Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica

Summary

Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas.

Abstract

Descifrar las interacciones proteína-ligando en un complejo macromolecular es crucial para comprender el mecanismo molecular, los procesos biológicos subyacentes y el desarrollo de fármacos. En los últimos años, la microscopía electrónica criogénica de muestras (cryoEM) ha surgido como una técnica poderosa para determinar las estructuras de las macromoléculas e investigar el modo de unión del ligando a una resolución casi atómica. La identificación y el modelado de moléculas no proteicas en los mapas de crioEM suele ser un reto debido a la resolución anisotrópica de la molécula de interés y al ruido inherente a los datos. En este artículo, se presenta a los lectores varios programas y métodos que se utilizan actualmente para la identificación de ligandos, la construcción de modelos y el refinamiento de coordenadas atómicas utilizando macromoléculas seleccionadas. Una de las formas más sencillas de identificar la presencia de un ligando, como se ilustra con la enzima enolasa, es restar los dos mapas obtenidos con y sin el ligando. Es probable que la densidad adicional del ligando se destaque en el mapa de diferencias incluso en un umbral más alto. Hay casos, como se muestra en el caso del receptor metabotrópico de glutamato mGlu₅, en los que no se pueden generar mapas de diferencias tan simples. El método recientemente introducido para derivar el mapa de omisión Fo-Fc puede servir como herramienta para validar y demostrar la presencia del ligando. Por último, utilizando como ejemplo la bien estudiada β-galactosidasa, se analiza el efecto de la resolución en el modelado de los ligandos y las moléculas de disolvente en los mapas de crioEM, y se presenta una perspectiva sobre cómo se puede utilizar la crioEM en el descubrimiento de fármacos.

Introduction

Las células cumplen sus funciones llevando a cabo innumerables reacciones químicas de forma simultánea e independiente, cada una de las cuales está meticulosamente regulada para garantizar su supervivencia y adaptabilidad en respuesta a las señales ambientales. Esto se logra mediante el reconocimiento molecular, que permite que las biomoléculas, especialmente las proteínas, formen complejos transitorios o estables con otras macromoléculas, así como con pequeñas moléculas o ligandos¹. Por lo tanto, las interacciones proteína-ligando son fundamentales para todos los procesos de la biología, que incluyen la regulación de la expresión y la actividad de las proteínas, el reconocimiento de sustratos y cofactores por parte de las enzimas, así como la forma en que las células perciben y transmiten las señales ^1,2. Una mejor comprensión de las propiedades cinéticas, termodinámicas y estructurales del complejo proteína-ligando revela las bases moleculares de la interacción del ligando y también facilita el diseño racional de fármacos al optimizar la interacción y la especificidad del fármaco. Un enfoque económico y más rápido para estudiar la interacción proteína-ligando es utilizar el acoplamiento molecular, que es un método computacional que examina virtualmente una amplia gama de moléculas pequeñas y predice el modo de unión y la afinidad de estos ligandos con las proteínas diana^. Sin embargo, la evidencia experimental de estructuras de alta resolución determinadas por difracción de rayos X (XRD), resonancia magnética nuclear (RMN) o criomicroscopía electrónica (crioEM) proporciona la prueba esencial para tales predicciones y ayuda en el desarrollo de activadores o inhibidores más nuevos y efectivos para un objetivo determinado. Este artículo utiliza la abreviatura 'cryoEM', como se conoce comúnmente a la técnica. Sin embargo, existe un debate en curso sobre la elección de la nomenclatura correcta y, recientemente, se ha propuesto el términoicroscopia M del lectrón Ede la muestra criogénica (cryoEM) para indicar que la muestra está a temperatura criogénica y se ha obtenido una imagen con electrones⁴. Del mismo modo, los mapas derivados de la crioEM se han denominado potencial electrónico, potencial electrostático o potencial de Coulomb, y para simplificar, aquí utilizamos los mapas crioEM 5,6,7,8,9,10.

A pesar de que la DRX ha sido la técnica de referencia en la determinación de la estructura de alta resolución de complejos proteína-ligando, la crioEM post-revolución de la resolución¹¹ ha ganado impulso, como lo indica el aumento de los mapas de potencial de Coulomb o mapas de crioEM depositados en la Base de Datos de Microscopía Electrónica (EMDB)^12,13 en los últimos años¹⁴. Debido a los avances en los métodos de preparación de muestras, imágenes y procesamiento de datos, el número de deposiciones del Banco de Datos de Proteínas (PDB)¹⁴ que emplean crioEM aumentó del 0,7% al 17% entre 2010 y 2020, y aproximadamente el 50% de las estructuras reportadas en 2020 se determinaron con una resolución de 3,5 Å o mejor^15,16. CryoEM ha sido rápidamente adoptado por la comunidad de biología estructural, incluida la industria farmacéutica, ya que permite el estudio de macromoléculas biológicas flexibles y no cristalinas, especialmente proteínas de membrana y complejos multiproteicos, a una resolución casi atómica, superando el proceso de cristalización y obteniendo cristales bien difractantes necesarios para la determinación de estructuras de alta resolución por XRD.

El modelado preciso del ligando en el mapa crioEM es primordial, ya que sirve como modelo del complejo proteína-ligando a nivel molecular. Existen varias herramientas automatizadas de construcción de ligandos utilizadas en la cristalografía de rayos X que dependen de la forma y la topología de la densidad del ligando para ajustar o construir el ligando en la densidad de electrones 17,18,19,20. Sin embargo, si la resolución es inferior a 3 Å, estos enfoques tienden a producir resultados menos deseables porque las características topológicas de las que dependen para el reconocimiento y la construcción se vuelven menos definidas. En muchos casos, estos métodos han demostrado ser ineficaces para modelar con precisión ligandos en mapas crioEM, ya que estos mapas se han determinado en el rango de resolución baja a media, normalmente entre 3,5 Å-5 Ź⁷.

El primer paso en la determinación de la estructura 3D de un complejo proteína-ligando mediante crioEM implica la copurificación del ligando con la proteína (cuando el ligando tiene una alta afinidad de unión a la proteína) o la incubación de la solución proteica con el ligando durante un período específico antes de la preparación en red. Posteriormente, se coloca un pequeño volumen de muestra en una rejilla TEM agujereada con plasma limpiada con plasma, seguida de una congelación instantánea en etano líquido y, finalmente, la obtención de imágenes con un crio-TEM. Las imágenes de proyección 2D de cientos de miles a millones de partículas individuales se promedian para reconstruir un mapa de potencial de Coulomb tridimensional (3D) de la macromolécula. La identificación y el modelado de ligandos y moléculas de solvente en estos mapas plantean desafíos significativos en muchos casos debido a la resolución anisotrópica en todo el mapa (es decir, la resolución no es uniforme en toda la macromolécula), la flexibilidad en la región donde se une el ligando y el ruido en los datos. Muchas de las herramientas de modelado, refinamiento y visualización que se desarrollaron para XRD ahora se están adaptando para su uso en crioEM para los mismos propósitos 18,19,20,21. En este artículo, se presenta una descripción general de varios métodos y software utilizados actualmente para identificar ligandos, construir modelos y refinar las coordenadas derivadas de la crioEM. Se ha proporcionado un protocolo paso a paso para ilustrar los procesos involucrados en el modelado de ligandos utilizando complejos proteína-ligando específicos con resolución y complejidad variables.

El primer paso en el modelado de ligandos en mapas crioEM incluye la identificación de la densidad de ligandos (no proteínas) en el mapa. Si la unión del ligando no induce ningún cambio conformacional en la proteína, entonces el cálculo de un mapa de diferencias simple entre el complejo proteína-ligando y la apo-proteína esencialmente resalta las regiones de densidad adicional, lo que sugiere la presencia del ligando. Tales diferencias se pueden observar de inmediato, ya que solo se requieren dos mapas, e incluso se pueden usar mapas intermedios durante el proceso de refinamiento 3D para verificar si el ligando está presente. Además, si la resolución es lo suficientemente alta (<3,0 Å), el mapa de diferencias también puede proporcionar información sobre la ubicación de las moléculas de agua, así como sobre los iones que interactúan con el ligando y los residuos de proteínas.

En ausencia del mapa de apoproteínas, ahora es posible utilizar Servalcat²², que está disponible como herramienta independiente y también se ha integrado en el paquete de software CCP-EM ^23,24 como parte del refinamiento de Refmac y en CCP4 8.0 versión^25,26. Servalcat permite el cálculo de un mapa de diferencia ponderada FSC (Fo-Fc) utilizando los semimapas sin nitir y el modelo de apoproteínas como entrada. El mapa de omisión Fo-Fc representa la disparidad entre el mapa experimental (Fo) y el mapa derivado del modelo (Fc). En ausencia de un ligando en el modelo, una densidad positiva en un mapa Fo-Fc que se superpone con el mapa EM experimental generalmente sugiere la presencia del ligando. La suposición aquí es que la cadena de proteínas está bien ajustada en el mapa, y la densidad positiva restante indica la ubicación del ligando. Sin embargo, es importante examinar meticulosamente si la densidad positiva se debe a imprecisiones en el modelado, como el rotámero incorrecto de una cadena lateral de proteína.

El segundo paso consiste en obtener o crear un archivo de coordenadas cartesianas del ligando con una geometría bien definida a partir de la información química disponible. Los ligandos estándar (por ejemplo, ATP y NADP⁺) que ya están disponibles en la biblioteca de monómeros CCP4 se pueden utilizar para el refinamiento mediante la recuperación de los archivos de coordenadas y geometría a través de su código de acceso de monómeros. Sin embargo, para ligandos desconocidos o no estándar, hay varias herramientas disponibles para crear los archivos de geometría. Algunos de los ejemplos incluyen el eLBOW²⁷ - (generador electrónico de ligandos y banco de trabajo de optimización) en Phenix²⁸, Lidia - una herramienta incorporada en Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-a módulo de Glide dentro de la suite Schrödinger. A continuación, el archivo de coordenadas del ligando se ajusta en la densidad, guiado tanto por el mapa experimental de crioEM como por el mapa de diferencias en Coot. A esto le sigue el refinamiento del espacio real en Phenix²⁸ o el refinamiento recíproco en Refmac³³. Se requiere una estación de trabajo Linux o una computadora portátil equipada con una buena tarjeta gráfica y el software mencionado anteriormente. La mayoría de estos programas están incluidos en varias suites. CCP-EM²⁴ y Phenix²⁸ están disponibles gratuitamente para usuarios académicos e incluyen una variedad de herramientas que se utilizan en este artículo, incluidas Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etcetera. Del mismo modo, Chimera³⁷ y ChimeraX³⁸ proporcionan licencias gratuitas a usuarios académicos.

Protocol

1. Modelado de fosfoenolpiruvato (PEP) en enolasa de Mycobacterium tuberculosis

1. Identificación de la densidad de ligandos en el mapa crioEM del complejo PEP-enolasa
   1. Descargue los semimapas sin enfocar (emd_30988_additional_1.map y emd_30988_additional_2.map) de apo-enolasa a partir de los datos adicionales en EMDB (ver Tabla de Materiales).
   2. Abra ChimeraX (consulte la tabla de materiales). Abra los semimapas de apo-enolasa haciendo clic en Abrir en la barra de herramientas y seleccionando los nombres de los archivos. Escriba vop add #1 #2 en la línea de comandos para combinar ambos medios mapas y obtener el mapa sin enfocar de apo-enolasa.
      NOTA: #1 y #2 denotan los dos medios mapas para la enzima apo-enolasa, como se menciona en el paso 1.1.1.
   3. Cambie el nombre del mapa combinado (ID de mapa de ChimeraX: #3) escribiendo rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Color el mapa de gris desde el panel del modelo. El mapa indica que la enolasa es octámera en la solución con simetría D4.
   4. Repita los pasos 1.1.1-1.1.3 utilizando los siguientes medios mapas emd_30989_additional_1.map (ID de mapa: 4) y emd_30989_additional_2.map (ID de mapa:5) para obtener PEP-enolase-unsharpened-map (ID de mapa: #6).
   5. Para calcular un mapa de diferencias, primero ajuste los dos mapas (mapas sin nitidez de PEP-enolasa y apo-enolasa de los pasos 1.1.3 y 1.1.4) entre sí haciendo clic en Ajustar (mapa en mapa) en el panel Mapa (barra de herramientas) en ChimeraX.
      NOTA: La normalización no se realiza entre los dos mapas. En algunos casos, puede ser necesaria la normalización para llevar los mapas a la misma escala.
   6. Reste el mapa de PEP-enolasa del mapa de apo-enolasa escribiendo vop subtract #6 #3 en la línea de comandos.
      NOTA: #6 = Mapa sin enfocar de PEP-enolasa, #3 = Mapa sin enfocar de Apo-enolasa.
   7. Colorea el mapa sustraído (mapa ID:7) en verde, denotando densidad positiva (según la convención en cristalografía de rayos X)³⁹.
   8. Descargue las coordenadas de la enolasa octamérica de M. tuberculosis (PDB: 7e4x) del Banco de Datos de Proteínas (PDB), haga clic en abrir en la barra de herramientas y seleccione el nombre del archivo.
   9. Cambie el nombre del modelo 7e4x.pdb escribiendo rename #8 Apo_enolase.pdb en la línea de comandos. #8 denota el Apo_enolase.pdb en ChimeraX.
   10. Seleccione el modelo en el panel de modelos. Haga clic con el botón derecho del ratón en la barra de herramientas. Haga clic en Mover molécula para colocar el modelo cerca del mapa PEP-enolasa # 6 y alinear el modelo con respecto al mapa. Ajuste este modelo en el mapa PEP-enolase-unsharpened-escribiendo fit #8 en #6 en la línea de comandos. Aquí, el mapa tiene el número 6 y el modelo tiene el número 8.
       NOTA: En algunos casos, el ajuste local en ChimeraX puede no ser suficiente para alinear el modelo. En estos casos, se puede realizar un paso adicional de ajuste global (DockinMap, ver Tabla de Materiales) en Phenix.
   11. Guarde el modelo ajustado escribiendo save Apo-enolase.pdb #8 en la línea de comandos.
2. Modelado y refinamiento de PEP en el mapa crioEM agudizado por el factor B del complejo PEP-enolasa
   1. Abra "coot" (ver Tabla de Materiales) desde el terminal escribiendo ./Coot &.
   2. Muestre "Apo-enolase.pdb" haciendo clic en Archivo > Abrir Coordenadas Apo-enolase.pdb. El archivo de coordenadas se muestra por enlaces (color por átomo).
   3. Descargue el mapa afilado de Enolasa ligado a PEP, es decir, emd_30989.map de EMDB. Muestre el mismo haciendo clic en Archivo > Abrir mapa > emd_30989.map . Establezca el umbral en 7.00 σ desplazando el botón central del ratón.
   4. Busque blobs sin modelar haciendo clic en Validar > blobs sin modelar > Buscar blobs.
   5. Localice la densidad de ligandos no modelada cerca de los residuos del sitio activo, Ser 42, Lys-386 y Arg-364 del modelo de enolasa.
   6. Obtenga el archivo del modelo de monómero PEP de la biblioteca de monómeros Coot haciendo clic en Archivo > Obtener monómero e ingresando PEP como código de 3 letras.
   7. Mueva la molécula de PEP a la densidad usando la opción Rotar / Traducir - Zona/Cadena/Molécula en el menú de la barra lateral. Utilice el refinamiento del espacio real en Coot para ajustar la molécula de PEP en la densidad haciendo clic en Real Space Refine Zone en el menú de la barra lateral. Combine el ligando ajustado con el archivo Apo-enolase.pdb utilizando la opción fusionar molécula en la pestaña de edición . Guarde el modelo como PEP-Enolase.pdb.
      NOTA: También se puede usar ligando> opción de ligando Jiggle-Fit para ajustar el ligando también.
   8. Para añadir ligandos al resto de monómeros en el archivo de coordenadas, haga clic en Calcular > Herramientas NCS > ligandos NCS. Aparecerá una ventana separada llamada Buscar ligandos relacionados con NCS. Para la opción Proteína con NCS, seleccione el archivo de coordenadas Apo-enolase.pdb y el ID de cadena A como cadena maestra NCS.
      1. Para la molécula que contiene el ligando, seleccione Apo-enolase.pdb como archivo de coordenadas y el ID de cadena, J y número de residuo 1 a 1. Haga clic en Buscar puestos de candidatos. Aparecerá una ventana llamada Ligandos ajustados con una lista de posiciones candidatas. Evalúe el ajuste haciendo clic en los ligandos candidatos individuales y analice el ajuste visualmente.
         NOTA: En Servalcat/Refmac, solo se puede proporcionar un modelo de monómero, y se puede dar la simetría utilizada en la reconstrucción para obtener un modelo expandido.
   9. También se observó densidad adicional para las moléculas de solvente cerca del ligando. Las estructuras cristalinas de alta resolución de la enolasa de varios homólogos sugieren la presencia de dos iones Mg^{2+ 40,41}, lo que probablemente estabiliza la carga negativa del intermediario de reacción. Modele dos iones Mg²⁺ en la densidad del sitio activo haciendo clic en colocar átomo en el puntero y seleccionando MG de la lista de tipos de átomo de puntero.
      NOTA: La geometría y la distancia del enlace se pueden utilizar como guía para seleccionar el ion metálico. En el caso del Mg²⁺ unido a átomos de oxígeno en residuos proteicos, la distancia de enlace varía entre 2,1 Å -2,4 Å, con una geometría octaédrica. Sin embargo, en el caso de mapas de baja resolución, la esfera de coordinación suele estar incompleta y la distancia también puede variar debido a las limitaciones de la resolución.
   10. Repita el paso 1.2.8 para agregar los iones Mg²⁺ en los monómeros relacionados con la simetría.
   11. Guarde el modelo haciendo clic en Archivo > Guardar coordenadas > Seleccionar nombre de archivo > y escribiendo Enolasa + PEP + Mg.pdb.
   12. Abra la GUI de Phenix (consulte la Tabla de materiales). Ejecute un trabajo de refinamiento del espacio real con Enolase+PEP+Mg.pdb y emd_30989.map como modelo de entrada y mapa, respectivamente, utilizando los parámetros predeterminados. Este paso se realiza de forma iterativa con Coot para lograr un buen ajuste y geometría del modelo de mapa.
       NOTA: El mapa de diferencias sin nitidez se utiliza para demostrar la presencia de ligando, como en una figura. Para fines de modelado, se ha utilizado el mapa nítido del factor B y se recomienda. El mapa de enfoque definido del factor B también se puede utilizar para calcular el mapa de diferencias con fines de demostración, a diferencia del mapa sin enfoque. Sin embargo, si la resolución es menor en la región donde se une el ligando, es posible que el factor B único utilizado para afinar todo el mapa no revele claramente la densidad del ligando.
3. Visualización y generación de figuras del ligando modelado
   1. Abra el modelo refinado de Enolasa+PEP+Mg del trabajo final de refinamiento de Phenix en PyMOL⁴² (consulte la Tabla de materiales) haciendo clic en Archivo > Abrir y seleccionando el nombre del archivo.
   2. Cargue el emd-30989.map (mapa nítido vinculado a PEP) haciendo clic en Archivo > Abrir y seleccionando el nombre del archivo.
   3. Cambie el nombre del mapa a PEP-sharpened haciendo clic en acciones > renombrar junto al objeto emd_30989 y escribiendo PEP-sharpened.
      NOTA: En la mayoría de los casos, por ejemplo enolasa, los mapas cuando se abren en pymol se normalizan ya que la opción normalizar mapa está marcada de forma predeterminada en pymol. Como los mapas crioEM se centran en una caja más grande, la normalización incluirá todo lo que hay en la caja. Por lo tanto, la normalización se puede desactivar antes de abrir en pymol.
   4. Seleccione los ligandos haciendo clic en mostrar > secuencia.
   5. Escriba isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 en la línea de comandos y presione enter.
   6. Colorea el mesh_ligand azul haciendo clic en la última casilla, C, junto al objeto mesh_ligand.
   7. Muestra los residuos del sitio activo, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 y Lys-386 interactuando con el PEP y Mg²⁺ en la representación de palo y esfera, respectivamente, y la enzima enolasa en la representación de dibujos animados.
   8. Ray trace escribiendo ray 3600, 3600 para generar imágenes de calidad de publicación y guardarlas como un archivo png haciendo clic en Archivo > guardar y eligiendo PEP.png como nombre de archivo.

2. Modelado de ligandos en el receptor metabotrópico de glutamato mGlu₅

1. Identificación y modelado de la densidad de ligandos en el mapa crioEM de mGlu unido a agonistas y antagonistas₅
   1. Descargue los dos semimapas junto con sus archivos de coordenadas correspondientes para cada uno de los complejos mGlu₅ unidos a agonistas (EMD-31536, 7fd8.pdb) y unidos a antagonistas (EMD-31537,7fd9.pdb).
   2. Abrir ChimeraX
      1. Abra el archivo de coordenadas, 7fd8.pdb, haciendo clic en abrir y seleccionando 7fd8.pdb.
      2. Escriba delete ligando en la línea de comandos y pulse Intro.
      3. Del mismo modo, utilice el comando delete/B para eliminar la cadena B.
         NOTA: Los ligandos y las cadenas se pueden eliminar usando el menú desplegable en la parte superior usando seleccionar y acciones > átomos/enlaces > eliminar.
      4. Guarde el pdb sin ligar escribiendo lo siguiente en la línea de comandos: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 denota el ID del modelo.
      5. Repita los pasos 2.1.2.1-2.1.2.4 para 7fd9.pdb.
   3. Abrir CCP-EM. Cree un nuevo proyecto llamado mGlu₅ y especifique el directorio del proyecto y el nombre de usuario.
      1. Abre Relion desde las opciones del panel izquierdo.
         1. Vaya a la pestaña Creación de máscara .
         2. Proporcione uno de los semimapas para EMD-31536 como entrada.
            NOTA: Relion acepta mapas con .mrc como sufijo, y los mapas EMD tienen el sufijo .map. Los archivos de mapas se pueden abrir en ChimeraX para su examen y guardarlos en formato .mrc.
         3. En la pestaña máscara , proporcione el tamaño de píxel como 0,89 Å y el umbral de binarización inicial como 0,007.
         4. Ejecute el trabajo con el alias 31536 (o cualquier otro nombre que sea fácil de seguir).
         5. Del mismo modo, cree una máscara para el medio mapa EMD - 31537.
      2. Abra el programa Refmac Servalcat desde las opciones del panel izquierdo en CCPEM.
         1. Proporcione el nombre como mGlu₅_agonist.
         2. Importe el archivo .pdb 7fd8_noligand_chainA tal y como se describe en la sección 2.1.2.4 del modelo. Proporcione la ubicación de los dos medios mapas y la máscara correspondiente creada en Relion.
         3. Especifique la resolución como 3,8 Å.
         4. Vaya a la configuración de refinamiento > Simetría estricta y mencione C2 como la simetría del grupo de puntos Relion.
         5. Inicie el programa presionando el botón de inicio en la parte superior.
   4. Una vez finalizado el trabajo, abra el resultado en Coot (opción disponible en la parte superior de la sección de resultados). Esto mostrará un diffmap.mtz en Coot de forma predeterminada, donde los colores rojo y verde indican densidades negativas y positivas, respectivamente.
      1. Vaya a Administrador de visualización > propiedades del mapa de diferencias con la etiqueta DELFWT PHDELWT y cambie el nivel de contorno a 4.0 (valor absoluto).
         NOTA: La elección del umbral depende del mapa y la resolución.
      2. Oculte el mapa etiquetado como FWT PHWT y la molécula etiquetada como refined.pdb.
      3. Mueva el mapa con el ratón para visualizar la densidad positiva (de color verde) y lleve la mancha más grande al centro.
      4. Vaya a Archivo > Obtener monómero, escriba QUS y presione enter.
      5. Vaya a Calcular > modelado > molécula de ajuste de cuerpo rígido y haga doble clic en el monómero QUS para ajustar la molécula para que se ajuste a la densidad Fo-Fc.
      6. Utilice la opción fusionar molécula en la pestaña de edición para agregar la molécula QUS al archivo de coordenadas, refined.pdb.
      7. Repita los pasos 2.1.4.3-2.1.4.6 para ajustar el ligando con código de monómero NAG y CHS en la mancha más pequeña en la extracélula y en la parte superior del dominio transmembrana, respectivamente.
      8. Guarde la coordenada como refined_ligands.pdb.
         NOTA: La resolución del dominio transmembrana (TM) es menor y, por lo tanto, no se discute aquí.
2. Refinamiento de la estructura ligada mGlu₅
   1. Abra CCPEM y clone el trabajo de refinamiento anterior (paso 2.1.3.2) y ejecútelo con el refined_ligands.pdb y el mapa nítido (emd. 31536.mrc) como entrada, utilizando los parámetros predeterminados y la simetría C2.
      NOTA: Si el programa no reconoce el ligando, entonces se deben proporcionar los archivos CIF. Estos archivos CIF se pueden descargar desde la PDB o generar utilizando varios programas (consulte el paso 3.1.1 para obtener más detalles).
3. Visualización y generación de figuras en PyMOL
   1. Abra el modelo refined_expanded.pdb del último trabajo de refinamiento de Refmac en PyMOL.
   2. Vaya a Archivo > Abrir y busque el directorio de trabajos Refmac para cargar el archivo diffmap_normalised_fofc.mrc (mapa de diferencias con el trabajo de Servalcat en el paso 2.1.3.2).
      NOTA: Si los archivos de la extensión .mrc no son visibles durante la navegación, cambie el tipo de archivo a todos los archivos y navegue.
   3. Seleccione los ligandos mediante la visualización > secuencia.
   4. Vaya al botón Acciones y cambie el nombre de la selección a ligandos.
   5. Escriba lo siguiente en la línea de comandos y presione enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligandos, tallar = 2.5.
      NOTA: El ancho de la malla se puede ajustar. Aquí, se usa un ancho de malla de 0.2, y esto se establece usando el siguiente comando: set mesh_width=0.2.
   6. Haga clic con el botón derecho en uno de los monómeros y vaya a encadenar > color para especificar el color de cada monómero. Colorea el ligando y la malla usando el último cuadro etiquetado como c en el ligando y mesh_ligands objetos. El dímero del receptor mGlu₅ se muestra en una representación de dibujos animados, y los monómeros están coloreados en verde azulado y trigo. Los ligandos se muestran en palo, y la malla que contornea los ligandos es de color verde.
   7. Utilice las acciones > la opción orientar/centrar/hacer zoom contra los objetos y ajústelos manualmente para visualizar la malla y con claridad. Seleccione los residuos cercanos que podrían estar interactuando con el ligando, por ejemplo, Tyr64, Trp100 para QUS y, según sea necesario, muestre su cadena lateral o cadena principal o ambas como representación de barra.
   8. Ray trace para generar imágenes de alta resolución y guardarlas como un archivo png.
      NOTA: Los pasos anteriores se repiten para el mapa enlazado antagonista EMD-31537 y el archivo de coordenadas correspondiente PDB-7fd9.

3. Modelado del inhibidor, la desoxigalacto-nojirimicina (DGN) y las moléculas de disolvente en un mapa nítido de alta resolución de la β-galactosidasa

1. Identificación del ligando, DGN, utilizando los semimapas de cryoEM
   1. Preparación de un diccionario de ligandos desconocidos para el modelado [Desoxigalacto-nojirimicina(DGN)]
      NOTA: El archivo del diccionario de desoxigalacto-nojirimicina se incluye en la biblioteca de monómeros CCP4 como DGJ (ID de ligando de 3 letras). Sin embargo, aquí se considera como un ligando nuevo y desconocido para ilustrar el proceso de generación de archivos de diccionario para ligandos desconocidos, se utiliza DGN como código de 3 letras.
      1. Abra el resumen del compuesto de desoxigalacto-nojirimicina (DGN) en la página web de PubChem y copie la cadena de sonrisas para el compuesto desoxigalacto-nojirimicina.
      2. Abra Phenix > ligandos > eLBOW.
      3. Especifique la cadena smiles como entrada.
      4. Especifique el método de optimización de construcción de ligandos adecuado. En este caso, se utiliza una optimización sencilla.
      5. Pega la cadena de sonrisas químicas en la sección de definición del ligando.
      6. Proporcione un título de trabajo, un prefijo de archivo de salida y un ID de ligando de forma adecuada y pulse ejecutar.
         NOTA: La salida del trabajo contiene un archivo de coordenadas, DGN.pdb, y un archivo de diccionario, el archivo DGN.cif. Jligand²⁹ también se puede usar para hacer el archivo cif.
   2. Descargue el archivo de coordenadas de la β-galactosidasa (6tsh.pdb) de la PDB y elimine las coordenadas de las cadenas de proteínas (B, C, D), ligando, DGN y otras moléculas de solvente mediante un editor de texto o la opción de eliminar cadena/zona en Coot. Guarde el archivo de coordenadas como apo-betaGal_chainA.pdb.
      NOTA: ChimeraX o Pymol también se pueden utilizar para eliminar la molécula de ligando/disolvente.
   3. Descargue los semimapas (emd_10563_half_map_1.map y emd_10563_half_map_2.map) de los datos adicionales de la entrada EMD-10563 de EMDB.
   4. Abra CCPEM y utilice Relion para crear la máscara del mapa en un umbral de 0,01 (como se describe en los pasos 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
   5. Ejecute Servalcat (dentro de la suite CCPEM como se describe en el paso 2) con los semimapas obtenidos en el paso 3.1.3 y el apo-modelo en el paso 3.1.2 y la simetría D2.
      NOTA: El modelo debe estar alineado con uno de los semimapas o mapas completos para localizar la densidad del ligando. Esto se puede hacer ajustando el modelo en el mapa usando ChimeraX y luego guardando las coordenadas relativas a la mitad del mapa. En este ejemplo, los semimapas y el mapa principal de EMDB tienen diferentes tamaños de caja/cuadrículas, y el modelo debe colocarse en el medio mapa.
   6. Abre la focha.
      1. Abra DGN.cif para el diccionario de ligandos como se generó en el paso 3.1.1 con Phenix eLBOW. Esto se hace yendo al diccionario CIF File > Import y navegando por el directorio de trabajos eLBOW.
      2. Abra los archivos de coordenadas de proteína y ligando, apo-betaGal_chainA.pdb del paso 3.1.2 y DGN.pdb del paso 3.1.6 respectivamente.
      3. Abra automáticamente el archivo diffmap.mtz desde el trabajo de Servalcat (paso 3.1.5) y visualice el mapa etiquetado DELFWT PHDELWT en Coot. Contornee el mapa en un umbral de ~ 4 valor absoluto.
         NOTA: Es importante verificar las estadísticas del mapa escribiendo header map.mrc o usando herramientas en Chimera. Se puede obtener toda la información necesaria sobre el tamaño de píxel, el tamaño de la caja, la densidad mínima, media y máxima, y la desviación rms de la densidad media. Es crucial comprobar el tamaño de píxel y el tamaño de la caja de los mapas crioEM. El mapa 3D representa el volumen del mapa proteína-ligando en una cuadrícula de vóxeles 3D. En cada vóxel, se almacena el valor potencial del electrón o la probabilidad de encontrar el electrón en esa ubicación. Cuando se elige un umbral determinado, los vóxeles, que tienen una densidad inferior al valor especificado, se establecen en cero. Esto ayuda a minimizar el ruido experimental en el mapa y a visualizar mejor las características del mapa⁴³. Por lo tanto, el mapa debe contornearse en un umbral en el que las características del mapa sean fácilmente visibles y el ruido en el mapa sea mínimo.
      4. Ve a Ligando > Buscar ligandos. En la nueva ventana que aparece, seleccione el ligando, el mapa de diferencias y el modelo apo-betaGal_chainA.pdb. Deje las otras opciones en su configuración predeterminada y haga clic en Buscar ligandos para iniciar la búsqueda.
      5. Se muestra una lista de los principales resultados que muestran la densidad potencial de ligandos con una copia colocada en cada una de las densidades. Compruebe manualmente todos los golpes donde se ha colocado el ligando. Mantenga los aciertos más probables y elimine los ambiguos.
         NOTA: La diferencia en la densidad del mapa en un umbral alto sugiere claramente la presencia del ligando en el sitio activo.
2. Modelado del ligando DGN y las moléculas de disolvente
   1. Realice un refinamiento del espacio real en Coot para ajustar el ligando (DGN.pdb) en el mapa de densidad de diferencia y, a continuación, combine las coordenadas del ligando con el apo-betaGal_chainA.pdb y guárdelo como betaGal_chainA+ligando.pdb.
      NOTA: Los ligandos que se han colocado en regiones de otras cadenas se pueden eliminar y no se fusionan mientras se guarda el archivo de coordenadas fusionado. Los ligandos de otras cadenas pueden ser generados por ligandos NCS como se muestra en el ejemplo 1, paso 1.2.8, o en Refmac/Servalcat utilizando la expansión de simetría.
   2. Ejecute otro trabajo de Servalcat como el anterior (paso 3.1.5) con betaGal_chainA+ligand.pdb como modelo de entrada y los semimapas (del paso 3.1.3) con simetría D2.
   3. La densidad diferencial (del trabajo de Servalcat en el paso 3.2.2) que rodea al ligando modelado sugiere la presencia de las moléculas de disolvente que se coordinan con la molécula del ligando. La densidad central cerca del ligando parece ser demasiado grande para las moléculas de agua.
   4. Sobre la base de los datos bioquímicos y estructurales anteriores que indican la presencia de Mg²⁺ en esa posición, el ion Mg²⁺ se modela aquí haciendo clic en la opción colocar átomo y especificando el átomo como MG.
   5. Modele las moléculas de agua en la diferencia de densidad en el sitio activo que indican la presencia de una molécula de solvente haciendo clic en el átomo de posición y seleccionando agua.
      NOTA: Coot también tiene la opción de recoger moléculas de agua automáticamente. Aquí, dado que la atención se centra solo en el sitio activo, las moléculas de agua se agregan manualmente.
   6. Combine las coordenadas de Mg²⁺ y agua con el archivo betaGal+ligando.pdb y guárdelo como betaGal+ligando+solvent_chainA.pdb.
   7. Con el betaGal+ligando+solvent_chainA.pdb, realice el refinamiento de Refmac en Servalcat con simetría D2.
      NOTA: El mapa de diferencia de salida de este trabajo puede servir como medio para validar si el ligando se ha modelado con precisión, ya que el mapa de diferencia debe mostrar una densidad residual positiva o negativa mínima.
3. Visualización y generación de figuras con PyMOL
   NOTA: Los pasos que se describen a continuación proporcionan algunos ejemplos de cómo hacer figuras utilizando modelos y mapas que se pueden utilizar para ilustrar la presencia de ligandos y solventes.
   1. Abra el refined_expanded.pdb del último trabajo de Servalcat (paso 3.2.6) con el ligando y el disolvente modelados.
   2. Seleccione diferentes cadenas por separado para colorearlas como magenta, amarillo, verde y verde azulado, como se describe en el ejemplo 2.
   3. Vaya a Mostrar secuencia >, realice selecciones separadas para las moléculas de agua, magnesio y DGN, y cambie el nombre de los objetos a agua, MG y DGN, respectivamente.
   4. Muestre MG y moléculas de agua como esferas seleccionando los objetos, haciendo clic con el botón derecho y mostrando > esfera. Del mismo modo, muestre el ligando en la representación de barra y coloree los ligandos y solventes de manera adecuada. En este caso, el ligando ha sido coloreado de amarillo por un heteroátomo, el ion de magnesio es de color púrpura y las moléculas de agua son de color rojo.
   5. Seleccione DGN, MG y moléculas de agua. Haga clic con el botón derecho y seleccione las acciones > copiar en el objeto y asígnele el nombre de ligandos.
   6. Abra el archivo diffmap_normalised_fo.mrc del trabajo de Servalcat en el paso 3.2.6 y cámbiele el nombre a ligand_fo.mrc. Escriba el siguiente comando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligandos, tallar=2.
      NOTA: La opción de tallado de 2 Å se aplica alrededor de los átomos y, dependiendo de la resolución y la calidad de los mapas, se pueden usar valores de 3-5. Además, al abrir mapas cryoEM en PyMOL, es aconsejable desactivar normalize_ccp4_maps
   7. Utilice las acciones > las opciones de orientación/zoom y ajústelas manualmente para visualizar los ligandos y los residuos cercanos que interactúan (cuando corresponda) como se muestra en el paso 2.3.7.
   8. Ray trace estas escenas para guardar imágenes de alta resolución utilizando el comando ray 3600, 3600.
   9. Guarde la escena como .png archivo.
      NOTA: Los siguientes pasos son opcionales y describen el proceso para visualizar (1) la densidad de diferencia (Fo-Fc) para el ligando no modelado, DGN, (2) la densidad (Fo) del ligando modelado, DGN, así como la densidad de diferencia (Fo-Fc) para solventes no modelados y, por último, para (3) la densidad (Fo) para el ligando modelado, DGN y las moléculas de solvente en el sitio activo.
   10. Para demostrar la presencia del ligando, DGN y las moléculas de disolvente circundantes utilizando el mapa de diferencias, abra diffmap_normalised_fofc.mrc del trabajo de Servalcat en el paso 3.1.5. Cambie el nombre del archivo de mapa a unliganded_fofc.mrc haciendo clic en acciones > cambiar el nombre junto al objeto de mapa. Escriba lo siguiente en la línea de comandos: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligandos, nivel=6, tallar=2.
   11. Para demostrar la densidad del ligando modelado, DGN, y la densidad de disolvente no modelada circundante, abra el diffmap_normalised_fo.mrc y el diffmap_normalised_fofc.mrc del trabajo de servalcat en el paso 3.2.2. Cambie el nombre del diffmap_normalised_fo.mrc como DGN_fo y del diffmap_normalised_fofc.mrc como DGN_unmodelled_solvents_fofc.
   12. Seleccione MG y agua en Mostrar secuencia de >, haga clic con el botón derecho y seleccione las acciones > copiar en el objeto y asígnelas como solventes.
   13. Escriba lo siguiente en la línea de comandos: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, nivel=3, tallar=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solventes, nivel=6, tallar=2.
       NOTA: El mesh_DGN_fo mostrará la densidad del ligando, y el mesh_solvent_fofc mostrará la densidad omitida para el MG y el agua.
   14. Por último, para visualizar los ligandos modelados, así como las moléculas de disolvente circundantes en el sitio activo, abra el diffmap_normalised_fo.mrc del trabajo de Servalcat en el paso 3.2.6 y cámbiele el nombre a ligand_fo.mrc.
   15. Escriba lo siguiente en la línea de comandos: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligandos, level=3, carve=2.
       NOTA: Aquí, usamos diffmap_normalised_fo.mrc, pero el mapa final afilado se puede usar para mostrar la densidad de ligandos y los residuos circundantes. Es una buena práctica mencionar el tipo de mapa utilizado, los valores de nitidez del factor B en la leyenda de la figura.
   16. El ancho de la malla y el tamaño de la esfera se pueden establecer escribiendo los siguientes comandos: set mesh_width=0.2 y set sphere_scale=0.25 para reducir el tamaño de la esfera.
   17. Colorea la malla fo de azul y la malla fofc de verde.
   18. Utilice las acciones > las opciones de orientación/zoom y ajústelas manualmente para visualizar los ligandos y los residuos cercanos que interactúan (cuando corresponda), como se muestra en el paso 2.3.7.
   19. Ray trace estas escenas para guardar imágenes de alta resolución utilizando el comando ray 3600, 3600.
   20. Guarde las escenas individuales como archivos .png.

4. Efecto de la resolución en el modelado de ligandos en β-galactosidasa

1. Abra Terminal y vaya al directorio que contiene los dos medios mapas.
2. Abra los dos medios mapas (paso 3.1.3) en formato .map en ChimeraX, visualícelos y guárdelos como emd10563_half1_1_unfil.mrc y emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. La máscara creada en el paso 3.1.4 se puede utilizar como entrada.
4. Ejecute un trabajo de posprocesamiento en Relion utilizando semimapas y máscaras de los pasos 4.2-4.3, con los parámetros predeterminados.
5. Repita el paso 4.4, ahora con un Skip FSC-weighing habilitado y especificando un filtro de paso bajo ad-hoc de 3 Å.
6. Repita el paso 4.4 con un filtro de paso bajo ad-hoc de 3,5 Å.
7. Abra los mapas (postprocess.mrc) de los pasos 4.4-4.6, filtre a diferentes resoluciones y el archivo de coordenadas del modelo, 6tsh.pdb (alineado con los semimapas en ChimeraX) del paso 3.1.2 en PyMOL. Cambie el nombre de los diferentes mapas a 3.0, 3.5 y 2.3 según lo definido por sus resoluciones.
   NOTA: Se puede confirmar el filtrado de paso bajo de los mapas visualizándolos en ChimeraX o Coot.
8. Visualice el efecto de la resolución en la densidad de las moléculas de ligando y disolvente creando una malla de 2 Å alrededor de las moléculas de ligando y disolvente a un umbral de 6σ como se describe en el paso 3.3.6 con mapas filtrados a diferentes resoluciones.

Results

Ejemplo 1
La enzima enolasa de M. tuberculosis cataliza el penúltimo paso de la glucólisis y convierte el 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato (PEP), que es un intermediario esencial para varias vías metabólicas^44,45. Los datos de CryoEM para las muestras de apo-enolasa y enolasa unida a PEP se recolectaron con el mismo tamaño de píxel de 1.07 Å, y el procesamiento de imágenes se realizó con Relion 3.1 ^46,47. Las estructuras de la apo-enolasa y la pep-enolasa se determinaron a 3,1 Å y 3,2 Å, respectivamente⁴⁸. Los mapas y modelos se depositaron en EMDB y PDB^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x y PDB-7e51). El mapa crioEM de la enzima muestra que es un octámero en la solución (Figura 1A). Con el fin de identificar la densidad del ligando en el mapa de PEP-enolasa, se seleccionaron los mapas no nítidos de la apoenzima y la enzima unida a PEP, y se calculó un mapa de diferencias en ChimeraX, restando el mapa de PEP-enolasa del mapa de apoenzima. Se observó una densidad distinta (verde) en un umbral alto, lo que sugería la presencia del ligando (Figura 1B). El modelado de la cadena de proteínas en el mapa sin nitidez indicó claramente que la densidad adicional está presente en el sitio activo de la proteína (Figura 1C). A continuación, el ligando, PEP, se modeló en el mapa agudizado del factor B utilizando Coot, y el modelo proteína+ligando se refinó en el espacio real con Phenix. Se modelaron dos iones Mg²⁺ en la densidad observada en las proximidades del ligando (Figura 1D). El ligando, PEP, adopta una orientación similar a la observada en otros homólogos de enolasa, y varios residuos de sitios activos, como Lys-386, Arg-364, forman interacciones de enlace de hidrógeno con el ligando PEP. Los iones Mg²⁺ forman enlaces de coordinación metálicos con Asp-241, Glu-283, Asp-310 y el fosfato de PEP (Figura 1D).

Ejemplo 2
En ausencia de una estructura de apoproteína disponible o si la proteína sufre un gran cambio conformacional, no es posible calcular los mapas de diferencias como se describió anteriormente. En 2021, el grupo de Garib Murshudov en el Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge, presentó Servalcat²², que implementa un flujo de trabajo de refinamiento utilizando Refmac y también calcula un mapa de diferencia Fo-Fc después del refinamiento. Una densidad de diferencia Fo-Fc positiva sugiere la presencia de moléculas/ligandos que no se incluyeron en el modelo durante el refinamiento, esencialmente un mapa de omisión. Sin embargo, se recomienda evaluar primero el ajuste del modelo al mapa en general y luego evaluar el mapa de diferencias de densidad.

Para ilustrar el uso de Servalcat/Refmac, se eligió mGlu₅, un receptor acoplado a la proteína G dimérica que se une al neurotransmisor L-glutamato. Al unirse el agonista, L-quiscualato, el dominio extracelular se reorienta, lo que desencadena la rotación de los 7TM, acercándolos para estabilizar el estado activado. Por lo tanto, se observa un gran cambio conformacional entre el apo/antagonista vs. estados ligados agonistas⁵¹ (Figura 2A y Figura 2E). Los dos semimapas para los complejos unidos al agonista (EMD-31536) y al antagonista (EMD-31537) se obtuvieron de EMDB, y los mapas de crioEM muestran una resolución variada en toda la molécula y un dominio extracelular mejor resuelto. Posteriormente, estos se utilizaron como entradas en Servalcat junto con la apoproteína como modelo para calcular la diferencia o el mapa Fo-Fc para cada conjunto de datos. Este mapa mostraba claramente la presencia de varias moléculas de ligando (no proteínas). La resolución estimada por FSC (correlación de la Concha de Fourier) para los complejos unidos al agonista y al antagonista fue de 3,8 Å y 4,0 Å, respectivamente. En el caso de la mGlu₅ unida a agonistas, el mapa de diferencias Fo-Fc de Servalcat mostró la presencia tanto del agonista (L-quiscualato) (Figura 2B) como de N-AcetilGlucosamina (NAG) (Figura 2C) en la ECD del receptor (debido a la menor resolución de la TMD, aquí nos centramos solo en la ECD y la parte superior de la TMD). Se observa que los residuos de proteínas, incluidos Tyr-64, Trp-100, Ser-151 y Thr-175, interactúan con el agonista. La densidad cerca del residuo de Asn-210 sugirió la presencia de N-acetil glucosamina (Figura 2C). Se observó una densidad consistente con el hemisuccinato de colesterol, que se añadió durante la purificación de mGlu_5, cerca de la parte superior de la hélice transmembrana 1 (Figura 2D). Dado que la resolución es moderada y el ligando, L-quiscualato, puede colocarse en diferentes orientaciones, se utilizó como guía la estructura previa del dominio extracelular con el ligando (PDB-6N50) para modelar el ligando. La unión del antagonista estabiliza el estado abierto o en reposo del receptor (Figura 2E). Se observó una densidad consistente con el antagonista LY341495 en la bisagra del lóbulo I y el lóbulo II del dominio de la trampa para moscas de Venus en el ECD. El antagonista interactúa con residuos similares a los del agonista. La interacción de apilamiento entre Tyr-223 en el lóbulo II con el antagonista estabiliza el receptor en un estado abierto (Figura 2F). De manera similar a la estructura del agonista, se observó glicosilación o la presencia de restos de N-acetilglucosamina cerca de Asn-210 (Figura 2G).

Ejemplo 3
El tercer ejemplo dilucida el protocolo para modelar ligandos y moléculas de solvente de tamaño fragmentado o pequeño en mapas CryoEM de alta resolución. El descubrimiento de fármacos basado en fragmentos (FBDD) se ha convertido en un método potente e innovador en el desarrollo de nuevas terapias basadas en dianas en diversas áreas de enfermedades, lo que lo convierte en una vía prometedora en la investigación y el desarrollo farmacéutico^52,53. La FBDD comienza con el cribado y la selección cuidadosa de fragmentos pequeños, altamente solubles y de bajo peso molecular de moléculas que se unen a proteínas diana específicas o biomoléculas de interés. La determinación de las estructuras de estos complejos proteína-fragmento revela el modo de unión de estos fragmentos, que sirve como guía para diseñar moléculas similares a fármacos más grandes y complejas con una afinidad y especificidad crecientes hacia la proteína diana⁵⁴. Sin embargo, este método exige una densidad de ligando de alta resolución para determinar con precisión la pose y colocar correctamente los grupos funcionales del ligando¹⁵.

β-galactosidasa, una de las primeras estructuras de alta resolución que se determinaron a partir de los avances en la tecnología crioEM, es una enzima homotetrámera de 450 kDa bien estudiada que cataliza la hidrólisis de la lactosa a glucosa y galactosa⁵⁵. Para mostrar el uso de crioEM en FBDD, Astex, Reino Unido, determinó la estructura de la β-galactosidasa con un inhibidor del tamaño de un fragmento, la desoxigalacto-nojirimicina (DGN) unido al sitio activo (EMDB-10563, PDB:6tsh)⁵⁶. Este conjunto de datos se utiliza para ilustrar el protocolo para modelar ligandos y disolventes sin ambigüedades en mapas de alta resolución. Para mostrar el efecto de la resolución en el modelado y la visualización de ligandos, los mapas se filtraron a 3,0 Å y 3,5 Å en el paso de posprocesamiento en Relion. Esto pone de manifiesto la calidad de la densidad del mapa a diferentes resoluciones y subraya la necesidad de una mayor resolución para el modelado de ligandos y disolventes.

La enzima es un tetrámero con simetría D2 en solución (Figura 3A). El mapa de diferencias (entre el mapa y el modelo), calculado por Servalcat, sugirió la presencia de DGN y varias moléculas de disolvente en el sitio activo de la enzima (Figura 3B). A una resolución estimada de 2,3 Å, la densidad mostró características de alta resolución, lo que ayudó en el modelado preciso del inhibidor en el sitio activo de la proteína. Se observaron interacciones entre DGN y Tyr-503 y His-540 (Figura 3C). La diferencia de densidad también sugirió la presencia de moléculas de solvente que interactúan con el DGN, así como con los residuos de proteínas. Se modelaron Mg²⁺ y varias moléculas de agua en la densidad (Figura 3D). Se observan enlaces de coordinación de metales entre Mg²⁺ y Glu-416, Glu-461 y varias moléculas de agua (Figura 3D). Se observó que el Mg²⁺ interactuaba con el DGN a través de una molécula de agua.

A una resolución más baja de 3,5 Å y 3,0 Å, la densidad del ligando se asemeja a una mancha y carece de características de alta resolución cruciales para el modelado preciso del ligando (Figura 4A, B). La densidad de las moléculas de agua era casi inexistente a estas resoluciones. En resumen, con el aumento de la resolución, especialmente superior a 3,0 Å, la densidad permitió modelar un mayor número de moléculas de agua (Figura 4C,D). El posicionamiento correcto del centro quiral del ligando se logró a ~2.3 Å (Figura 4C,D) debido a la presencia de características distintivas en el mapa que guiaron la colocación, así como el modelado de las moléculas de agua y Mg²⁺. En comparación, la densidad de Mg²⁺ permaneció discernible en todo el rango de resolución (Figura 4A-C).

Figura 1: Modelado del ligando fosfoenolpiruvato en la enolasa de M. tuberculosis. (A) muestra el mapa agudizado del factor B de la enzima enolasa unida a PEP. El mapa sugiere que la enolasa es octamérica en solución, y cada monómero en el mapa tiene un color diferente. (B) muestra un mapa crioEM sin enfocar de la enzima apo-enolasa en gris con el mapa de diferencias (entre los mapas unidos a PEP y los mapas no enfocados a la apo-enolasa) superpuesto en verde, lo que sugiere la presencia del ligando, PEP. Este es un mapa de demostración para mostrar la presencia de ligandos. (C) muestra el ajuste del modelo de enolasa en el mapa crioEM sin enfocar, destacando la posición de la densidad de diferencia en relación con la proteína. El modelo de proteína se muestra en una representación de dibujos animados y se colorea en Chainbow. Esta figura muestra que la densidad extra (verde) está presente en el sitio activo de cada monómero. (D) muestra el ligando, PEP, encerrado en el mapa nítido del factor B, de color azul. Además, también se observó la densidad de dos iones Mg²⁺, que forman enlaces de coordinación de metales con varios residuos de sitios activos, incluidos Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 y átomos de ligando. El ligando realiza interacciones de enlace de hidrógeno con Lys-386, Lys-335 y Arg-364. Los residuos de proteínas se muestran en la representación de barras, y los iones Mg²⁺ se muestran como esferas púrpuras. Las figuras en paneles (A-D) se generaron con Pymol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Identificación, modelado y visualización de varios ligandos en el receptor mGlu₅ . Los mapas de omisión Fo-Fc se obtuvieron utilizando Servalcat. (A) muestra la estructura del dímero del receptor mGlu₅ (PDB-7fd8) en una representación de dibujos animados, con cada monómero coloreado en verde azulado y trigo, respectivamente, y unido al agonista L-quiscualato. Todos los ligandos que se identificaron en el dominio extracelular y en la parte superior del dominio transmembrana del receptor están encerrados en el mapa de omisión Fo-Fc, coloreados de verde y contorneados a 6σ. (B) destaca el ajuste del agonista, L-quiscualato encerrado en el mapa de diferencias. L-quisqualate interactúa con varios residuos de mGlu₅ , incluidos Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 y Gly-280. Las interacciones del enlace H se representan mediante guiones rojos. En (C), se evidencia una densidad adicional cerca de Asn-210, que está presente en el dominio extracelular del receptor, y se modeló la molécula de N-acetilglucosamina (NAG) en esta densidad. Para mayor claridad, el NAG no está vinculado al Asn en la figura actual. (D) muestra la diferencia en la densidad del hemisuccinato de colesterol (CHS) en verde cerca de la superficie expuesta a lípidos del receptor. La molécula CHS, representada en los palos, se modeló en esta densidad. (E) muestra la estructura del receptor mGlu₅ (PDB-7fd9) unida al antagonista LY341495 en la representación de dibujos animados. En (F), una densidad extra en el mapa de diferencia Fo-Fc localizada en la bisagra entre el lóbulo I y el lóbulo II del dominio extracelular indica la presencia del antagonista. Los residuos clave (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 y Tyr-223) alrededor del antagonista se muestran en representaciones de barras, y las posibles interacciones de enlaces de hidrógeno con el antagonista se muestran en guiones rojos. (G) muestra la diferencia de densidad que sugiere la presencia de la molécula NAG cerca de Asn-210 en la estructura unida al antagonista (nótese que el NAG no está vinculado con Asn para mayor claridad). Las figuras se generaron con Pymol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Identificación, modelado y refinamiento de un pequeño inhibidor y moléculas de disolvente en el mapa de alta resolución de la β-galactosidasa (EMD-10563). (A) muestra el modelo de β-galactosidasa resuelto a 2,3 Å (PDB: 6tsh) en una representación de dibujos animados, donde cada monómero tiene un color distinto. El recuadro gris resalta el sitio de unión del ligando. (B) muestra la densidad de diferencia Fo-Fc (de Servalcat) en una malla verde en el sitio activo de la enzima. La diferencia de densidad sugiere la presencia del inhibidor (DGN) y varias moléculas de disolvente en el sitio activo. (C) demuestra que, guiado por el mapa Fo-Fc, se modela el inhibidor desoxigalacto-nojirimicina (DGN) en el sitio activo. Este ligando modelado se representa en formato de varilla y se encierra en la densidad Fo (de Servalcat), que se colorea en blue_mesh. Se observan las interacciones de los enlaces de hidrógeno entre DGN y varios residuos de proteínas, incluidos Tyr-503 y His-540. La densidad de diferencia adicional de Fo-Fc alrededor del ligando (verde) es indicativa de las moléculas de disolvente. (D) El mapa muestra varias moléculas de solvente, incluyendo agua y Mg²⁺, representadas como esferas rojas y moradas, respectivamente, que se modelan en el sitio activo después de asegurarse de que cada molécula de solvente esté unida a proteínas (Glu-416, His-418 y Glu-461) o residuos de ligandos. Las moléculas de agua y el Mg²⁺ están encerrados en la densidad de Fo (malla azul). Se ha visto que el Mg²⁺ interactúa con el ligando, DGN, a través de una molécula de agua. El mapa Fo-Fc (malla verde) en los paneles (B,C) está contorneado a 6σ, mientras que la densidad Fo-malla azul en C y D (del refinamiento de Servalcat después del modelado) está contorneado a 3σ. Las figuras en paneles (A-D) se generaron con Pymol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de la resolución en el modelado de ligandos en β-galactosidasa. Los semimapas de EMD-10563 se utilizaron como entrada en el paso de posprocesamiento de Relion, y los mapas de posproceso combinados se filtraron a resoluciones de 2,3 Å, 3,0 Å y 3,5 Å con diferentes factores B. El mapa que se muestra en todos los paneles está contorneado a 6σ. Para mayor claridad, solo se muestra la columna vertebral de la proteína sin cadenas laterales, ligando o moléculas de solvente en los paneles A, B y C. (A) El mapa se filtra a 3,5 Å y se muestra el sitio activo de la β-galactosidasa. Una mancha parecida al ligando, DGN, se ve a esta resolución, acompañada de algunas manchas más pequeñas en las proximidades. Modelar el ligando en la orientación correcta resulta un desafío debido a la falta de características distintivas en el mapa. (B) Se muestra el mapa filtrado a una resolución de 3.0 Å. Aquí, la mancha de ligando se vuelve un poco más definida, pero aún carece de características en general. También se observan algunas pequeñas manchas más que sugieren moléculas de solvente. (C) El mapa filtrado a una resolución de 2,3 Å revela la densidad del ligando con características distintivas, revelando notablemente la conformación de la silla del iminoazúcar. A esta resolución se observa un número significativo de pequeñas manchas correspondientes a moléculas de agua. La estimación/nitidez automática del factor B en el post-proceso de Relion da un valor de -18 Ų para los mapas filtrados a 3 Å y 3,5 Å, mientras que el valor es de -52 Ų para el mapa filtrado a 2,3 Å. También se pueden realizar diferentes nitidez del factor B de los mapas EM con Coot y son útiles en la construcción de modelos. (D) El panel ilustra que el ligando DGN (representación de barra), Mg²⁺ y las moléculas de agua (como esferas) modelados en el sitio activo y el mapa afilado a 2,3 Å, que se muestra en malla azul que rodea estos átomos. Las figuras en paneles (A-D) se generaron con Pymol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Las mejoras en el hardware y el software de los microscopios han dado lugar a un aumento en el número de estructuras crioEM en los últimos años. Aunque la resolución más alta alcanzada hasta el momento en crioEM de una sola partícula es de 1,2 Å^57,58,59, la mayoría de las estructuras se están determinando alrededor de una resolución de 3-4 Å. El modelado de ligandos en mapas de resolución media a baja puede ser complicado y, a menudo, estar plagado de ambigüedades. Dado el uso generalizado de la crioEM tanto en el mundo académico como en la industria farmacéutica para la investigación traslacional y el descubrimiento de fármacos, es esencial garantizar que los ligandos se modelen correctamente y sin ambigüedades. Por lo tanto, es prudente cuantificar la resolubilidad de los átomos de ligando mediante el cálculo de Q-scores⁶⁰, que ahora está disponible en EMDB como métrica para evaluar la calidad de los mapas y el ajuste del modelo, así como en Chimera.

En el primer ejemplo, se utilizó ChimeraX para calcular el mapa de diferencias en el espacio real entre el apo y los mapas unidos al ligando en la enzima enolasa M. tuberculosis. La densidad adicional en un umbral alto sugiere la presencia del ligando, fosfoenolpiruvato, en el sitio activo y, Mg²⁺ unido al ligando. Es importante tener en cuenta que, en este caso, el mapa es de resolución media (3,2 Å) y las moléculas de agua no se pueden modelar con seguridad (Figura 1). La limitación asociada con este método es que solo se puede aplicar cuando la unión del ligando no induce cambios conformacionales significativos en la proteína. En este caso, no se realizó la normalización del mapa, ya que tanto el conjunto de datos apo como el ligado se adquirieron con el mismo tamaño de píxel y se procesaron con parámetros idénticos en Relion. Sin embargo, vale la pena señalar que cuando se comparan mapas generados por diferentes programas de reconstrucción, como Relion^46,47 y CryoSparc⁶¹, o con diferente calidad, la normalización de los mapas se vuelve esencial antes de que se puedan realizar comparaciones significativas.

El siguiente ejemplo es mGlu₅, que experimenta una gran reorganización molecular tras la unión de agonistas, como se evidencia en las estructuras crioEM^51,62 (Figura 2). En este escenario, no es factible calcular un mapa de diferencias simple entre los receptores no unidos (apo) y unidos al ligando debido a las diferencias sustanciales entre los mapas. En este caso, se utilizó Servalcat, que utiliza semimapas sin nitidez y sin ponderar como entrada para el refinamiento en el espacio recíproco y, posteriormente, calcula un mapa de diferencias entre el mapa experimental y el mapa derivado del modelo. En un umbral alto, se pueden visualizar las diferencias y actuar como guía para la corrección y mejora del modelo. Se observaron varias manchas no modeladas en el dominio extracelular y cerca del transmembrana de mGlu₅ y se utilizaron como guía para modelar ligandos (Figura 2).

El tercer ejemplo muestra cómo la resolución (2,3 Å) desempeña un papel crucial en la interpretación de mapas y el modelado de un inhibidor del tamaño de un fragmento en la β-galactosidasa. En este caso, el reto consistía en identificar un ligando muy pequeño (<200 Da) en el mapa de diferencias de Servalcat en medio del ruido inherente a los datos y modelarlo con precisión. Además de la alta resolución global determinada mediante la correlación de la capa de Fourier (FSC), la resolución local específica del ligando también fue lo suficientemente alta como para garantizar la colocación precisa de los centros quirales de los ligandos (Figura 3). La densidad de las moléculas de disolvente se observó en el mapa de diferencias a lo largo de la enzima y especialmente alrededor del ligando. También se demostró el efecto de la resolución en el modelado de ligandos y átomos de solvente (Figura 4). Es importante tener cuidado al modelar moléculas de agua o solvente porque, en ocasiones, el ruido en un umbral bajo puede parecerse a las moléculas de agua o solvente, lo que puede llevar a posibles interpretaciones erróneas.

Otra consideración importante es que los mapas crioEM por sí solos pueden no ser suficientes para identificar con precisión un ion metálico por sí solos. A menudo se necesitan métodos biofísicos adicionales como la estructura fina de absorción de rayos X extendida (EXAFS) o la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) para confirmar la presencia e identidad del ion metálico. Tanto en las enzimas enolasa como en las β-galactosidasa, se modeló el Mg²⁺ debido a la gran cantidad de información ya disponible sobre estas proteínas, lo que confirma la identidad del ion metálico. Además, la coordinación de los iones metálicos en estos casos, ejemplificada por la geometría octaédrica clásica y las distancias de coordinación casi ideales de Mg²⁺, proporcionó una prueba sustancial de su identidad.

En general, se deben tener en cuenta algunas consideraciones importantes al modelar ligandos en mapas crioEM. Para empezar, es importante elegir el mapa correcto para la identificación y el modelado de ligandos. En todos los casos, se recomienda un mapa o medio mapa sin nitidez y sin ponderar sobre un mapa nitidado y ponderado para visualizar la densidad del ligando, ya que el refinamiento y la ponderación podrían dar lugar a regiones poco o más nitidadas (ruido debido a la terminación de la serie) en el mapa. Esto puede resultar en una densidad de ligando subóptima, y el uso de diferentes agudizaciones de factor B se puede emplear para evaluar la densidad durante la construcción del modelo en Coot. Aunque existe un riesgo al usar el mapa afilado para identificar ligandos en un mapa crioEM, es posible que el mapa no afilado no muestre todos los detalles de la densidad del ligando, pero se puede usar con fines de demostración, como se muestra en la Figura 1B, C.

La posición del ligando modelado debe validarse, especialmente en los casos en que los datos son débiles. Como se muestra aquí para mGlu₅, la resolución local varía a lo largo del mapa crioEM, y el modelado imparcial del ligando puede ser un desafío. Servalcat puede utilizarse como una herramienta valiosa para detectar posibles imprecisiones en el modelado de proteínas y ligandos²².

La heterogeneidad composicional puede estar presente en un complejo proteína-ligando donde solo una población específica puede tener el ligando presente (si el ligando es de bajo peso molecular, entonces el paso de clasificación podría no eliminar la heterogeneidad). Sin embargo, es importante realizar la clasificación^{3D en 63} pasos de forma iterativa durante el procesamiento de imágenes antes del modelado del ligando y verificar si la densidad del ligando mejora. Si hay varias copias de la proteína, se debe tener cuidado al aplicar la simetría a través del mapa durante la generación y el refinamiento iniciales del modelo, ya que esto puede promediar la densidad del ligando en todas las moléculas relacionadas con la simetría. La simetría solo debe imponerse después de que el mapa haya sido inspeccionado minuciosamente para confirmar la presencia de densidad de ligandos en todas las cadenas de proteínas.

Dependiendo del estado (cristal o solución) y de la ubicación (enterrada o superficial), los átomos pueden ser dinámicos, y en el refinamiento del modelo, esto se conoce como parámetro de desplazamiento atómico (ADP). Junto con el mapa de diferencias, que proporciona pistas visuales sobre posibles imprecisiones en el modelo, los valores de ADP se pueden utilizar para evaluar la precisión de los ligandos después del refinamiento 64,65,66,67. Por lo general, el ligando debe tener valores de ADP similares a los residuos circundantes, es decir, si están unidos de manera estable y modelados con precisión. Sin embargo, los ligandos en la periferia o los átomos de un ligando (como los lípidos) que están lejos de las macromoléculas pueden tener valores de ADP más altos. Además de refinar las coordenadas, tanto Refmac^33,34 como Phenix permiten refinar los valores de ADP^28,68. En Refmac, la aproximación de Mott-Bethe se utiliza para calcular el factor de dispersión de electrones de átomos individuales durante el cálculo del mapa. En la versión reciente de Phenix, se ha introducido el refinamiento individual del factor B, similar a la cristalografía, para explicar el desorden del átomo. Muy a menudo, en los modelos refinados derivados de la crioEM, se observa una amplia gama de valores de ADP (a veces valores cercanos a cero), e incluso la puntuación Q que se utiliza en EMDB para evaluar el ajuste del modelo con el mapa depende del mapa primario depositado y de la naturaleza de la nitidez del factor B⁶⁰. En la construcción de modelos crioEM, a menudo se utilizan múltiples mapas y, por lo tanto, los mapas utilizados en el modelado y el refinamiento deben mencionarse claramente en los métodos, ya que debido a la resolución anisotrópica en muchas macromoléculas, un solo mapa puede no ser suficiente para explicar todos los detalles. 

En el modelado de ligandos en macromoléculas, una de las principales limitaciones de los mapas crioEM (como en la cristalografía) es que si el sitio de unión del ligando es de baja resolución o si el ligando unido es dinámico, entonces determinar la conformación correcta puede resultar difícil. Además, la mayoría de las estructuras crioEM tienen resoluciones inferiores a 3 Å, y la representación de las moléculas de agua en los mapas es limitada, lo que dificulta la evaluación del papel de la hidratación en la unión de ligandos o fármacos (como se muestra aquí con los ejemplos de enolasa y mGluR). Los métodos computacionales pueden utilizarse en combinación con datos crioEM para abordar estas limitaciones⁶⁹. A diferencia de la cristalografía, solo el modelo se somete a refinamiento, no el mapa. En la actualidad, el único método para indicar la presencia de un ligando o garantizar un modelado preciso es mediante la generación de mapas de omisión (utilizando herramientas como Servalcat). Por lo tanto, hay una serie de herramientas para ayudar a los investigadores a construir y evaluar el modelo, pero hay varias áreas en el refinamiento del modelo donde se pueden esperar nuevos enfoques o modificaciones de los enfoques actuales en un futuro próximo.

En este artículo, nos hemos centrado en los enfoques actuales para modelar ligandos, que incluyen la inspección manual de la densidad del ligando, la generación del archivo de geometría del ligando, seguido del modelado del ligando en el mapa crioEM. Este es un período emocionante en la biología estructural y el descubrimiento de fármacos, ya que los detectores directos de electrones con velocidades de fotogramas más rápidas y el uso de una adquisición de datos más rápida⁷⁰ han dado como resultado la obtención de mapas de alta resolución (<2,8 Å) de varias macromoléculas a menudo unidas con ligandos de moléculas pequeñas en un tiempo relativamente corto. La reciente introducción de herramientas automatizadas de modelado de ligandos como GEMspot⁶⁹ en la suite Schrödinger y EMERALD¹⁷ en la suite Rosetta, que intenta encontrar la posición de unión más probable del ligando teniendo en cuenta los datos experimentales de crioEM, promete agilizar y automatizar este proceso. De manera similar a la cristalografía de rayos X, se prevé que la identificación de los modos de unión de ligandos de moléculas pequeñas mediante crioEM, tal vez dos o más en un solo día, se convertirá en una posibilidad realista.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consorcio de varios institutos	https://www.ccp4.ac.uk	Gratis para usuarios académicos e incluye Coot y lista de herramientas desarrolladas para la cristalografía de rayos X
Consorcio CCP-EM	de varios institutos	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Gratis para usuarios académicos e incluye Coot, Relion y muchos otros
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	Software general para la construcción de modelos, pero también disponible con otras suites descritas anteriormente
DockinMap (Phenix)	Consorcio de varios institutos	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software dentro de la suite Phenix para acoplar modelos en mapas crioEM
Banco de datos de microscopía electrónica	Consorcio de varios institutos	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Repositorio público de mapas de microscopía electrónica
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, cámara de Thermo Fisher
Fénix	Consorcio de varios institutos	https://phenix-online.org/download	gratuito para usuarios académicos e incluye
el Banco de Datos de Proteínas	Consorcio de varios institutos	https://rcsb.org	Base de datos pública de estructuras macromoleculares
Pymol	Schrödinger	https://pymol.org/2/	Herramienta de viusalización molecular. La versión educativa es gratuita, pero tiene limitaciones. La versión completa se puede obtener por una pequeña tarifa.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software para el procesamiento de imágenes crioEM, también disponible con CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Comercial, cryoTEM de Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, EE. UU.	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	Software de propósito general para visualización, análisis y más
UCSF Chimera X	UCSF, EE. UU		. https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Software de propósito general para visualización, análisis y más