Método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro

Los cambios fenotípicos en las células que se relacionan con el desarrollo del cáncer a través de un conjunto común de capacidades biológicas alteradas ahora se conocen comúnmente como las características distintivas del cáncer. Entre ellos se encuentran los cambios resultantes de la reprogramación del metabolismo energético, que están muy extendidos en la biología de las células^{cancerosas 1}. Dicha reprogramación metabólica incluye un mayor requerimiento de hierro para apoyar la rápida proliferación y el crecimiento^{tumoral 2}. Esta sed de hierro conduce a un metabolismo del hierro desregulado, que en sí mismo se considera un sello distintivo del cáncer ^3,4, con una desregulación que ocurre en todas las etapas⁵. Las características distintivas de la metástasis, propuestas más recientemente por Welch y Hurst, incluyen un papel para el hierro⁶, ya que el hierro puede inducir estrés oxidativo, y esto puede, a su vez, mediar cambios en el genoma, el epigenoma y el proteoma, aumentando la posibilidad de metástasis⁷. La relación entre los niveles de hierro y una mayor incidencia de cáncer ha sido demostrada a través de estudios epidemiológicos⁸.

Dado que las células cancerosas requieren grandes cantidades de hierro, son susceptibles a la deficiencia de hierro y, por lo tanto, a la quelación del hierro. Recientemente hemos publicado un artículo de revisión que destaca el potencial de la quelación del hierro para revertir varias características distintivas del cáncer a través de NDRG1 que interrumpe las vías de señalización oncogénica⁹. Sin embargo, el uso de la quelación del hierro como terapia oncológica independiente no ha arrojado resultados positivos en los ensayos clínicos debido a su toxicidad, su corta vida media, su rápido metabolismo y sus nuevos mecanismos de resistencia. Sin embargo, los quelantes de hierro se han mostrado prometedores en investigaciones in vitro e in vivo , lo que indica que se necesita más trabajo para desarrollar quelantes de hierro efectivos para la terapia del cáncer. La quelación específica del hierro es una estrategia validada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer, pero hasta la fecha solo se han descrito unas pocas clases¹⁰.

La identificación y caracterización de nuevos quelantes de hierro requiere la capacidad de medir su efecto en varios criterios de valoración. Muchos de ellos (como la proliferación, la apoptosis, la formación de especies reactivas de oxígeno) se miden de forma rutinaria y han sido esbozados y revisados en la literatura como métodos para evaluar las características distintivas del cáncer¹¹. Al evaluar un nuevo quelante de hierro, muchos grupos examinan rutinariamente el efecto sobre las actividades antiproliferativas y redox, así como los efectos sobre la afluencia o el flujo de hierro. Las técnicas de predicción in silico ¹² aumentan aún más la creciente reserva de quelantes de hierro que se pueden analizar.

La creación dequelantes de hierro requiere la capacidad de medir su efecto sobre los niveles de hierro como un medio para demostrar efectivamente la prueba de principio. Actualmente, el método más común para hacerlo es la citometría de flujo¹³ , que es costosa, requiere mucho tiempo y es poco cuantificable. La elección del ensayo a menudo se basa en la disponibilidad de equipo experimental, la velocidad y el costo de un ensayo. Por lo tanto, la capacidad de quelar el hierro puede ser una medida final que se pasa por alto debido a los altos costos de los equipos y al desafío de cuantificar rápida y reproduciblemente la fuerza de la quelación. Aquí, describimos un método fluorescente libre de células cuantificable y económico para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar hierro.

1. Preparación de la solución madre

1. Al preparar soluciones de calceína, evite la fotodegradación manteniendo las soluciones en la oscuridad. Prepare una solución de 1 mM de calceína en el PBS de Dulbecco, sin magnesio ni calcio¹⁴. Para 5 mL de solución de calceína 1 mM, agregue 3,1 mg de Calceína (622,5 g/M) a 5 mL de PBS de Dulbecco. Usando el calcetín de 1 mM de Calceína, prepare 1 mL de alícuotas de soluciones madre secundarias en un tubo de microfuga como se detalla en la Tabla 1.
2. Prepare las reservas de sulfato de amonio férrico hexahidratado disolviendo 19 mg de hexahidrato de FAS (392,1 g/M) en 5 mL de PBS de Dulbecco para obtener una solución de 10 mM de sulfato de amonio férrico (FAS). Preparar existencias secundarias de FAS por dilución. Para preparar un stock de 2 mM FAS (fA), diluya 200 μL del stock de 10 mM FAS con PBS con 800 μL de PBS de Dulbecco. Para preparar un caldo de 100 μM de FAS (fB), diluya 50 μL de caldo fA con 950 μL de PBS de Dulbecco.
3. Para preparar 10 mM de caldo de deferiprona, disuelva 2,8 mg (139,15 g/M) en 2 mL de PBS de Dulbecco. Prepare existencias secundarias de quelante de hierro de 2 mM diluyendo 200 μL de la reserva de 10 mM con 800 μL de PBS de Dulbecco.
   NOTA: En este ensayo, el quelante de hierro de elección debe disolverse en el PBS de Dulbecco sin magnesio ni calcio. Como ejemplo de trabajo, utilizamos el quelante de hierro Deferiprone.

2. Validación del ensayo mediante la determinación del rango lineal de la fluorescencia de la calceína

1. Prepare un rango de calceína de 1 mM a 1 μM como se describe en la tabla de soluciones madre (ver Tabla 1). Mantenga las soluciones madre en la oscuridad para evitar la degradación fotoquímica.
2. Pipetear 90 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en los pocillos de la A a la H y del 1 al 12 de una placa de 96 pocillos utilizando una pipeta manual monocanal o una pipeta manual multicanal.
3. Añada 10 μl de calceína 1 mM en la columna 12, filas de la A a la H, de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta manual de un solo canal.
4. Añada 10 μL del caldo de calceína de 800 μM preparado previamente (Tabla 1) a una placa de 96 pocillos en la columna 11, filas de la A a la H, utilizando una pipeta manual de un solo canal.
5. Repita el procedimiento de adición con las existencias de la Tabla 1 de modo que la columna 10 contenga 10 μL de las 400 μM de las 400 μM y la columna 9 contenga 10 μL de las 200 μM de las existencias, etc. Continúe este procedimiento paso a paso a través de las columnas hasta que la columna 2 contenga 10 μL del caldo de 1 μM.
   NOTA: La concentración final de calceína en cada pocillo es 10 veces menor que las soluciones madre debido a la dilución 1:10.
6. Agregue 10 μL de PBS a la columna 1, filas de la A a la E.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min y ajustar el analizador en un lector de microplacas a una excitación de 490 nm y una detección de 530 nm (o un conjunto de filtros adecuado para fluorescencia Calcien).

3. Validación del ensayo medianteenfriamiento iónico de Fe²⁺ para reducir la fluorescencia de la calceína

1. Prepare un stock de calceína (cB) de 10 μM y un stock de FAS (fA) de 2 mM (ver Tabla de Materiales). Mantenga la culata de calceína en la oscuridad para evitar la fotodegradación.
2. Con una pipeta manual monocanal o una pipeta manual multicanal, añada 50 μl de PBS en las columnas 2 a 10, filas de la A a la E. No agregue PBS a la columna 11.
3. Añada 100 μL de un stock FAS (fA) de 2 mM en una placa de 96 pocillos en la columna 11 (filas A a E) utilizando una pipeta manual de un solo canal.
4. Con una pipeta manual multicanal, extraiga 50 μL de fA de la columna 11 y pipetee en el PBS que ya está en la columna 10, mezcle bien mediante pipeteo.
5. Continúe este procedimiento de doble dilución escalonada a través de las columnas 9-2, filas A a E de la placa de 96 pocillos, y mezcle mediante pipeteo.
6. Retire 50 μL de solución pipeteando de la columna 2 y deseche la solución a los desechos.
7. Agregue 40 μL de PBS en todos los pocillos con una solución en ellos, columnas 2-12, filas A a E.
8. Agregue 90 μL de PBS a la columna 1 de los pocillos, filas A-E. Estos pocillos actúan como un control positivo de 1 μM de calceína y 0 μM de FAS.
9. Añada 10 μL de calceína (cB) de 10 μM en cada pocillo que contenga una solución (columnas 1 a 12, filas de la A a la E). Esto da como resultado una concentración máxima de 1000 μM de FAS en la columna 11, con una concentración de FAS reducida a la mitad para las columnas 10, 9 y 8 a lo largo de la columna 2. Cada uno de los pocillos resultantes de las columnas contiene 1 μM de calceína y una dilución de FAS.
10. Añádase 100 μL de PBS a la fila F de las columnas 1 a 5 para el control PBS solo. Añada 100 μL de 2 mM de FAS a la fila F de las columnas 6 a 10 para el control de FAS solo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
11. Analice en un lector de microplacas configurado para una excitación de 490 nm y una detección de 530 nm (o un conjunto de filtros adecuado para fluorescencia de calceína).

4. Ensayo para cuantificar la capacidad de los quelantes de hierro para superar al quelante débil Calceína porlos iones Fe²⁺

1. Prepare un stock de calceína (cB) de 10 μM, un stock de FAS (fB) de 100 μM y los stocks de quelantes de hierro de 2 mM como se describe en la Tabla 1. Mantenga el calceo en la oscuridad para evitar la fotodegradación.
2. Con una pipeta manual monocanal o una pipeta manual multicanal, añada 50 μl de PBS a las columnas 2 a 10, filas de la A a la E, de una placa de 96 pocillos. No agregue PBS a la columna 11.
3. Añada 100 μL de la reserva de 2 mM (fA) de los quelantes de hierro, en una placa de 96 pocillos en la columna 11, filas de la A a la E, utilizando una pipeta manual de un solo canal.
4. Con una pipeta manual multicanal, extraiga 50 μL de fA de la columna 11 y pipetee en el PBS de la columna 10, filas de la A a la E, mezclando bien mediante pipeteo.
5. Continúe este procedimiento de doble dilución escalonada a través de las columnas restantes 9-2, filas A a E de la placa, mezcle cada pozo pipeteando. Retire 50 μL de la columna 2 y deséchelo. Esto asegura una doble dilución de 2 mM del quelante de hierro (deferiprona) a través de las columnas 11 a 2 de la placa de 96 pocillos, filas de la A a la E.
6. Pipetear 30 μL de PBS en todos los pocillos que contengan una solución (por ejemplo, columnas 2-11 filas de la A a la E).
7. Con una pipeta multicanal, añada 10 μL de 100 μM de culata FAS (fB) en las columnas 2-12, filas de la A a la E. Esto da como resultado una concentración de 1 μM de calceína y 10 μM de FAS en cada pocillo, y una doble dilución de los quelantes, con la concentración reduciendo a la mitad cada columna a través de la placa, columnas 11-2, con la concentración más alta de quelante de hierro a 1000 μM en la columna 11 pocillos A a E.
8. Con una pipeta multicanal, añada 10 μL de calceína (cB) de 10 μM en las columnas 2-12, filas de la A a la E.
9. Pipetear 80 μL de PBS y 10 μL de calceína (cB) y 10 μL de calcea (fB) en la columna 1, filas A-E con una pipeta. Mezclar muestras por pipeteo. Esto proporciona el control de 1 μM de calceína con 10 μM de FAS y sin quelante.
10. Pipetear 100 μL de PBS en las columnas 1 a 5 de la fila F. Esto proporciona el control negativo PBS.
11. Añada 100 μL de 2 mM de quelante de hierro (deferiprona) a la fila F, columnas 6 a 10. Esto proporciona al quelante el control por sí solo.
12. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. Analice en un lector de microplacas multimodal configurado para excitación a 490 nm y detección a 530 nm (o un conjunto de filtros adecuado para fluorescencia Calcien).

5. Análisis de datos

1. Análisis para la validación del ensayo mediante la determinación del rango lineal de la fluorescencia de la calceína.
   1. Calcule la media de las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de las filas A-H para cada concentración de calceína en las columnas de la placa de 96 pocillos del paso 1 y trace en función de la concentración. Traza el gráfico de líneas de la concentración de calceína en el eje x frente a la RFU media en el eje y y utiliza una regresión lineal para proporcionar la línea de mejor ajuste.
   2. Cuantifique la significación estadística comparando las concentraciones de calceína en cada columna (2-11) con el control de PBS en la columna 1 filas de la A a la E. Realice un análisis de varianza (ANOVA) y aplique un análisis post hoc utilizando la diferencia mínima significativa (LSD) con un umbral de p <0,001 para determinar la significación estadística (denotada por ** en la Figura 1).
2. Análisis para la validación de ensayos mediante enfriamiento iónico de Fe²⁺ para reducir la fluorescencia de calceína.
   1. Calcule el promedio de las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de las filas A a E para cada concentración de FAS en las columnas 2-11. Represente gráficamente la media de la RFU para cada concentración de FAS en el eje Y. En el eje x, represente las concentraciones de FAS utilizando una escala Log2 a medida que distribuye mejor los datos. Traza una línea de mejor ajuste utilizando una regresión lineal.
   2. Cuantifique la significación estadística comparando la media de cada columna con la media de la RFU del control de PBS, 1 μM de calceína, 0 μM de FAS (columna 1 fila A a E). Realizar un análisis post hoc de ANOVA con LSD con un umbral de p <0,001 para determinar la significación estadística.
3. Análisis para ensayo: Cuantificación de la capacidad de los quelantes de hierro para superar al quelante débil Calceína por los iones Fe²⁺ .
   1. Calcule el promedio de las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de las filas A a E para cada concentración de quelante en las columnas 2-11. Traza la media de RFU para cada concentración de quelantes en el eje y. En el eje x, trace las concentraciones de quelante utilizando una escala Log2, ya que distribuye mejor los datos.
   2. Cuantifique la significación estadística comparando la media de cada columna con la media de la RFU del control de PBS: 1 μM de calceína y 10 μM de FAS (columna 1, fila A a E). Realizar un análisis post hoc de ANOVA con LSD con un umbral de p <0,001 para determinar la significación estadística.

Para el método mostrado en el paso 2, este primer experimento (Figura 1) estableció el rango lineal del lector de placas de fluorescencia de microtitulación al detectar emisiones fluorescentes de calceína. Nuestros resultados representativos muestran un amplio rango lineal de fluorescencia de calceína de 0 a 100 μM. El análisis post hoc de ANOVA con LSD demuestra que hay diferencias estadísticamente significativas en la RFU media para todas las concentraciones de calceína en comparación con un control de 0 μM de calceína. En experimentos posteriores, se utilizó calceína 1 μM (pasos 3 y 4) ya que produce diferencias estadísticamente significativas con respecto al control de 0 μM y se encuentra dentro del rango que se aplica comúnmente a las células en forma de calceína AM en citometría de flujo13.

Para el método mostrado en el paso 3, demostramos que cuando se agrega hierro en forma de Fe2+ en un rango de 0-1000 μM (como FAS) a 1 μM de calceína, los iones Fe2+ dan como resultado una disminución lineal en la fluorescencia de calceína (RFU). Esto permite la observación del enfriamiento basado en Fe2+ de la fluorescencia de calceína. La calceína, como quelante débil del hierro, se une al hierro y esto reduce la emisión fluorescente. En la Figura 2, las concentraciones de 8,9 μM FAS y superiores mostraron una disminución significativa, p<0,001, en la fluorescencia de la calceína en comparación con 1 μM de calceína sola. El uso de 8,9 μM de FAS se correspondió con una reducción del 33% en la fluorescencia de calceína (RFU media). Para una mayor experimentación (paso 4) se utilizaron 10 μM de FAS, ya que se encontraba dentro del rango de enfriamiento fluorescente de la calceína.

Para el método mostrado en el paso 4, en la Figura 3 se puede observar la superación de la Calceína por los iones Fe2+ por un quelante de hierro. El hierro en forma de Fe2+ disminuye la fluorescencia de la calceína desde el control de 1 μM y el quelante de hierro deferiprona aumenta esta fluorescencia hasta un pico, liberando el enfriamiento del hierro de la calceína y aumentando la fluorescencia (RFU media). La deferiprona (utilizada como ejemplo) en concentraciones que oscilaron entre 0,97 y 512 μM dio lugar a aumentos estadísticamente significativos de la fluorescencia, como se observó con el análisis post hoc de ANOVA y LSD (p<0,001). El mayor cambio fue un cambio de 3 veces en la RFU media a 62,5 μM de quelante en comparación con el control de 1 μM de calceína AM y 10 μM de FAS. Por encima de 512 μM de deferiprona no hubo diferencia estadísticamente significativa entre el quelante y el control de 1 μM de Calceína y 10 μM de FAS.

Figura 1: Concentraciones de calceína y fluorescencia (RFU) determinadas utilizando un lector de placas de microtitulación fluorescente. Aquí se muestran las concentraciones de calceína de 0-100 μM incubadas durante 30 min y la fluorescencia (RFU) determinadas. Los datos muestran la media de 8 réplicas por experimento y tres experimentos independientes, las barras de error muestran un intervalo de confianza del 95% en la media. La significación estadística se denota por **, donde p<0.001 se determina utilizando ANOVA y análisis post hoc de LSD (calculado usando el prisma de la almohadilla gráfica). La RFU media de calceína de cada concentración se compara con el control de PBS y 0 μM de calceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El aumento de la concentración de FAS da como resultado una disminución lineal de la fluorescencia de la calceína. La concentración de FAS se incrementó de 0-1000 μM, lo que resultó en una disminución lineal en la fluorescencia de calceína de 1 μM después de 30 min de incubación en PBS. Los datos mostrados son la media de 5 réplicas por experimento y tres experimentos independientes, las barras de error muestran un intervalo de confianza del 95% en la media. La significación estadística se denota por **, donde p<0.001 se determina utilizando ANOVA y análisis post hoc de LSD (calculado usando el prisma de la almohadilla gráfica). La RFU media de calceína de cada concentración de FAS y 1 μM de calceína se compara con el control de 1 μM de calceína y 0 μM de FAS en PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Aumento de las concentraciones de deferiprona. La concentración de deferiprona se incrementó de 0 a 1000 μM con incubación de 1 μM de calceína, 10 μM de FAS en PBS. La fluorescencia se midió en un lector de microplacas multimodal. Los datos mostrados son la media de 5 réplicas por experimento y tres experimentos independientes, las barras de error muestran un intervalo de confianza del 95% en la media. La significación estadística se denota por ** donde p<0.001 según se determina utilizando ANOVA y análisis posthoc de LSD (calculado usando prisma de bloc de gráficos). La RFU media se comparó con 1 μM de calceína en PBS con 10 μM de FAS y 0 μM de deferiprona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación de calceína para el caldo secundario.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.