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Artículo de método

Medición del aprendizaje asociativo en la quimiotaxis del nematodo Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/66311

⸱

17 de junio de 2025

 ,  , 
1Institute for Mind Brain and Behavior, Faculty of Medicine, HMU Health and Medical University Potsdam

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para probar el aprendizaje asociativo mediante la realización de condicionamientos clásicos en el organismo modelo C. elegans. El paradigma se basa en emparejar la concentración de sal en el ambiente con la presencia o ausencia de alimentos, lo que altera su quimiotaxis hacia o lejos de la sal.

Resumen

Para adaptar su comportamiento, los animales asignan valencia a la información sensorial a través del aprendizaje asociativo, y actualizan esta asociación cuando cambian las condiciones ambientales. Las respuestas conductuales de Caenorhabditis elegans al cloruro de sodio ofrecen un paradigma bien definido para investigar los mecanismos que gobiernan el aprendizaje asociativo. La exposición de los gusanos a niveles específicos de NaCl, junto con la presencia o ausencia de alimentos, provoca quimiotaxis hacia o desde esta concentración de NaCl, respectivamente. La memoria asociativa se forma en unas pocas horas y puede modificarse en el mismo período de tiempo al exponer a los animales a una concentración de NaCl diferente.

Aquí, describimos cómo ensayar la plasticidad conductual y el aprendizaje basado en la quimiotaxis de sal de C. elegans . Las cepas de ensayo se cultivan en cohortes sincronizadas hasta que alcanzan la edad adulta y luego se acondicionan durante varias horas en placas con diferentes concentraciones de NaCl, ya sea en presencia o ausencia de alimentos. Luego, los animales se transfieren a placas de ensayo que contienen regiones de concentraciones bajas, medias o altas de NaCl y se les permite arrastrarse durante 30 minutos antes de contar el número de gusanos en cada región. A continuación, se calcula un índice de quimiotaxis a partir de la distribución de los gusanos en la placa. El ensayo se puede utilizar para probar el efecto de una serie de factores que afectan al aprendizaje.

Introducción

Para interactuar significativamente con su entorno y generar un comportamiento adaptativo, los animales necesitan interpretar la información sensorial que reciben: si una señal sensorial determinada es beneficiosa o perjudicial para su supervivencia casi siempre no está predeterminado, sino que depende del contexto. Una tarea clave de los sistemas sensorial y nervioso es, por lo tanto, asignar valencia a la información ambiental a través del aprendizaje asociativo. Algunos estímulos son inherentemente apetitivos, como la comida, y otros son inherentemente aversivos, como las señales nociceptivas. Dichos estímulos incondicionales (EE) pueden alterar las respuestas a otros estímulos que se presentan junto con ellos; como resultado, los animales pueden desarrollar una atracción o aversión hacia el otro, el estímulo condicionado (CS). Esto se interpreta de tal manera que CS señala o predice los EE. UU. 1,2,3. El estudio de los modelos de aprendizaje asociativo es necesario para dilucidar los mecanismos genéticos, celulares y fisiológicos subyacentes. Sin embargo, esto puede ser un desafío debido a la necesidad de utilizar modelos in vivo, la variabilidad del comportamiento, la licencia requerida para el manejo de animales o los plazos a menudo largos de capacitación tanto del investigador como de los animales, y esto generalmente impide que los estudiantes de pregrado lo lleven a cabo en un entorno de investigación, y aún más en un entorno de enseñanza.

Por lo tanto, los modelos de invertebrados ofrecen la oportunidad de realizar ensayos de aprendizaje asociativo con estudiantes de pregrado o maestría. Los invertebrados no requieren licencia animal para manipularlos y pueden ser rentables. Un paradigma frecuentemente utilizado para el aprendizaje asociativo es el aprendizaje de la quimiotaxis salina en C. elegans 4,5,6,7,8,9. C. elegans detecta la concentración de cloruro de sodio (NaCl) en su entorno y aprende a asociar un [NaCl] particular con la presencia o ausencia de alimentos, respectivamente. Generalmente, los animales aprenden a migrar hacia concentraciones de sal que previamente se presentaban con abundante alimento bacteriano y aprenden a migrar lejos de las que se presentaban en ausencia de alimento bacteriano. La sal es, pues, el estímulo condicionado, y la comida o el hambre es el estímulo incondicional3. Esta asociación se forma en menos de una hora y es un ejemplo de memoria asociativa a corto plazo. El aprendizaje asociativo de la quimiotaxis NaCl está modulado, entre otros, por la señalización de la quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CaMK), la señalización dopaminérgica y la insulina/fosfatidilinositol (PI) 3-quinasa 5,9,10, lo que sugiere que involucra sistemas motivacionales y plasticidad sináptica dependiente de CaMK y puede operar de manera similar a las vías de señalización que gobiernan el aprendizaje asociativo en vertebrados.

En un protocolo establecido para el aprendizaje de la quimiotaxis de la sal, los animales migran en un gradiente espacial de sal en una placa de agar creada mediante la colocación de dos tapones de agar con sal alta o nula, respectivamente, en la placa7. Estos ensayos son difíciles de realizar de forma cuantitativa por los estudiantes de pregrado debido al cambio dinámico en la concentración de NaCl en la placa de ensayo de quimiotaxis a lo largo del tiempo y el espacio, ya que el NaCl de los tapones se difunde continuamente en la placa de agar. Un ensayo más fácil de realizar es el uso de placas cuadrantes, donde se presentan dos concentraciones de sal diferentes (por ejemplo, 25 mM de NaCl y 0 mM de NaCl) y se separan por barreras de plástico11. Sin embargo, debido a la presentación de solo dos concentraciones diferentes de NaCl, no se puede utilizar simultáneamente para evaluar la atracción y/o la evitación de NaCl disminuido o aumentado en relación con la condición basal. C. elegans generalmente se cultiva en placas NGM (Nematodos Growth Media) en presencia de 50 mM de NaCl y bacterias E. coli OP5012, y por lo tanto, forma una asociación positiva de esta concentración de NaCl con los alimentos por defecto.

Aquí, presentamos un protocolo de aprendizaje de quimiotaxis salina adaptado que puede ser realizado tanto por investigadores como por estudiantes universitarios. Los animales son condicionados primero a diferentes ambientes de NaCl presentados en presencia o ausencia de alimento. A continuación, se transfieren a placas de ensayo con una selección de concentraciones de sal bajas, medias y altas en placas de agar con cámara Y. Su aprendizaje de la quimiotaxis en este entorno puede utilizarse para investigar el efecto de diversos factores que la modulan, como el genotipo, los contextos ambientales o la edad de los animales.

Este protocolo se adapta a una clase de laboratorio práctico de pregrado dividida en ocho grupos de estudiantes, con cada grupo de estudiantes realizando un conjunto de seis mediciones en cada punto de tiempo experimental (una medición por condición experimental). Sin embargo, el protocolo se puede ajustar para que funcione para un solo experimentador o para cualquier número de grupos/personas, con los cambios apropiados en las cantidades de reactivos.

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Protocolo

1. Preparación de placas de crecimiento (GP) para sincronizar C. elegans antes de la prueba de aprendizaje asociativo, y placas de acondicionamiento (CP) para inducir la asociación [NaCl]-alimento el día de la prueba

NOTA: Las placas de Petri para el crecimiento y el acondicionamiento son idénticas a las placas estándar de los medios de crecimiento de nematodos (NGM)12, excepto que la concentración de NaCl varió en las placas de 0 mM de NaCl CP y 100 mM de NaCl CP.

  1. Prepare cuatro botellas de vidrio limpias de 500 ml y agregue lo siguiente:
    1. Agregue 1,25 g de peptona, 8,5 g de agar, 487,5 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella (para 0 mM de NaCl CP);
    2. Añadir 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona, 8,5 g de agar, 487,5 mL de agua destilada y un agitador magnético a cada una de las dos botellas (para 50 mM de NaCl CP y GP, respectivamente);
    3. Agregue 3 g de NaCl, 1,25 g de peptona, 8,5 g de agar, 487,5 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella (para 100 mM de NaCl CP).
  2. Esterilizar las cuatro botellas en autoclave durante 15 minutos a 121 °C, luego dejar que las botellas se enfríen durante 30 minutos a 55 °C en un baño de agua.
  3. Coloque las botellas (una a la vez) en un agitador magnético calentado. Añadir a cada frasco 12,5 mL de 1 M KPO4 (pH = 6,0 a temperatura ambiente [RT]). Mezcle bien durante 2 minutos, luego agregue 0,5 mL de 1 M de CaCl2, 0,5 mL de 5 mg/mL de colesterol en etanol y 0,5 mL de 1 M MgSO4 (todas las soluciones deben ser estériles). Mezclar mediante agitación magnética.
    NOTA: Mezclar bien después de agregar KPO4 evita la precipitación de fosfato de calcio tras la adición de CaCl2.
  4. Para cada tipo de placa (0 mM CP, 50 mM CP, 100 mM CP, GP), alícuota 8 mL del medio respectivo por cada placa de Petri de 55 mm x 10 mm en condiciones casi estériles (en una campana de flujo o junto a un quemador Bunsen).
    NOTA: A partir de este paso se pueden fabricar aproximadamente 62 placas NGM de cada tipo.
  5. Enfríe las placas dejándolas a temperatura media durante aproximadamente 3 horas, luego guárdelas a 4 °C durante un máximo de 2 semanas hasta su uso.
  6. Añadir 200 μL de suspensión de E. coli OP50 a cada NGM GP y dejar secar durante la noche a 20 °C en una incubadora.
    NOTA: Las placas se pueden almacenar en RT hasta por 1 semana antes de ser utilizadas.

2. Mantenimiento de C. elegans y preparación para la prueba de aprendizaje asociativo mediante puesta de huevos cronometrada 13 (3 días antes del ensayo)

NOTA: Una ronda del ensayo de quimiotaxis en el formato sugerido requiere al menos 24 placas para el crecimiento (GP), 48 placas para el ensayo (placas de ensayo, AP) y 8 placas por grupo de acondicionamiento (placas de acondicionamiento, CP). Para una clase dividida en ocho grupos de estudiantes, esto significa que cada grupo de estudiantes recibe 3 GP, 6 CP y 6 AP, es decir, 1 CP y 1 AP para cada condición experimental.

  1. Mantener C. elegans N2 (var. Bristol) en placas de agar NGM alimentadas con E. coli OP50 viva a 20 °C. Guarde las placas boca abajo durante todo el mantenimiento para minimizar la pérdida de humedad de las placas.
  2. Transfiera a 30 jóvenes (día 2) adultos N2 a cada GP.
  3. Deje que los animales pongan huevos durante aproximadamente 8 h a 20 °C.
  4. Retire todos los adultos de las placas y el cultivo boca abajo a 20 °C durante 3 días.

3. Preparación del ensayo (1 día antes del ensayo)

  1. Prepare CP sembrados (+) y no sembrados (-).
    1. Siembre la mitad del lote de cada uno de 0 mM de NaCl CP, 50 mM de NaCl CP y 100 mM de NaCl CP con 200 μL de OP50 por placa (CP0+, CP50+ y CP100+, respectivamente).
      NOTA: La adición de la suspensión OP50 a CP0+ puede resultar en el arrastre de una pequeña cantidad de NaCl (<2 mM de NaCl), lo que es poco probable que afecte sustancialmente el comportamiento de la quimiotaxis. En situaciones en las que son relevantes pequeñas concentraciones de NaCl, esto podría lograrse añadiendo 2 mM de NaCl a las placas CP0- y al sector «sin sal» en las placas de ensayo.
    2. Deje que las placas se sequen durante la noche a 20 °C en una incubadora junto con la mitad sin semillas de la PC (CP0-, CP50- y CP100-, respectivamente)
  2. Prepare las placas de ensayo (AP).
    1. Prepara tres botellas de vidrio limpias de 1 L y añade lo siguiente:
      1. Agregue 2,5 g de peptona, 17 g de agar, 975 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella (para 0 mM de NaCl)
      2. Agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de agar, 975 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella (para 50 mM de NaCl)
      3. Agregue 6 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de agar, 975 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella (para 100 mM de NaCl)
    2. Esterilizar las tres botellas en autoclave durante 15 minutos a 121 °C y, a continuación, dejar que las botellas se enfríen durante 30 minutos a 55 °C en un baño de agua.
    3. Mientras tanto, etiquete la parte inferior de cada sección de la placa de Petri en Y (una placa de Petri de 90 mm x 10 mm dividida en tres compartimentos por una pared interna) con la concentración de NaCl correspondiente del medio que se va a verter en ella. Dibuje un círculo con un radio de 5 mm alrededor del centro de la placa, donde se unen las tres paredes (Figura 1).
      NOTA: El área dentro del círculo, junto con las propias paredes, representará el área de exclusión para fines de conteo: los gusanos encontrados dentro de estas áreas durante el conteo no contarán para el total de ningún sector.
    4. Coloque las botellas (una a la vez) en un agitador magnético calentado. Añadir a cada frasco 25 mL de 1 M KPO4 (pH = 6,0 en RT). Mezcle bien durante 2 minutos, luego agregue 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de 5 mg/mL de colesterol en etanol y 1 mL de 1 M MgSO4 (todas las soluciones deben ser estériles). Mezclar mediante agitación magnética.
    5. Alícuota el medio de 0 mM en un compartimento de una placa de Petri en Y de 90 mm x 10 mm hasta que el medio llegue a la parte superior de la pared interna, luego deje que se solidifiquen aproximadamente 5 minutos.
    6. Aliquot el medio de 100 mM en el segundo compartimento de la placa de Petri Y hasta que el medio toque la sección de NaCl solidificada de 0 mM adyacente a él. Para evitar el desbordamiento en la sección vacía adyacente, llene la sección de 100 mM hasta el borde de la pared Y interna, luego use una punta de pipeta estéril de 10 μL para romper la tensión superficial del medio a lo largo de la pared Y y conéctelo a la sección de NaCl de 0 mM. Luego, deje que se solidifiquen aproximadamente 5 minutos.
    7. Alícuota el medio de 50 mM en el compartimento vacío restante de la placa de Petri en Y hasta que el medio toque las secciones adyacentes solidificadas de 0 mM de NaCl y 100 mM de NaCl. Tenga cuidado de que el medio no se derrame en las secciones adyacentes. Luego, deje que se solidifiquen aproximadamente 5 minutos.
    8. Guarde las placas durante la noche a 20 °C en una incubadora.
      NOTA: Se pueden hacer aproximadamente 50 AP con este método.
  3. Prepare 1 L de tampón M9 estéril14.

4. Ensayo de aprendizaje asociativo de C. elegans (aquí realizado por 8 grupos en paralelo)

  1. Pipetear 1 mL de tampón M9 estéril en un GP y agitar suavemente la placa para desalojar los gusanos (en su mayoría adultos de 1 día) del OP50 y del agar, formando una suspensión.
  2. Incline la placa, recoja la suspensión de tornillo sin fin en un tampón M9 con una punta de pipeta de plástico de 1 mL y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: La parte superior de la punta de la pipeta se puede recortar con unas tijeras para aumentar el diámetro de la abertura; esto reduce el esfuerzo cortante y el daño físico a medida que los gusanos pasan a través de la punta y puede ser especialmente útil cuando se trabaja con puntas de pipeta de 200 μL. Antes de comenzar los experimentos, es importante asegurarse de que los gusanos no se peguen al tipo de tubo utilizado; Esto se puede hacer observando el tubo bajo un microscopio de disección después de quitar la suspensión de gusano.
  3. Repita el proceso para todos los GP, luego deje que los gusanos se asienten en el fondo de los tubos de microcentrífuga durante aproximadamente 60 s, formando un pellet.
  4. Retire el sobrenadante/exceso de tampón M9 con una pipeta de 1 mL, teniendo cuidado de no alterar el pellet.
  5. Lave el pellet con 1 mL de tampón M9 estéril dos veces más para eliminar cualquier residuo de OP50. Deje que el pellet se asiente durante aproximadamente 60 s entre lavados. Vuelva a suspender el pellet después de lavarlo a 300 μL con M9 Buffer.
  6. Transfiera lentamente 50 μL de la suspensión de tornillo sin fin (aproximadamente 200-300 animales) a cada placa de acondicionamiento (CP0-, CP0+, CP50-, CP50+, CP100- y CP100+). Gire la suspensión cada vez antes de aliquotar para mantener los gusanos suspendidos uniformemente. Para los platos sembrados con OP50, coloque la gota de lombriz lejos del césped de alimentos bacterianos. Deje que la suspensión se absorba en el agar.
  7. Almacene las placas boca abajo a 20 °C en una incubadora durante aproximadamente 4 h, permitiendo que las lombrices deambulen.
    NOTA: El paso de acondicionamiento se puede acortar a 2 horas para adaptarse a los horarios de los cursos de pregrado.
  8. Pipetear 1 mL de tampón M9 estéril en un CP y agitar suavemente la placa para desalojar los gusanos, formando una suspensión.
  9. Incline la placa, recoja la suspensión de tornillo sin fin M9 con una punta de pipeta de plástico de 1 mL y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  10. Deje que los gusanos se depositen en el fondo del tubo de microcentrífuga durante aproximadamente 60 s.
  11. Retire el sobrenadante/exceso de tampón M9 con una pipeta de 1 ml sin alterar el pellet de gusano.
  12. Lave las lombrices dos veces más con 1 ml de tampón M9 estéril. Deje que el pellet se asiente durante aproximadamente 60 s entre lavados.
  13. Llene el tubo de microcentrífuga con tampón M9 hasta la marca de 1 mL y deje que el pellet de tornillo sin fin se asiente durante aproximadamente 60 s.
  14. Retire 960 μL del sobrenadante con una pipeta de 1 mL, teniendo cuidado de no alterar el pellet.
  15. Gire o agite suavemente el tubo de microcentrífuga para volver a suspender los gusanos, luego use una pipeta de 20 μL para transferir 20 μL del gránulo de gusano (que contiene aproximadamente 100-150 animales) al centro de un AP, donde se unen todos los segmentos de la pared Y. Repita este paso para los otros AP.
  16. Deje que los gusanos deambulen durante 30 minutos a 20 °C, luego cuente el número de gusanos presentes en cada una de las secciones del AP (0 mM de NaCl, 50 mM de NaCl y 100 mM de NaCl, respectivamente) bajo un microscopio estereoscópico. Excluya cualquier gusano presente a menos de 5 mm del centro de la placa en cualquier sección o en el borde entre secciones (Figura 1).
  17. Deje que los gusanos deambulen durante otros 30 minutos a 20 °C, luego cuente nuevamente el número de gusanos en cada sección del AP. Excluya cualquier gusano presente a menos de 5 mm del centro de la placa en cualquier sección.
  18. Calcule el índice de quimiotaxis (IC) por placa por punto de tiempo utilizando la fórmula15,16:
    figure-protocol-1

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Resultados

El acondicionamiento durante 4 h en placas con varias cantidades de NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM), con o sin alimento, afectó significativamente el comportamiento de C. elegans de tipo silvestre (N2). Después de 30 min en la placa de ensayo, los gusanos acondicionados en placas con altas concentraciones de NaCl y alimento (CP100+) y los gusanos acondicionados en placas sin NaCl y sin alimento (CP0-) tuvieron un IC positivo, lo que indica una preferencia por concentraciones de NaCl ...

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Discusión

En este artículo describimos la evaluación del aprendizaje asociativo en el nematodo C. elegans utilizando la quimiotaxis como paradigma experimental. En nuestro ejemplo, utilizamos seis condiciones experimentales. Específicamente, C. elegans N2 de tipo silvestre se acondicionaron en placas con concentraciones de NaCl bajas (0 mM), medias (50 mM) o altas (100 mM) que se sembraron con el alimento estándar de nematodos (cepa bacteriana de E. coli OP50) o se dejar...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Dedicamos este artículo a la memoria de Johannes Berthold. Algunas cepas fueron proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC), financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). E.I.B. agradece el apoyo financiero de la Studienstiftung des deutschen Volkes.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarChemsolute9972-2KG
Bacto-peptonaGibco211677
CaCl2 solución 1MMerck2389
Caenorhabditis elegans cepasCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
ColesterolRoth8866.1
E. coli OP50 cultivo líquidoN/AN/A
EtanolChemsolute22731000
KH2PO4RothP018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) solución 1 MChemsolute16341000
MgSO4 solución 1 MRothT888.2
Microcentrífugas tubos 1.5 mLEppendorfN/A
Na2HPO4RothT877.1
NaClChemsolute13671000
Platos Y-Petri 90 x 10 mmMoonlab4-0033

Referencias

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