Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) se definen por su capacidad de producir todos los tipos de células sanguíneas a lo largo de su vida. Esto se prueba operativamente mediante el trasplante de poblaciones celulares que contienen HSC en ratones singénicos o inmunocomprometidos. A continuación, se mide el tamaño y la composición multilinaje del injerto a lo largo del tiempo, normalmente mediante citometría de flujo. Clásicamente, una población que contiene HSC se inyecta en la circulación del animal, después de lo cual las HSC se dirigen a la médula ósea, donde se alojan y comienzan a producir sangre. Alternativamente, las HSC y/o las células progenitoras (HSPC) pueden colocarse directamente en la cavidad de la médula ósea.
En este artículo se describe un protocolo para la inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes. En resumen, se anestesia a los ratones preacondicionados y se perfora un pequeño orificio a través de la rodilla hasta el fémur con una aguja. Usando una aguja de insulina más pequeña, las células se inyectan directamente en el mismo conducto creado por la primera aguja. Este método de trasplante se puede aplicar en diversos diseños experimentales, utilizando células de ratón o humanas como células donantes. Ha sido el más utilizado para el xenotrasplante, porque en este contexto, se cree que proporciona un mejor injerto sobre las inyecciones intravenosas, mejorando así el poder estadístico y reduciendo el número de ratones a utilizar.
Introducción
La sangre tiene una de las tasas de regeneración más altas del cuerpo humano, produciendo 1 × 1012 células por día enla médula ósea humana adulta. Las células madre hematopoyéticas (HSC) garantizan la producción de sangre a lo largo de la vida mediante el proceso de hematopoyesis y se definen por su capacidad para producir todos los tipos de células sanguíneas (multipotencialidad) mientras se mantienen (autorrenovación). Históricamente, el estándar de oro para probar la función de un HSC siempre se ha basado en el trasplante, probando la capacidad de una población de donantes para reconstituir todos ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Toda la investigación con animales presentada aquí se adhiere a las Regulaciones de Enmienda de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 de 2012 y se realizó después de la revisión ética y la aprobación del Organismo de Revisión Ética y Bienestar Animal de la Universidad de Cambridge (AWERB). CABECEO femenino. Se utilizaron para las inyecciones intrafemorales ratones Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG), de entre 12 y 16 semanas (~21-30 g), criados internamente y mantenidos en un centro de animales libres de patógenos específicos. Se recogieron muestras de CB no identificadas de donantes sanos tras e....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El injerto de las células inyectadas intrafemoralmente puede evaluarse en cualquier momento a partir de las 24 h en función del diseño experimental. En el punto de tiempo final, se pueden recolectar IF, BM, PB y bazos. Estos se pueden procesar y evaluar el nivel de injerto mediante citometría de flujo. Para denominar de forma robusta al injerto humano incluso a niveles bajos, teñimos con dos anticuerpos distintos contra CD45 humano (clon HI30 y clon 2D1). Solo las células positivas para ambos anticuerpos (CD45++
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Las inyecciones intrafemorales son una herramienta útil en el xenotrasplante cuando solo se dispone de un pequeño número de HSPC, lo que proporciona un mejor injerto en comparación con las inyecciones intravenosas. Sin embargo, la técnica requiere destreza y entrenamiento. Al practicar, recomendaríamos usar cadáveres frescos del rango de peso correcto (ver más abajo) e inyectar un tinte de color (como el azul tripán) para que en la disección, quede claro si la inyección entró en el fémur.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen al grupo del Dr. John Dick por su trabajo previo en este método, y a Monica Doedens por su formación. Agradecemos al Biobanco de Sangre y Células Madre de Cambridge (CBSB), específicamente a la Dra. Joanna Baxter y al equipo de enfermeras del CBSB que dieron su consentimiento y recolectaron muestras de sangre del cordón umbilical; nuestros donantes de muestra; al Servicio Biomédico de la Universidad, específicamente a Nicolas Lumley y al personal del Edificio Anne McLaren para el mantenimiento de nuestras cepas de ratones y el apoyo a nuestros experimentos in vivo ; Shaaezmeen Basheer por la edición del ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de insulina de 0,5 mL con aguja BD de 29 G x 12,7 mm | 324892 | ||
| Jeringa de insulina de 1 mL con aguja de 29 g x 0,5" | BD | 324827 | |
| tubo de 1,5 mL | Jeringa | 509-GRD-PFB | |
| HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | ||
| 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón de filtro de celdas 12 x 75 mm | Tubo Falcon | 352235 | FACS |
| 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con tapón a presión 12 x 75 mm | Falcon | 352058 | tubo FACS |
| 27 G Aguja de 1/2" | BD | ||
| 40 y micro; Filtro de células m para tubo de 50 mL | Greiner Bio-one | 542040 | |
| tubo de 50 mL | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
| placa de fondo redondo de 96 pocillos | de alcohol 351177 | Falcon | |
| VITREX MEDICAL A/S | |||
| BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer | Citómetro de | flujo | |
| Buphrenorphine | Animalcare | XVD190 | |
| CD14/PECy7 (Clon M5E2) | biolegend | 301814 | Usado a 1 en 1000 |
| CD19/Alexa 700 (Clon HIB19) | biolegend | 302226 | Usado a 1 en 300 |
| CD19/FITC (Clon HIB19) | biolegend | 302206 | Usado en 1 en 200 |
| CD3/APCCy7 ( clon HIT3a) | biolegend | 300318 | utilizado a 1 de cada 100 |
| CD33/APC (clon P67.6) | BD | 345800 | utilizado a 1 de cada 200 |
| CD45/BV510 (clon HI30) | biolegend | 304036 | utilizado a 1 de cada 500 |
| CD45/PECy5 (clon 2D1) | biolegend | 368526 | utilizado a 1 de cada 300 |
| compBeads Anti-Mouse Ig, κ/Conjunto de partículas de compensación de control negativo | BD | ||
| Dnase 1 | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| Glicoforina A (GlyA)/PE (clon GA-R2) | BD | 340947 | utilizado a 1 de cada 1000 |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | PAN-Biotech | P04-20250 | |
| Isoflurano (IsoFlo 100% w/w Vapor de inhalación, líquido) | Zoetis | 115095 | |
| Microvette 300 Heparina de litio LH, 300 y micro; L | Sarstedt Ltd | 20.1309 | Tubo de extracción de sangre de ratón |
| NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones | Río Charles | ||
| Pancoll humano, Densidad: 1.077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 14190169 |
Referencias
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Laurenti, E., Göttgens, B.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
