave la placa como en el paso 5.2. Filtre la solución de sustrato lista para usar (BCIP/NBT-plus) a través de un filtro de 0,45 μm y agregue 100 μL/pocillo. Se desarrollan hasta que emergen manchas distintivas.
7. Detenga el desarrollo del color lavando abundantemente con agua del grifo, retire el plástico blando y deje que la placa se seque.
8. Inspeccione y cuente los puntos en un lector ELISpot.

6. Análisis estadístico

1. Analizar las diferencias entre los datos de 4 grupos mediante ANOVA de un factor seguido de una comparación múltiple de Tukey después de la prueba. Expresar todos los resultados como media ± DE. Se consideró significativo un valor de p menor a 0,05.

En total, se prepararon cuatro formulaciones de nanoemulsión y se caracterizaron por su tamaño de partícula (Figura 1), su potencial zeta y su eficiencia de encapsulación como se presenta en la Tabla 2. El tamaño de partícula se concentró alrededor de 160-190 nm y la adición de DOTAP invirtió el potencial Zeta de la nanoemulsión. Se detectó IgG sérica específica de OVA y su subgrupo de niveles de anticuerpos en suero 2 semanas después de la tercera inmunización. La vacuna adyuvante de nanoemulsión aumentó significativamente los títulos de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG 2a específicos de OVA en suero (Figura 2). Más importante aún, los niveles de sIgA específica en el líquido de lavado vaginal y en el líquido de lavado del intestino delgado aumentaron significativamente cuando se adyuvó OVA con CNE-RA (Figura 3). En el ensayo ELISpot no se encontraron manchas significativas.

Figura 1: Tamaño, diámetro y distribución. (A) Tamaño, diámetro y distribución de NE-RA. (B) Tamaño, diámetro y distribución de CNE-RA. d.nm es el diámetro medio de las partículas en nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: IgG sérica específica de OVA y niveles de anticuerpos de su subgrupo en suero. Se completaron los niveles séricos de IgG específica de OVA y su subgrupo de anticuerpos en suero 2 semanas después de las tres inmunizaciones. A) Valor log2 de los títulos de IgG. (B) Densidad óptica de IgG1 a 450 nm. (C) Densidad óptica de IgG2a a 450 nm. Los datos se expresan como media ± DE (n=5), ***: P<0,001. Las comparaciones de las diferencias entre los grupos y el grupo PBS se muestran directamente encima de las columnas de la figura y se indican de la siguiente manera: ns: sin significación, #p<0,05, ###p<0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: SIgA específica de OVA. SIgA específica de OVAs en líquido de lavado vaginal, líquido de lavado broncoalveolar, líquido de lavado nasal, líquido de lavado del intestino delgado. (A) líquido de lavado vaginal, (B) líquido de lavado broncoalveolar, (C) líquido de lavado nasal y (D) líquido de lavado del intestino delgado. Los datos se expresan como media ± DE (n=5), ns: sin significancia, *p<0,05; p<0,001. Las comparaciones de las diferencias entre los grupos y el grupo PBS se muestran directamente encima de las columnas de la figura y se indican de la siguiente manera: ns: sin significación, ###p<0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Formulación de NEs en fase oleosa.

Tabla 2: Características fisicoquímicas de las NE.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses en este trabajo.