Artículo de método

Un flujo de trabajo para la evaluación cuantitativa de los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos de la corteza de Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

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27 de junio de 2025

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1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta un flujo de trabajo fiable y eficiente desde la recogida de muestras hasta el análisis de datos para perfilar los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos presentes en la corteza de Populus trichocarpa.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los microorganismos que colonizan las superficies y los tejidos internos de las plantas pueden poseer funciones beneficiosas para promover el crecimiento y la salud de las plantas. Sin embargo, la información sobre el microbioma de los tejidos de la corteza de las plantas leñosas sigue siendo limitada, especialmente en lo que respecta a la microbiota bacteriana endófita y epífita de la corteza de Populus. Para superar esta limitación, establecimos un flujo de trabajo para cuantificar la composición y la diversidad de la microbiota bacteriana endófita y epífita que coloniza la corteza de Populus trichocarpa. Brevemente, la epidermis del tallo de P. trichocarpa se limpió repetidamente con una bola de algodón humedecida en Tween 20 al 0,1% para adquirir muestras de bacterias epífitas. La epidermis extraída se esterilizó y luego se congeló y trituró repetidamente con nitrógeno líquido y un batidor de cuentas, respectivamente, para recolectar muestras de bacterias endófitas. El ADN genómico se extrajo de las comunidades bacterianas epífitas adheridas al algodón y de la corteza triturada de P. trichocarpa, y se sometió a una amplificación de reacción en cadena de la ploimerasa (PCR) con cebadores dirigidos a las regiones hipervariables V5-V7 y V4 del gen bacteriano 16S rRNA. Se mezclaron tres réplicas de los productos de PCR obtenidos de cada muestra endófita o epífita en concentraciones iguales para construir la biblioteca de amplicones, que luego se secuenció. Las secuencias obtenidas se analizaron mediante empalme de secuencias, filtrado de calidad, eliminación de quimeras y anotaciones taxonómicas. En resumen, establecimos un flujo de trabajo confiable y eficiente desde la recolección de muestras hasta el análisis de datos para determinar los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos de la corteza de P. trichocarpa a través del perfil del gen ARNr 16S. Junto con los métodos de exploración de la microbiota colonizadora de las cortezas establecidos en el estudio anterior, nuestra metodología puede servir de modelo para diseñar protocolos de investigación del microbioma de la corteza de otras especies de plantas leñosas, en particular los árboles de los bosques de importancia económica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La corteza es la capa más externa de los tallos de las plantas leñosas, refiriéndose a todos los tejidos fuera del cámbium vascular, incluyendo el floema y la peridermis 1,2. Numerosas investigaciones han demostrado que la corteza desempeña un papel fundamental en la translocación de agua y carbohidratos, la protección de los árboles contra el fuego y los daños mecánicos3, y la adaptación al estrés abiótico4y biótico5. Más importante aún, como interfaz entre un árbol y el aire circundante, la corteza también sirve como un hábitat únicopara los microorganismos. En particular, se ha confirmado que los microbios asociados a la corteza poseen las funciones de promover el crecimiento del huésped7, ayudar a los árboles en la adquisición de nutrientes8, mejorar la síntesis de hormonas de las plantas9 y proteger a los huéspedes de la infección por fitopatógenos5. Sin embargo, se ha prestado mucha menos atención a las comunidades microbianas que colonizan la corteza en comparación con la filosfera y la microbiota rizoférica10,11. Existe un conocimiento limitado sobre las características biológicas del microbioma de la corteza de los árboles. El objetivo del presente artículo metodológico es proporcionar a los investigadores un conjunto de protocolos para describir la diversidad y composición del microbioma bacteriano endófito y epífito de la corteza de las plantas leñosas.

Sobre la base de los métodos publicados para investigar la microbiota de la corteza12,13 en este trabajo, diseñamos y probamos un elaborado flujo de trabajo basado en el análisis de secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA para explorar el microbioma bacteriano que se asienta en los tejidos internos o las superficies de la corteza del tallo de Populus trichocarpa, un importante organismo modelo utilizado en la biología de plantas leñosas14. P. trichocarpa tiene las características de crecimiento rápido15, relativa facilidad de manipulación experimental16 y fácil transformación genética, y también, conocido por su amplia aplicación en la producción de madera17. En concreto, el método propuesto en este trabajo comienza con una descripción detallada del muestreo de la microbiota endófita y epífita de la corteza del tallo de P. trichocarpa. Con la inclusión de un paso para la esterilización superficial de la corteza con alcohol e hipoclorito de sodio después de cosechar el microbioma que coloniza la superficie, este estudio estableció un procedimiento para recolectar simultánea y separadamente los microorganismos que residen en la estructura interna de la corteza (endófitos) y los que viven en la superficie externa de la corteza (epífitas). Hasta donde sabemos, entre los estudios publicados sobre el microbioma de la corteza de las plantas leñosas, no se han realizado ensayos sobre las comunidades microbianas endófitas y epífitas recolectadas de la misma muestra de corteza sobre la base de una clara distinción entre los nichos interiores y exteriores de la corteza 18,19,20. Por lo tanto, el método desarrollado en esta investigación permitirá a los investigadores examinar la diversidad y la composición de las comunidades bacterianas que habitan en la corteza de una manera precisa y completa. Además, este estudio proporciona descripciones detalladas de los procedimientos para la extracción de ADN genómico, la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la preparación de la biblioteca de secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA21 y el análisis de datos de secuenciación. En particular, este estudio empleó un par de cebadores dirigidos a las regiones hipervariables V5-V7 del gen de ARNr bacteriano 16S para reducir la amplificación inespecífica de las secuencias mitocondriales y de cloroplastos de las plantas huésped22, lo que produjo perfiles no sesgados del microbioma asociado a la corteza. Las α-diversidades se evaluaron utilizando el índice de Shannon23, un índice de diversidad popular ampliamente utilizado en la investigación de la ecología, y la composición taxonómica a nivel de filo se calculó y visualizó en el software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24y R25. Junto con los métodos de exploración de la microbiota colonizadora de cortezas establecidos en el estudio anterior 1,6, nuestra metodología puede servir de modelo para el diseño de protocolos de estudio del microbioma de la corteza de otras especies de plantas leñosas, en particular los árboles forestales de importancia económica.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Recogida de muestras

  1. Cultive P de 3 meses. Árboles jóvenes de trichocarpa en una cámara de crecimiento (21-25°C; ciclo de 16 h de luz/8-h de oscuridad con luz suplementaria de aproximadamente 300 μEm−2 s−1 de una lámpara fluorescente lineal de tres bandas [T5 28 W 6400 K]; y 60-80% de humedad)26.
  2. Corta los segmentos de tallo de 10 cm de largo de P. trichocarpa de 2 a 12 cm por encima de la superficie del suelo esterilizado (Figura 1A) usando una podadora esterilizada. Coloque los segmentos del tallo en una placa de Petri cuadrada esterilizada (13 cm x 13 cm).
    NOTA: Se seleccionaron seis árboles del mismo tamaño para este estudio, de los cuales tres se utilizaron para la amplificación por PCR con cada juego de cebadores.

2. Procesamiento de muestras

  1. Limpie repetidamente la epidermis del tallo en la placa de Petri cuadrada esterilizada con un hisopo de algodón estéril humedecido en 0.1% Tween 20 para recolectar de manera más eficiente los microorganismos que colonizan las superficies de la corteza (Figura 1B).
    NOTA: Los algodones estériles subhúmedos se utilizan para recolectar microorganismos adheridos a la superficie del tallo. No use algodón que esté demasiado seco o demasiado mojado cuando limpie la superficie del tallo. Tween 20 es un tensioactivo capaz de reducir la tensión superficial, una propiedad beneficiosa para la obtención de más muestras microbianas de las superficies de las plantas27,28.
  2. Corte la punta de algodón del hisopo con una cuchilla estéril y coloque cada punta de algodón que contenga muestras microbianas epífitas en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. Almacene las muestras a -80 °C.
  3. Después de limpiar la superficie del tallo, corte la corteza de la que se tomaron muestras de los microorganismos epífitos con un bisturí estéril, pele la corteza y colóquela en una placa de Petri cuadrada.
  4. Cortar la corteza arrancada del tallo en el paso 2.3 en gajos de aproximadamente 1 cm (Figura 1C) con un bisturí estéril.
  5. Esterilice los segmentos sumergiéndolos en alcohol al 70% (v/v) durante 2 min. A continuación, remoje los gajos en hipoclorito de sodio (2,5% de contenido de cloro efectivo) suplementado con 0,1% de Tween 80 durante 5 min.
  6. Esterilizar los segmentos obtenidos en el paso 2.5 durante 30 s en alcohol al 70% (v/v)29. Luego, lave todas las muestras tres veces con agua destilada estéril y colóquelas en un banco limpio para que se sequen al aire.
    NOTA: Las muestras de corteza se agitan de un lado a otro con pinzas estériles para garantizar una esterilización suficiente de la superficie.
  7. Almacene cada segmento de corteza de tallo esterilizado en superficie (muestras endófitas) en un tubo de centrífuga estéril de 2 mL a -80 °C.

3. Extracción de ADN genómico

  1. Realice los siguientes pasos para tratar previamente las muestras para la extracción de ADN.
    1. Coloque los segmentos de corteza de tallo esterilizados en superficie obtenidos en el paso 2.7 en tubos duros estériles de 5 mL y agregue tres perlas de acero esterilizadas (4 mm) en cada tubo.
      NOTA: Realice este paso en un banco limpio para evitar la contaminación microbiana. Las bolas de algodón preparadas en el paso 2.2 (muestras epífitas) no necesitan ser preprocesadas y se utilizan directamente para la extracción de ADN genómico.
    2. Congele los tubos duros que contienen las muestras en nitrógeno líquido durante 10 min.
    3. Triture las muestras de corteza durante 5 minutos con un batidor de cuentas. A continuación, vuelva a congelar el tubo duro en nitrógeno líquido durante 1 minuto y repita el paso de batido de cuentas durante 5 minutos.
  2. Extraer ADN genómico.
    NOTA: Utilice un kit comercial de extracción de ADN para aislar el ADN genómico de las muestras endófitas y epífitas.
    1. Agregue la corteza del tallo triturada de P. Trichocarpa y las comunidades bacterianas epífitas adheridas al algodón (0,25 g cada una) a cada uno de los tubos de perlas. A continuación, añadir 60 μL de solución C1 suministrada por un kit comercial y mezclar suavemente por inversión.
    2. A continuación, homogeneice las muestras endófitas y epífitas utilizando un batidor de perlas en cuatro tiradas de 1 minuto. Después de cada ejecución, coloque las muestras en hielo durante 30 s.
    3. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 1 min.
    4. Extraiga las muestras endófitas y epífitas utilizando un kit (ver Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
    5. Añadir 30 μL de solución C6 en el centro de la membrana filtrante blanca e incubar a 25 °C durante 5 min.
    6. Centrifugar a 10.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min.

4. Amplificación por PCR

  1. Estandarizar la concentración de ADN extraído.
    1. Mida las concentraciones del ADN genómico extraído de muestras epífitas y endófitas utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes.
    2. Diluir cada muestra de ADN con ddHestéril 2O a 2 ng/μL para obtener la plantilla de ADN para la amplificación por PCR.
  2. Amplifica estas muestras de ADN.
    1. Amplifique la región V5-V7 del gen bacteriano 16S rRNA utilizando el cebador directo 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') y el cebador inverso 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. Amplifique la región V4 del gen bacteriano 16S rRNA utilizando el cebador directo 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') y el cebador inverso 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      NOTA: El ADN genómico extraído de cada muestra se utiliza como molde para cada una de las reacciones de amplificación de PCR triplicadas, y una reacción adicional que no contiene ADN se establece como control negativo. Para cada muestra, el volumen de la mezcla de reacción PCR es de 25 μL. Para el par de cebadores 799F/1193R, cada reacción contiene 12 μL de agua PCR, 1 μL de cada uno de los cebadores F/R (10 μM), 1 μL de molde de ADN y 10 μL de solución de mezcla. Para el par de cebadores 515F/806R, cada reacción contiene 12 μL de agua PCR, 1 μL de cada uno de los cebadores F/R (10 μM), 1 μL de molde de ADN y 10 μL de solución de mezcla. Las reacciones de PCR con el par de cebadores 799F/1193R se realizan con las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 98 °C durante 5 min, 25 ciclos de 98 °C durante 30 s, 53 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s, y una extensión final a 72 °C durante 5 min. Las reacciones de PCR con el par de cebadores 515F/806R se llevan a cabo con las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 45 s, 50 °C durante 60 s y 72 °C durante 90 s, y una extensión final durante 10 min a 72 °C.
    2. Mezcle bien cada muestra y centrifugue para eliminar las burbujas.
    3. Realice la amplificación de la región V5-V7 o V4 de los genes de ARNr 16S bacterianos en un termociclador.
  3. Detectar los productos amplificados.
    1. Cargue 5 μL de cada amplicón en un gel de agarosa al 1% y realice la electroforesis a 120 V durante 30 min.
    2. Visualice el gel bajo luz ultravioleta para validar la amplificación exitosa de la PCR. Los tamaños de los productos de PCR obtenidos con los pares de cebadores 799F/1193R y 515F/806R deben ser de aproximadamente 430 pb y 400 pb, respectivamente.

5. Preparación de la biblioteca de secuenciación de amplicones

  1. Mezcle los productos amplificados y determine sus concentraciones.
    1. Mezcle los productos generados a partir de las tres réplicas de la amplificación de PCR para cada muestra en un tubo de PCR.
    2. Agregue 5 μL de los productos de PCR y 195 μL de solución de trabajo en un pocillo de una microplaca de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit (consulte la Tabla de materiales). A continuación, añada 10 μL del ADN patrón (reactivos de ADN con concentraciones de 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 ng/μL del kit) y 190 μL de solución de trabajo en un pocillo de la misma microplaca. Después de este paso, determine la intensidad de fluorescencia de los productos de PCR y el ADN estándar.
    3. Mida la fluorescencia con un lector de microplacas.
      NOTA: La excitación/emisión de las longitudes de onda de fluoresceína estándar se establece en 480/530 nm para medir la cantidad de ADN bicatenario en cada muestra.
    4. Establecer la curva estándar de concentraciones de ADN e intensidades de fluorescencia utilizando las concentraciones estándar de ADN de las soluciones de ADN estándar (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 ng/μL) y la intensidad de fluorescencia de cada una de las soluciones de ADN estándar. Sustituya el valor de intensidad de fluorescencia de cada uno de los productos de PCR en la curva estándar para calcular las concentraciones de ADN de los productos de PCR.
  2. Cree bibliotecas de secuenciación de amplicones.
    1. De acuerdo con las concentraciones detectadas en el paso 5.1.4, mezcle los productos de PCR restantes amplificados por el mismo par de cebadores en concentraciones iguales para construir la biblioteca de secuenciación de amplicones.
      NOTA: La fracción de los productos de PCR de cada muestra utilizada para cuantificar la concentración del ADN bicatenario midiendo la intensidad de fluorescencia no se incluye en la biblioteca de secuenciación de amplicones, que se construye a partir de los productos de PCR restantes de la misma muestra.
  3. Realizar la extracción con gel.
    1. Realizar electroforesis en gel de agarosa utilizando aparatos de electroforesis. Brevemente, prepare un gel de agarosa al 1,3% (es decir, 1,3 g de polvo de agarosa en 100 ml de 1 x tampón TAE).
      NOTA: Se tiene cuidado de garantizar que la cantidad de pocillos en el gel sea suficiente para contener cada producto de PCR y escalera de ADN; en este estudio, el gel de agarosa al 1,3% se prepara disolviendo 1,3 g de polvo de agarosa en 100 mL de 1 x tampón TAE.
    2. Retire los peines después de la solidificación del gel y coloque el gel en un tanque de electroforesis con 1 x tampón TAE. A continuación, agregue 1 unidad de volumen de 6 x tampón de carga naranja a 5 unidades de volumen de cada producto PCR, con 100 μL de este último cargado en cada pocillo. Agregue 30 μL de la escalera de ADN a un pocillo. Después de conectar los cables positivo y negativo, realice la electroforesis a 80 V durante 50 min.
      NOTA: En este estudio, la extracción en gel se emplea para purificar la biblioteca de secuenciación de amplicones representada por la banda de 400 pb o 430 pb amplificada con el par de cebadores 515F/806R o 799F/1193R, respectivamente.
    3. Extraiga los fragmentos de ADN del gel de agarosa con un bisturí limpio y afilado.
    4. Pesa la rodaja de gel y transfiérela a un tubo incoloro. Agregue tampón para sumergir la rodaja de gel.
      NOTA: La cantidad máxima de gel por columna de centrifugado es de 400 mg. Se añaden tres unidades de volumen de tampón a una unidad de volumen de una porción de gel determinada.
    5. Realice la extracción del gel utilizando el kit de extracción de gel (consulte la tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Mediante este método se obtiene la biblioteca de amplicones construida a partir de los productos de la PCR dirigida al gen bacteriano 16S rRNA utilizado para secuenciar las comunidades bacterianas endófitas y epífitas.
  4. Confirme la calidad de la biblioteca de secuenciación de amplicones purificada.
    1. Determine la concentración de ADN bicatenario en la biblioteca de secuenciación de amplicones purificada obtenida en el paso 5.3.5 por un fluorómetro utilizando un kit comercial (ver Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo del fabricante (Figura 2).
    2. Determine el tamaño del fragmento de ADN objetivo de la biblioteca de secuenciación de amplicones obtenida en el paso 5.3.5 utilizando un sistema de análisis de control de calidad de ácidos nucleicos con chips y kits comerciales (véase la tabla de materiales) siguiendo el protocolo del fabricante.
      NOTA: Asegúrese de que el tamaño del fragmento esté dentro del rango esperado y que no haya dímeros de cebadores en la biblioteca de secuenciación de amplicones.
    3. Determine la concentración efectiva de la biblioteca de secuenciación obtenida en el paso 5.3.5 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con un kit comercial (ver Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo del fabricante.
    4. Diluya la biblioteca de secuenciación de amplicones para cumplir con la concentración de carga recomendada para la plataforma de secuenciación.

6. Procesamiento de secuencias y análisis estadístico

  1. Después de secuenciar la biblioteca de amplicones obtenida en el paso 5.4.4 utilizando una plataforma de secuenciación (véase la Tabla de Materiales)31. Cree una carpeta denominada emp-paired-end-sequences en el directorio de trabajo y, a continuación, guarde el archivo de secuenciación comprimido en formato fastq en esta carpeta. A continuación, abra Ubuntu y active el entorno conda y Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Escriba un archivo de asignación y guárdelo como un archivo de texto. El contenido del archivo se muestra en la Tabla 2.
  3. Divida los datos de secuenciación obtenidos con la biblioteca de secuenciación de amplicon y elimine los cebadores de los datos de secuenciación mediante el archivo de asignación.
    1. Utilice el siguiente comando para dividir los datos de secuenciación: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Utilice el siguiente comando para eliminar los cebadores: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F or 515F --p-front-r 1193R or 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Criba y elimina cualquier quimera con la tubería DADA233. Agrupe las secuencias filtradas en variantes de secuencia de amplicones (ASV) con un 99 % de similitud.
    1. Utilice el siguiente comando para filtrar y eliminar quimeras y secuencias de clústeres en ASV: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Realizar anotaciones taxonómicas utilizando la base de datos SILVA (v138) a partir de las secuencias de referencia34.
    1. Utilice el siguiente comando para anotar los ASV obtenidos en el paso 6.4: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Cree una tabla ASV en QIIME2 (v2021.2) mediante los siguientes comandos:
    Exportación de herramientas qiime --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taxonomy --sc-taxonomía separada
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taxonomía
    NOTA: Estos comandos generan una tabla que contiene el número de lecturas de todos los ASV para cada muestra.
  7. Calcule el número de ASV y lecturas de las comunidades bacterianas endófitas y epífitas generadas con los pares de cebadores 799F/1193R y 515F/806R, respectivamente.
    1. Calcule el número total de ASVs que tienen ≥ 1 lecturas a nivel de filo, clase, orden, familia y género, respectivamente, en cada muestra de la tabla ASV obtenida en el paso 6.6 contando.
    2. Calcule el número total de lecturas en cada muestra basándose en la suma del número de lecturas de todos los ASV en la tabla ASV obtenida en el paso 6.6 mediante el recuento.
    3. Calcule el número de lecturas de plantas en cada muestra utilizando el número de lecturas de ASV anotadas como cloroplastos o mitocondrias en la tabla de ASV obtenida en el paso 6.6 mediante el conteo.
    4. Calcule el número de lecturas bacterianas en cada muestra utilizando la siguiente fórmula:
      Número de lecturas bacterianas = Número de lecturas totales − Número de lecturas de plantas.
    5. Calcular y visualizar el número medio de ASVs (a nivel de filo, clase, orden, familia y género, respectivamente) o lecturas (en total o de planta y bacteria, respectivamente) de las comunidades bacterianas endófitas y epífitas generadas por los pares de cebadores 799F/1193R y 515F/806R mediante el uso de software Excel (2019) y Prism (v8.0).
    6. Evaluar la significancia de las diferencias entre el número de ASVs (a nivel de filo, clase, orden, familia y género, respectivamente) o lecturas (en total o de planta y bacteria, respectivamente) generados con los pares de cebadores 799F/1193R y 515F/806R utilizando la prueba t de Student en el software Prism (v8.0).
  8. Filtre las lecturas anotadas como cloroplastos y mitocondrias mediante el siguiente comando: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitocondrias, cloroplastos --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Cree un árbol filogenético utilizando el siguiente comando: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Calcule y visualice las diversidades alfa representadas por el índice de Shannon de las comunidades bacterianas endófitas y epífitas utilizando el QIIME2 (v2021.2) y el paquete 'ggplot2' en R (v4.0.5)35.
    1. Utilice el siguiente comando para calcular las diversidades alfa: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth el valor de lectura más bajo entre todas las muestras --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Calcular las abundancias relativas de las poblaciones a nivel de filo de las comunidades bacterianas endófitas y epífitas. Genere un archivo en formato qzv denominado "taxa-bar-plots" utilizando el siguiente comando de QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Abra el archivo taxa-bar-plots.qzv en línea en https://view.qiime2.org/. Descargue y guarde el archivo recién generado de level2. Calcule la abundancia relativa mediante la siguiente fórmula con R (v4.0.5):
      Abundancia relativa de cada filo bacteriano (%) = (número de lecturas de cada filo bacteriano en cada muestra / número de lecturas totales de cada muestra) x 100 %.
      Visualice los datos mediante los paquetes ggplot2, RColorBrewer, reshape y ggalluvial en R (v4.0.5).
  12. Analizar la significancia de la diferencia entre la abundancia relativa de cada uno de los filos dominantes (definidos como un filo que posee una abundancia relativa de > 0.5%) en las comunidades bacterianas endófitas y epífitas secuenciadas con el par de cebadores 799F/1193R utilizando el análisis de varianza de una vía (ANOVA) con la prueba post-hoc de Tukey a un nivel de significancia de 0.05 en el software STAMP36.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADN genómico de alta calidad de los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos de la corteza de P. trichocarpa se obtuvo utilizando el protocolo optimizado (Tabla 1). La amplificación por PCR de las 12 muestras produjo bandas fuertes individuales con el tamaño correcto (Figura 3). Ambos pares de cebadores 799F/1193R y 515F/806R amplificaron con éxito los productos objetivo a partir de muestras de tejido de corteza endófita o epí...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desarrollado a partir de la metodología publicada para examinar la microbiota de la corteza 7,18, el flujo de trabajo propuesto por nosotros proporciona una guía general para identificar y caracterizar los microbiomas endófitos y epífitos de la corteza de las plantas leñosas. Este método comprende protocolos para la recolección y el procesamiento de muestras, la extracción de ADN genómico, la amplificación por PCR, la preparación...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Sr. David Anthony Atherton por proporcionar la narración en video y a los miembros del laboratorio B.N. por sus valiosos consejos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (subvención número 32071741 [a BN]), los Proyectos Clave del Plan de Investigación y Desarrollo en la Región Autónoma Uygur de Xinjiang (subvención número 2022B02014), el Plan de Introducción "Talentos de Tianchi" (a BN), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (número de subvención 2021YFD2200203 [a GQ]), y el Proyecto de Innovación del Laboratorio Estatal Clave de Genética y Cría de Árboles (Universidad Forestal del Noreste) (subvención número 2019A01 [a BN]).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipo:
Batidor de perlasDHS Life Science401265
Centrifuge para tubos de 1,5 mlThermo Scientific75002440
Centrífuga para tubos de PCR Lector
microplacasBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Tecnología Co., Ltd.2010/2020 espectrofotómetro de microvolumen
Fluorómetro Qubit 3.0fluorómetro invitrogenQ33216 
Refrigerador(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 TermocicladorBio-Rad1861096termociclador
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313Para electroforesis
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Library Detección de distribución de fragmentos de ADN, análisis de control de calidad de ácidos nucleicos
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Quantification library
Illumina Novaseq6000Illumina Secuenciación de la biblioteca
Materiales:
GuantesCualquierde barrera de aerosol NA
10 μ LAxygenTF-300-R-S
punta de barrera de aerosol 20μ LAxygenTF-20-R-S
punta de barrera de aerosol 200μ LAxygenTF-200-R-S
punta de barrera de aerosol 1000μ LAxygenTF-1000-R-S tubo de
centrífuga 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96-well Black/Clear Flat Bottom MicroplateCorning3631
palito de algodónZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100Para extracción de ADN
tubo de centrífuga sin enzimas 1.5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
etanolTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
tubos duros (5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
tubo de microcentrífuga 2.0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR AguaQIAGEN 17000-10
QIAquick Kit de extracción de gelQIAGEN28704Para
extracción de gel Quant-iT dsDNA Assay Kits, Broad RangeInvitrogenQ33130Para la determinación de la concentración de los productos amplificados y las bibliotecas de amplicones purificados
Petri cuadradaChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
perlas de aceroShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
solución de hipoclorito de sodioTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Kit de reactivos de alta sensibilidad de ADN de protocolo dualPerkinElmerCLS760672Detección de biblioteca de ADN
Kit de cuantificación de biblioteca VAHTS para IlluminaVazyme Biotech Co., LtdBiblioteca de cuantificaciónNQ104
de punta placa deYXB36985

Referencias

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