Describimos un método para estudiar cómo responde el pH a las señales ambientales en los glicosomas del torrente sanguíneo de los tripanosomas africanos. Este enfoque implica un sensor de proteínas hereditarias sensible al pH en combinación con citometría de flujo para medir la dinámica del pH, tanto como un ensayo de curso temporal como en un formato de pantalla de alto rendimiento.
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Artículo de método
Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo
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Resumen
Resumen
El metabolismo de la glucosa es fundamental para el tripanosoma africano, Trypanosoma brucei, como un proceso metabólico esencial y regulador del desarrollo del parásito. Poco se sabe sobre las respuestas celulares que se generan cuando cambian los niveles ambientales de glucosa. Tanto en el torrente sanguíneo como en la forma procíclica (etapa de insecto), los glicosomas albergan la mayor parte de la glucólisis. Estos orgánulos se acidifican rápidamente en respuesta a la privación de glucosa, lo que probablemente resulta en la regulación alostérica de enzimas glucolíticas como la hexoquinasa. En trabajos anteriores, la localización de la sonda química utilizada para realizar mediciones de pH era un desafío, lo que limitaba su utilidad en otras aplicaciones.
En este trabajo se describe el desarrollo y uso de parásitos que expresan pHluorin2 localizada glucosómicamente, un biosensor de pH de proteína heredable. pHluorin2 es una variante radiométrica de pHluorin que muestra una disminución dependiente del pH (ácido) en la excitación a 395 nm mientras que simultáneamente produce un aumento en la excitación a 475 nm. Los parásitos transgénicos se generaron mediante la clonación del marco de lectura abierto de pHluorin2 en el vector de expresión de tripanosomas pLEW100v5, lo que permitió la expresión inducible de proteínas en cualquiera de las etapas del ciclo de vida. Se utilizó inmunofluorescencia para confirmar la localización glusómica del biosensor pHluorin2, comparando la localización del biosensor con la proteína residente glusómica aldolasa. La capacidad de respuesta del sensor se calibró a diferentes niveles de pH mediante la incubación de células en una serie de tampones que variaban en pH de 4 a 8, un enfoque que hemos utilizado previamente para calibrar un sensor de pH basado en fluoresceína. A continuación, medimos la fluorescencia de pHluorin2 a 405 nm y 488 nm mediante citometría de flujo para determinar el pH glusómico. Validamos el comportamiento de los parásitos transgénicos vivos que expresan pHluorin2, monitorizando el pH a lo largo del tiempo en respuesta a la privación de glucosa, un desencadenante conocido de la acidificación glusómica en parásitos PF. Esta herramienta tiene una serie de aplicaciones potenciales, incluida la posibilidad de ser utilizada en el cribado de drogas de alto rendimiento. Más allá del pH glusómico, el sensor podría adaptarse a otros orgánulos o usarse en otros tripanosomátidos para comprender la dinámica del pH en el entorno de células vivas.
Introducción
Los cinetoplástidos parásitos, como la mayoría de los organismos vivos, dependen de la glucosa como un componente fundamental del metabolismo central del carbono. Este grupo incluye organismos de importancia médica, como el tripanosoma africano, Trypanosoma brucei; el tripanosoma americano, T. cruzi; y parásitos del género Leishmania. El metabolismo de la glucosa es fundamental para el crecimiento del parásito en las etapas del ciclo de vida patógeno. Por ejemplo, cuando se le priva de glucosa, la forma del torrente sanguíneo (BSF) del tripanosoma africano muere rápidamente. En particular, la glucólisis sirve como la única fuente de ATP dura....
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Protocolo
El uso de tripanosomas de T. brucei brucei 90-13 BSF, una línea de parásitos monomórficos, requiere tener en cuenta la seguridad, ya que se consideran organismos del Grupo de Riesgo 2 que deben manipularse en instalaciones de nivel de bioseguridad 2.
1. Cultivo y transfección de tripanosomas
- Cultivo de tripanosomas de T. brucei brucei 90-13 BSF en medio HMI-9 suplementado con FBS 10% inactivado por calor y 10% Nu-Serum a 37 °C en 5% CO210.
NOTA: Para mantener el cultivo sano, mantenga la densidad celular entre 2 × 104 y 5 × 106 células/m....
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Resultados
Localización de pHLuorin2-PTS1 en glicosomas en BSF T. brucei
Para evaluar la localización subcelular de la pHluorina2-PTS1, los parásitos se sometieron a ensayos de inmunofluorescencia. Señal del transgén colocalizada con antisueros frente a una proteína residente en el glicosoma, la aldolasa (TbAldolase) (Figura 2A). El coeficiente de correlación promedio de Pearson de colocalización entre la anti-TbAldolasa y la pHluorina2-PTS1 fue de 0,895, lo que indica que .......
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Discusión
La percepción ambiental y los mecanismos de respuesta en el tripanosoma africano son poco conocidos. Se sabe que los cambios en la disponibilidad de nutrientes desencadenan diversas respuestas en el parásito, incluida la acidificación de los glicosomas. Aquí, hemos descrito un método para estudiar la respuesta del pH glusómico a las perturbaciones ambientales en células vivas utilizando un sensor de proteína heredable, pHluorin2, y citometría de flujo.
Hay varios pasos críticos en el uso del s.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
pHluorin2-PTS1 fue clonado en pLEW100v5 por Twist Bioscience, que proporcionó la construcción en un vector de clonación de alta copia; pLEW100v5 fue un regalo del Dr. George Cross. El antisuero contra la aldolasa de T. brucei está disponible en la Dra. Meredith T. Morris, de la Universidad de Clemson, previa solicitud. El trabajo de los laboratorios JCM y KAC fue parcialmente apoyado por un premio de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI156382). SSP fue apoyado por NIH 3R01AI156382.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matraz de cultivo de tejidos de 50 ml (sin tratar, estéril) | VWR | 10861-572 | |
| Matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2 (no tratado, estéril) | Corning | 431464U | |
| 80 µ Placa de 384 pocillos de fondo plano L | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Nucleofector de células T humanas Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Citómetro de flujo | invitrogen de Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96 pocillos, placa de fondo plano | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin de ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen de Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Citómetro de flujo | Beckman-Coulter | ||
| Ciencias de la microscopía electrónica 16% Paraformaldehído Solución acuosa, grado EM, ampolla de 10 mL | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prisma | software estadístico | ||
| Nigericina (sal de sodio) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Descatalogado | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lisina, 0.1% (p/v) en H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Robot de pipeteo para ensayo HTS |
| Rojo tiazol (TO-PRO-3) | biotio | #40087 | Mecanizamos un soporte de placa acrílica personalizado para que esta marca de placa pudiera ser detectada y utilizada en nuestro CytKick Max Auto Muestreador |
| valinomicina | Cayman Chemical 10009152 | Robot de pipeteo para ensayo HTS | |
| Para la calibración del pH | |||
| Para la calibración del pH |
Referencias
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
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Reimpresiones y permisos
