Method Article

Dinámica de cAMP en tiempo real en células vivas utilizando el detector de diferencia de cAMP fluorescente in situ

DOI:

10.3791/66451

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March 22nd, 2024

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1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presentado en este estudio ilustra la efectividad del Detector de Diferencia de AMPc In Situ en la medición de AMPc a través de dos métodos. Un método utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos con celdas HEK-293. El otro método muestra células HASM individuales bajo un microscopio fluorescente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) es un nuevo biosensor que permite la medición continua de los niveles de cAMP en células vivas. El biosensor se crea a partir de una proteína fluorescente permutada circularmente unida a la región bisagra de Epac2. Esto crea un único biosensor de fluoróforo que muestra un aumento o una disminución de la fluorescencia tras la unión del AMPc. El biosensor existe en versiones rojas y verdes hacia arriba, así como en versiones verdes hacia abajo, y varias versiones rojas y verdes dirigidas a ubicaciones subcelulares. Para ilustrar la eficacia del biosensor, se utilizó la versión verde hacia abajo, que disminuye la fluorescencia al unirse al AMPc. Se muestran dos protocolos que utilizan este sensor: uno que utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos compatible con el cribado de alto rendimiento y otro que utiliza imágenes de una sola célula en un microscopio fluorescente. En el lector de placas, las células HEK-293 cultivadas en placas de 96 pocillos se estimularon con 10 μM de forskolina o 10 nM de isoproterenol, lo que indujo disminuciones rápidas y grandes de la fluorescencia en la versión verde hacia abajo. El biosensor se utilizó para medir los niveles de AMPc en células individuales de músculo liso de las vías respiratorias humanas (HASM) monitoreadas bajo un microscopio fluorescente. El biosensor verde hacia abajo mostró respuestas similares a las poblaciones de células cuando se estimularon con forskolina o isoproterenol. Este ensayo de una sola célula permite la visualización de la ubicación del biosensor con aumentos de 20x y 40x. Por lo tanto, este biosensor de AMPc es sensible y flexible, lo que permite la medición en tiempo real de AMPc tanto en células inmortalizadas como primarias, y con células individuales o poblaciones de células. Estos atributos hacen que cADDis una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de señalización de cAMP en células vivas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El monofosfato cíclico de adenosina 3',5'-cíclico, AMPc, desempeña un papel central en la comunicación celular y la coordinación de diversos procesos fisiológicos. El AMPc actúa como un segundo mensajero, transmitiendo señales externas de hormonas, neurotransmisores u otras moléculas extracelulares para iniciar una cascadade eventos intracelulares. Además, el AMPc está estrechamente implicado en varias vías de señalización, incluidas las asociadas con los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y las adenilil ciclasas. Comprender el papel del AMPc en la señalización celular es fundamental para desentrañar los complejos mecanismos que subyacen a las funciones celulares normales y el desarrollo de posibles terapias para una amplia gamade afecciones médicas.

En el pasado, se han empleado varios métodos para medir el AMPc directa o indirectamente. Estos incluyeron el radiomarcaje de grupos celulares de ATP seguido de purificación en columna, HPLC, radioinmunoensayos e inmunoensayos ligados a enzimas 1,2. Estos ensayos heredados están limitados por el hecho de que son medidas de punto final, que requieren un gran número de muestras para construir respuestas dependientes del tiempo. Más recientemente, se desarrollaron sensores de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para crear ensayos en células vivas, produciendo datos dinámicos en tiempo real y permitiendo que los sensores se dirijan a diferentes ubicaciones subcelulares3. FRET aprovecha dos fluoróforos, un donante fluorescente y un aceptor fluorescente que, cuando están muy cerca, el fluoróforo aceptor será excitado por la salida fluorescente del donante. Los dos fluoróforos más utilizados son la proteína fluorescente cian (CFP) y la proteína fluorescente amarilla (YFP), ya que tienen propiedades de excitación y emisión compatibles. Además de CFP e YFP, la utilización de la proteína fluorescente verde (GFP) y la proteína fluorescente roja (RFP) se usa comúnmente para los biosensores FRET. Los biosensores cAMP FRET funcionan teniendo un donante y un aceptor en los extremos opuestos de la proteína de unión a Epac2 cAMP. La unión de AMPc altera la confirmación de Epac y aumenta la distancia entre los fluoróforos donantes y aceptores 3,4. Este cambio conformacional se detecta por una pérdida de FRET, es decir, la excitación del fluoróforo aceptor por la energía transferida de las gotas de fluoróforo donantes3. Si bien es un proceso aparentemente simple, existen una gran cantidad de limitaciones y problemas con el biosensor FRET para la investigación de cAMP5. Una de ellas es la selección de proteínas fluorescentes, por ejemplo, GFP, que pueden dimerizarse de forma natural, reduciendo así la sensibilidad6. Los biosensores de AMPc basados en FRET se han dirigido a microdominios específicos7, pero puede haber limitaciones debido al gran tamaño de una construcción con dos fluoróforos6. Otra cuestión importante es la baja relación señal-ruido de las señales FRET resultante de la superposición entre la excitación y la emisión del fluoróforo, lo que da lugar a una alta frecuencia de muestreo y complica el análisis de los resultados 4,5.

Más recientemente, el novedoso biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, ha resuelto estas y otras limitaciones a la hora de estudiar la regulación de la señalización de cAMP8. Una mejora importante es la dependencia de un solo fluoróforo. Esto permite una señal rápida y eficiente con un rango dinámico más amplio y una alta relación señal-ruido. Como resultado, puede haber más precisión, ya que hay un alcance menos amplio de longitudes de onda para peinar8. Al igual que las sondas FRET, el biosensor se ha dirigido a ubicaciones subcelulares, lo que permite la investigación de la teoría de la compartimentación y la exploración en balsas y no balsas lipídicas, y otros dominios subcelulares9. Quizás lo más importante es la idoneidad de un solo biosensor de fluoróforo para el cribado de alto rendimiento, que ha mejorado la sensibilidad y la reproducibilidad en comparación con los biosensores basados en FRET. El biosensor está empaquetado en un vector BacMam para una fácil transducción de una amplia gama de tipos de células y un control preciso sobre la expresión de proteínas.

El control de la expresión a través del vector BacMam puede ser especialmente útil en ensayos que utilizan ortólogos GPCR de diferentes especies para facilitar la interpretación de los datos de los estudios con animales. Además, el control sobre la expresión del receptor es fundamental para medir los diferentes grados de eficacia del fármaco (por ejemplo, agonistas inversos y agonistas parciales), y los niveles bajos de expresión del receptor son útiles para imitar los niveles bajos que se encuentran en el tejido animal. BacMam es un vector de baculovirus que ha sido modificado para transducir células de mamíferos como cultivos celulares primarios y líneas HEK-29310. Los marcadores dominantes seleccionables permiten que BacMam proporcione más estabilidad sobre las infecciones plásmidas tradicionales11. Estos promotores selectivos permiten una entrega y expresión génica más eficientes. Además, la adición de tristolatina A (un inhibidor de la histona desacetilasa) aumenta los niveles de proteínas reporteras11. Los niveles de expresión pueden controlarse a través del título del virus BacMam utilizado y deben optimizarse para cada tipo de célula. En el caso de este biosensor, una proteína fluorescente roja o verde se une a la Epac en los extremos N y C. Cuando el AMPc se une, un cambio conformacional en el biosensor mueve los aminoácidos adyacentes a la proteína fluorescente. Tal cambio mueve la absorbancia del estado aniónico al estado neutro a 400 nm, disminuyendo así la fluorescencia.

Existen entre 90 y 120 GPCRs expresados en una sola célula que responden a una amplia variedad de señales neurohumorales12. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que al menos varias docenas de GPCR por célula pueden estimular o inhibir el AMPc a través del acoplamiento Gs o Gi, respectivamente. Si bien ha habido avances en el monitoreo de este segundo mensajero en tiempo real, como FRET, se necesitan métodos más eficientes. Aquí se presenta la metodología para monitorear la síntesis y degradación de señales de cAMP utilizando cADDis en tiempo real. El cambio en la fluorescencia se puede monitorear en tiempo real utilizando un lector de placas de fluorescencia para ensayos de alto rendimiento o usando un microscopio fluorescente para ensayos de una sola célula. Estos métodos son útiles para una amplia gama de cuestiones biológicas relacionadas con la señalización de GPCR a través de cAMP.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Ensayo de alto rendimiento con espectrofotómetro de lectura de placas

  1. Siembra de células HEK-293 con el vector cADDis BacMam en una placa de 96 pocillos (Día 1)
    1. Divide e infecta las células en una capucha viral.
      1. Medios HEK calientes (Tabla 1) y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño de agua a 37 °C.
      2. Desinfecte la campana y los materiales limpiándolos con pañuelos empapados en EtOH.
      3. Retire y deseche los medios HEK del matraz con una pipeta serológica.
      4. Añadir 5 mL de DPBS libres de Mg2+ y Ca2+ (37 °C) con una pipeta serológica. Incline el matraz hacia adelante y hacia atrás para lavar el fondo con DPBS. Retire y deseche el DPBS con una pipeta serológica.
      5. Tripsinizar las células añadiendo 3 mL de tripsina-EDTA calentada al 0,25% con una pipeta serológica. Incline el matraz para asegurarse de que el reactivo cubra completamente el fondo del matraz. Coloque la tapa en el matraz y deje reposar el reactivo durante 3-5 minutos para permitir que las células se desprendan del matraz.
        NOTA: Este experimento está optimizado para un matraz de75 cm2 ; Es posible que sea necesario ajustar el volumen de los reactivos si se utiliza un aparato de cultivo de diferente tamaño.
      6. Extraiga 5 ml de medio fresco que contenga antibióticos. Expulse y extraiga el volumen del matraz para lavar las paredes del matraz y separar físicamente las celdas.
      7. Recoja el volumen total del matraz (8 mL) y centrifugue (25 °C) en un tubo de 15 mL a 200 x g durante 5 min.
      8. Después de centrifugar, retire el sobrenadante con una pipeta serológica, con cuidado de no alterar el pellet.
      9. Para lavar las células sin alterar el pellet, agregue 500 μL de DPBS sin Mg2+ y Ca2+ DPBS al lado del tubo de 15 mL. Después de agregar suavemente el DPBS, retire y deseche la mayor cantidad posible de tampón sin alterar el pellet. Repite una vez más.
      10. Cuente las células y ajústelas a una densidad celular de 250.000 células/mL de células.
      11. Elabore una mezcla maestra en función de los volúmenes de reactivos que se necesitan por pocillo de una placa negra de 96 pocillos con fondo transparente. Esto se conoce como la "placa de tejido". Véanse los volúmenes a continuación:
        NOTA: Ejemplo de 1 pocillo (volumen total 200 μL): 40 μL del vector biosensor BacMam (stock de 2 x10 10 genes virales/mL), 2 μL de trichostatina A (stock de 100 μM; concentración final 1 μM), 158 μL de 250.000 células/mL de densidad celular. Ejemplo de 10 pocillos (volumen total 2 mL): 400 μL del vector biosensor BacMam (stock de 2 x10 10 genes virales/mL), 20 μL de tristolatina A (stock de 100 μM), 1.580 μL de medio con una densidad celular de 250.000 células/mL.
      12. Añadir 200 μL de mezcla maestra por pocillo. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 en una incubadora durante 24 h antes de ponerlas en marcha en el espectrofotómetro de lectura de placas.
  2. Ejecución en un lector de placas
    1. En una mesa de trabajo, retire con cuidado todos los medios de cada pocillo y reemplácelos con 180 μL de DPBS con Mg2+ y Ca2+ a 37 °C.
    2. Inspeccione las células en un microscopio para confirmar la salud de la célula.
    3. Envuelva la placa en papel de aluminio e incube a 37 °C durante 30 min-1 h.
    4. Durante la incubación, prepare los fármacos para la lectura a una dilución de 1:10 (también llamada 10 veces) para la dosis final deseada. Por lo tanto, prepare 100 μM de forskolina y 100 nM de isoproterenol.
    5. Agregue 60 μL de cada medicamento en forma de columna a una placa transparente de 96 pocillos (conocida como la "placa del medicamento").
      NOTA: Con la dilución adecuada del fármaco y para optimizar la lectura, los fármacos se añaden a una placa transparente de 96 pocillos, denominada "placa de fármaco", que se transfiere en el momento de la lectura a la "placa de tejido" utilizando una pipeta multipipeta de 96, lo que permite que el fármaco se añada a todos los pocillos simultáneamente y sea leído rápidamente por el espectrofotómetro fluorescente.
  3. Configuración del lector de placas de fluorescencia
    1. Ajuste la configuración del lector de placas de fluorescencia.
      1. Modo de lectura: fluorescencia. Tipo de lectura: cinético. Lectura de longitudes de onda: 494 nm y 522 nm.
      2. Tiempo de lectura: Ingrese 3 minutos para la lectura fluorescente de referencia y 7 minutos para la adición posterior al medicamento. Intervalo" se introduce como 00:00:30 durante 30 s entre cada lectura.
        NOTA: El tiempo de lectura se puede optimizar y aumentar en función del tiempo requerido.
  4. Adquisición de datos
    1. Retire la placa de pañuelo de la incubadora, retire el papel de aluminio y la tapa de la placa, y coloque la placa de papel en el lector de placas. Cierre el cajón del lector para permitir que la placa de papel descanse y se equilibre a la temperatura del lector (37 °C).
    2. Coloque la placa transparente de 96 pocillos (placa de fármaco) con las diluciones de fármaco bajo la pipeta multi 96 y practique extrayendo 20 μL de los pocillos. Asegúrese de que haya un volumen uniforme de medicamento extraído en las puntas de las pipetas.
    3. Inicie una ejecución de medición de "línea de base".
      NOTA: 40 RFU o más se consideran datos viables. Si los datos están por debajo de este valor, el experimento debe detenerse y descartarse.
    4. La placa de tejido se expulsará del lector al final de la ejecución de la línea de base. Agregue rápida y cuidadosamente 20 μL de la placa transparente del medicamento a la placa de tejido negro. Luego, comience rápidamente la ejecución del "tratamiento". La placa de tejido no debe estar fuera del lector durante más de 30 segundos después de la adición de los fármacos.
      NOTA: Si el fármaco se añade demasiado rápido, las células se desprenden de la placa de tejido, creando un experimento inutilizable. Además, las células están infectadas con una proteína fluorescente verde sensible a la luz; Por lo tanto, es imperativo agregar los medicamentos de manera rápida y oportuna y comenzar la segunda lectura para evitar perderse la primera parte de la respuesta.
    5. Una vez completada la segunda lectura, asegúrese de que la placa de tejido se expulse del lector y se concluya la recopilación de datos.
      NOTA: Antes de desechar la placa de tejido, es una buena práctica verificar que las células aún estén adheridas a la placa. Observa las células bajo un microscopio. Si las celdas se separan, los resultados no son válidos y deben descartarse. Será necesario repetir el experimento.
    6. Exporte los datos resultantes como un archivo de Excel.
    7. Abra los datos legibles de Excel exportados desde el lector de placas y copie y pegue la información relevante en la plantilla de conversión de Excel. Los datos se transformarán de la configuración del lector de placas a lecturas de columna de un solo pozo a la derecha de los datos copiados.
      NOTA: Las columnas de fluorescencia de un pozo a lo largo del tiempo se enumeran en RFU (titulada transformación de columna) y como un cambio decimal en relación con la lectura de RFU en la lectura inicial (t0 titulada Delta F). En la plantilla de Excel, la tabla Delta F se establece en la última lectura de referencia antes de la adición del fármaco. Este es el6º punto de recogida de datos.
    8. Después de la transformación de datos, copie los datos de Delta F y péguelos en el software de análisis de datos como decaimiento o decaimiento relativo en fluorescencia a lo largo del tiempo.
    9. Cambie el título X a "tiempo (s)" y el título Y a "ΔF/F0" para valores decimales relativos.

2. Ensayo de una sola célula con un microscopio fluorescente invertido

  1. Siembra de células (HASM) con el vector cADDis BacMam en una placa de 35 mm (Día 1)
    1. Divide e infecta las células en una capucha viral.
      1. Medios HASM calientes (Tabla 1), 0,25% de tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 °C.
      2. Desinfecte la campana y los materiales y limpie la campana con pañuelos empapados en EtOH.
      3. Retire y deseche el medio HASM del matraz con una pipeta serológica.
      4. Añadir 5 mL de DPBS libre de Mg2+ y Ca2+ (37 °C) con una pipeta serológica nueva e inclinar el matraz para lavar el fondo con el DPBS.
      5. Tripsinizar las células añadiendo 3 mL de tripsina-EDTA calentada al 0,25% con una pipeta serológica. Incline el matraz para asegurarse de que el reactivo cubra completamente el fondo del matraz. Deje reposar el reactivo durante 3-5 minutos para permitir que las células se desprendan del matraz.
      6. Extraiga 5 ml de medio fresco que contenga antibióticos y expulse la pipeta para extraer las células del fondo del matraz.
      7. Recoja el volumen total de la centrífuga del matraz (8 mL) en un tubo de centrífuga a 200 x g durante 5 min.
      8. Después de centrifugar, retire el sobrenadante con una pipeta serológica, con cuidado de no alterar el pellet.
      9. Sin alterar el pellet, agregue 500 μL de DPBS sin Mg2+ y Ca2+ DPBS al costado del tubo de centrífuga. Retire y deseche la mayor cantidad de líquido posible y repita una vez más.
        NOTA: Este experimento está optimizado para un matraz de75 cm2 ; Es posible que sea necesario ajustar el volumen de los reactivos si se utiliza un aparato de cultivo de diferente tamaño.
      10. Cuente las células y ajústelas a una densidad de células de 40.000 células/mL.
      11. Realice una mezcla maestra basada en el volumen de reactivo necesario por pocillo de un plato de 35 mm. Véanse los volúmenes a continuación:
        NOTA: Ejemplo de 1 pocillo (volumen total 500 μL): 20 μL del vector biosensor BacMam (stock de 2 x10 10 genes virales/mL), 5 μL de tricostatina A (stock de 100 μM, concentración final 1 μM), 500 μL de 40.000 células/mL de densidad celular. Ejemplo para 4 pocillos (volumen total 2 mL): 80 μL del vector BacMam del biosensor (stock de genes virales /mL), 20 μL de tristolatina A (stock de 100 μM, concentración final 1 μM), 2000 μL medios 40.000 células/mL de densidad celular.
      12. Añadir 500 μL de mezcla maestra por pocillo. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h antes de continuar con el experimento.
        NOTA: El número de celda puede variar según la línea celular. Para evitar la superposición de celdas para el análisis, utilice números de celda bajos.
  2. Preparación de agentes farmacológicos (Día 2)
    1. Retire con cuidado los medios de cada pocillo y sustitúyalos por 450 μL de DPBS con Mg2+ y Ca2+ a 37 °C.
    2. Envuelva la placa en papel de aluminio e incube el disco de 35 mm a 37 °C durante 30 min-1 h.
    3. Inspeccione las células en un microscopio para confirmar la salud de la célula.
    4. Mientras tanto, prepare los medicamentos para la lectura 1 unidad logarítmica por encima de la concentración final deseada (10 veces mayor). Por lo tanto, prepare 100 μM de forskolina y 100 nM de isoproterenol.
    5. Para títulos de dosis logarítmicas, prepare el medicamento a 10 mM y use diluciones seriadas para lograr 100 μM de forskolina y 100 nM de isoproterenol.
  3. Adquisición de datos
    NOTA: Los siguientes ajustes son para un microscopio fluorescente invertido. El software que acompaña a cada microscopio puede diferir; Aquí se describen los ajustes generales utilizados en el protocolo actual.
    1. Encienda el cubo central y luego el microscopio fluorescente invertido.
    2. Abra el software que se utilizará para la captura y elija la opción de captura de lapso de tiempo .
    3. Coloque un portamuestras de plato de 35 mm en la platina del microscopio.
    4. Ajuste la lente del objetivo a x20.
    5. Utilice el enfoque automático y obtenga una imagen lo más clara posible. Si es difícil encontrar celdas individuales, comience con un objetivo de 4x, luego pase a 20x. Enfoque la muestra manualmente si el microscopio carece de una función de enfoque automático.
      NOTA: El aumento de 40x se puede utilizar si se necesitan detalles morfológicos celulares más significativos.
    6. Ajuste los siguientes ajustes para obtener una adquisición de datos óptima: Brillo automático (exposición), Longitud de onda de excitación, Balance de negros (para reducir el ruido de fondo), Enfoque automático.
    7. Después de encontrar un área de visión con varias células fluorescentes citoplasmáticas, adquiera datos utilizando la captura de lapso de tiempo durante 20 minutos cada 30 s.
    8. Haga clic en el botón para comenzar la lectura.
    9. Ejecute durante 3 minutos para recoger la línea de base. Tan pronto como se tome la captura de 3 minutos, agregue suavemente 50 μL del medicamento al pocillo apropiado. Cuando se añaden los fármacos, la concentración final en la placa será de 10 μM de forskolina y 10 nM de isoproterenol.
      NOTA: El medicamento debe agregarse con cuidado; No toque la placa con la punta de la pipeta, ya que esto puede mover el campo de visión realizado y hacer que la muestra no pueda ser analizada.
    10. Deje que el experimento se ejecute durante 17 minutos más con captura de datos cada 30 s.
    11. Una vez completada la prueba, asegúrese de que los datos estén listos para el análisis.
      NOTA: Si bien el protocolo actual no incorpora un control para la deriva focal, podría ser beneficioso incluir uno en el experimento. Por ejemplo, el uso de tintes nucleares puede ayudar a controlar la deriva focal durante el análisis microscópico, especialmente cuando se capturan imágenes de células vivas durante períodos prolongados. Los biosensores cADDis suelen estar ampliamente distribuidos dentro de la célula, lo que hace que un plano focal amplio sea la captura más eficaz y reduce la necesidad de controlar la deriva focal9.
  4. Análisis de los datos
    NOTA: El software que acompaña a cada microscopio puede diferir, por lo que aquí se describen los ajustes generales que se deben utilizar para analizar las imágenes capturadas.
    1. Abra los archivos de imagen capturados durante el experimento.
    2. Utilice la herramienta polígono o círculo para seleccionar la región de interés de cada celda para realizar el análisis. El análisis debe dar el brillo de cada celda en cada punto de tiempo.
      NOTA: La mejor práctica es seleccionar celdas individuales y no celdas que toquen la pared de la placa u otras celdas. Esto garantiza la mejor recopilación de datos posible. Seleccione un mínimo de 5 celdas para el análisis dentro de cada condición y replique el experimento al menos tres veces.
    3. Después de analizar los datos, abra los datos en una hoja de Excel y calcule el brillo promedio para cada condición en cada foto, comenzando en la imagen justo antes de agregar los agentes farmacológicos o el vehículo. En este ejemplo, a los 3 minutos o a la6ª foto tomada con el microscopio, ya que cada imagen se toma cada 30 s.
    4. Calcule ΔF/F0 para cada valor promedio en cada condición.
    5. Cargue en un software de análisis estadístico y trace ΔF/F0 contra el tiempo en s.
      NOTA: La Figura 1 proporciona una descripción general esquemática de los pasos principales de los protocolos.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio validó el biosensor citosólico tanto en lectura de placas como en ensayos de microscopio. Una vez que las células expresaron el biosensor, se estimularon con 10 μM de forskolina (un activador directo de la adenilil ciclasa), 10 nM de isoproterenol (un agonista a ß1AR y ß2AR) o vehículo (Figura 1). Los cambios posteriores en la fluorescencia, indicativos de la producción de AMPc, se capturaron cada 30 s.

Los datos se transformaron como el cambio en la fluorescencia de la fluorescencia inicial (ΔF/F0). Se aplicó un modelo de desintegración de un sitio a los datos de fluorescencia para cuantificar los cambios temporales en los niveles de AMPc en las diferentes condiciones (Figura 2 y Figura 3). Los parámetros de estas curvas de descomposición se pueden utilizar para cuantificar la respuesta a una concentración dada del fármaco. Se utilizó el producto de la tasa de decaimiento (k) y la meseta como un único valor que cuantifica la respuesta al fármaco, y estos se utilizaron para crear curvas de concentración-respuesta cuando se aplican múltiples concentraciones del mismo fármaco13.

En el lector de placas, tras la estimulación con 10 μM de forskolina, el sensor citosólico mostró una disminución considerable de la intensidad de la fluorescencia en cuestión de segundos y progresó a lo largo de muchos minutos (desde el valor basal de 0 ΔF/Fo a los 200 s hasta -0,7 ΔF/Fo a los 600 s) en las células HEK-293 (Figura 2A). Dado el diseño del sensor verde, una disminución en la fluorescencia indica un aumento en la producción de AMPc, lo que indica que la forskolina causó un aumento uniforme en los niveles de AMPc en el citosol. La estimulación de las células HEK-293 con una concentración submáxima de isoproterenol (10 nM) condujo a disminuciones rápidas pero más pequeñas en la fluorescencia del biosensor (-0,3 ΔF/Fo a 600 s, Figura 2A). Cuando se examinaron estas concentraciones más bajas de isoproterenol (10 nM y 100 nM) en un solo pocillo de células a lo largo del tiempo, se observaron oscilaciones de los niveles de AMPc en las células HEK-293 (Figura 2B). La periodicidad de estas oscilaciones fue consistentemente alrededor de 200 s. El análisis rutinario de los datos incluye el ajuste de la respuesta a un modelo de decaimiento de un solo sitio, que promedia estas oscilaciones (ver línea de conexión). El promedio de varios experimentos juntos generalmente condujo a que estas oscilaciones se oscurecieran en los datos. No obstante, el biosensor muestra una sensibilidad y una cinética rápida que permiten la observación de las oscilaciones del AMPc.

La cADDis también se puede medir con un microscopio de fluorescencia. Este enfoque permite la monitorización del AMPc en células individuales y también se puede adaptar para visualizar biosensores que se dirigen a diferentes ubicaciones subcelulares. En el presente estudio, el biosensor se utilizó en células primarias de músculo liso de las vías respiratorias humanas (HASM). La estimulación de HASM con cualquiera de los vehículos, 10 μM de forskolina o 10 nM de isoproterenol conduce a una disminución observable en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo (desde el inicio de 0 ΔF/Fo a 120 s hasta -0.9 ΔF/Fo a 410 s) (Figura 3) (Video 1, Video 2 y Video 3). La fluorescencia se distribuye uniformemente por todo el citosol de las células y excluye el núcleo (ver los vídeos de time-lapse). Por lo tanto, la forskolina y el isoproterenol produjeron una disminución rápida y considerable similar en las células HASM de fluorescencia. Estos datos demuestran la capacidad de utilizar el biosensor en cultivos celulares primarios.

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Figura 1: Representación esquemática de los pasos del protocolo de biosensores. Inicialmente, las células de cultivo se dividen y se resuspenden con medios frescos, luego se infectan con el virus BacMam que lleva los sensores cADDis. Las células post-transfección son estimuladas con agentes farmacológicos que desencadenan vías celulares que alteran el AMPc. Los cambios en la intensidad de la fluorescencia en respuesta a la variación de la concentración de AMPc se capturan utilizando un espectrofotómetro de lectura de placas (A) o un microscopio de fluorescencia (B), lo que proporciona una cuantificación en tiempo real de la dinámica del AMPc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Monitoreo en tiempo real de cAMP en celdas HEK-293 vivas en un espectrofotómetro de lectura de placas. La fluorescencia de las células HEK-293 en placas de 96 pocillos que expresan el biosensor se midió a lo largo del tiempo. Después de establecer la fluorescencia basal, se monitoreó el decaimiento de la fluorescencia durante 7 min. (A) El decaimiento de la fluorescencia después de la adición de 10 μM de forskolina o 10 nM de isoproterenol se representa como la media ± SEM de 10-15 experimentos. (B) Las oscilaciones de decaimiento de la fluorescencia se muestran trazando un solo experimento después de la adición de 10 nM o 100 nM de isoproterenol. Los datos de ambos gráficos se ajustan a un modelo de decaimiento de un solo sitio (línea de conexión). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Monitorización en tiempo real de cAMP en células HASM vivas en un microscopio de fluorescencia. Se midió a lo largo del tiempo la fluorescencia de las células HASM en placas plateadas de 35 mm que expresan el biosensor. Una vez establecidos los valores basales, se midió el decaimiento de la fluorescencia cada 30 s durante 20 min. El agente indicado se añadió a los 120 s (flecha). La fluorescencia del biosensor se curva en respuesta a cualquiera de los vehículos, 10 μM de forskolina o 10 nM de isoproterenol. Los datos de un solo experimento se muestran con una línea de conexión. Se incluyen videos de lapso de tiempo de células tratadas con vehículo (control), forskolina o isoproterenol para proporcionar una representación visual de las respuestas fluorescentes del biosensor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Vídeo time-lapse de monitorización en tiempo real de cAMP en células HASM en vivo en respuesta al vehículo. Curvas de decaimiento de fluorescencia del biosensor en respuesta al vehículo (control). Cada fotograma se capturó cada 30 s durante 20 min. Barra de escala: 40 μM. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 2: Vídeo time-lapse de monitorización en tiempo real de AMPc en células HASM vivas en respuesta a 10 μM de forskolina. Curvas de decaimiento de fluorescencia del biosensor en respuesta a 10 μM de forskolina. Cada fotograma se capturó cada 30 s durante 20 min. Barra de escala: 40 μM. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 3: Vídeo time-lapse de la monitorización en tiempo real del AMPc en células HASM vivas en respuesta a 10 nM de isoproterenol. Curvas de decaimiento de fluorescencia del biosensor en respuesta a isoproterenol de 10 nM. Cada fotograma se capturó cada 30 s durante 20 min. Barra de escala: 40 μM. Haga clic aquí para descargar este video.

Formulación de medios
Medio HASM
NombreVolumen
El F-12K de Ham419.65 mL
FBS (en inglés)50 mL
HECTÁREAS (1M)12,5 ml
Solución de hidróxido de sodio6 mL
L-glutamina 200 mM (100X)5 mL
Cloruro de calcio (1 M)0,850 ml
Antibiótico-Antimicótico (100X)5 mL
Primocina1 mL
HEK medio
NombreVolumen
DMEM (1x)444 mL
FBS (en inglés)50 mL
Antibiótico-Antimicótico (100X)5 mL
Primocina1 mL

Tabla 1: Formulación de medios de medio HASM y medio HEK.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La medición precisa y sensible del AMPc es crucial para comprender su papel en diversos procesos celulares y para estudiar la actividad de las vías de señalización dependientes del AMPc. Existen varios métodos comúnmente empleados para medir los niveles de AMPc, incluyendo ELISA, radioinmunoensayo, biosensores FRET y el ensayo GloSensor cAMP 14,15,16,17,18. Cada ensayo de AMPc tiene fortalezas y debilidades. El protocolo permite la detección y monitorización en tiempo real, desde minutos hasta horas, y la medición de la dinámica del AMPc dentro de las células vivas sin necesidad de incluir inhibidores de la fosfodiesterasa. Este último punto es crítico para los investigadores interesados en estudiar el papel de las isoformas de fosfodiesterasa en la regulación de la señalización de AMPc19. El biosensor está disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) en múltiples versiones: un fluoróforo verde que disminuye la fluorescencia tras la unión del AMPc, un fluoróforo rojo que exhibe una mayor fluorescencia al unirse al AMPc, y un fluoróforo verde que exhibe una mayor fluorescencia al unirse al AMPc. La versión descendente del biosensor es la más útil, ya que el principal factor limitante es el nivel de expresión del biosensor, y esta versión mostrará la fluorescencia máxima al inicio del estudio antes de comenzar un experimento, lo que alivia la necesidad de evaluar la expresión del biosensor mediante la adición de un estímulo de AMPc máximo. El biosensor también está disponible en versiones dirigidas a microdominios de membrana, cilios primarios o al núcleo. Estas diferentes versiones permiten realizar mediciones de AMPc simultáneamente en compartimentos citosólicos y de membrana/cilial dentro de la misma célula. Estas novedosas herramientas son especialmente hábiles en la visualización y cuantificación de la dinámica del AMPc en diferentes componentes celulares, un área de estudio importante y en rápida evolución20.

Los biosensores ofrecen un método sencillo para monitorear de manera efectiva la dinámica del AMPc en tiempo real, lo que permite a los investigadores observar cambios rápidos en los niveles de AMPc con una resolución temporal excepcional. Una de las principales fortalezas del biosensor radica en su alta sensibilidad, que permite la detección de variaciones sutiles y significativas en las concentraciones de AMPc8. Un ejemplo de esto en las oscilaciones de AMPc se observa a niveles bajos de estímulo isoproterenol en células HEK-293 sin inhibidor de la fosfodiesterasa presente (Figura 2B). Este comportamiento oscilatorio no se comprende y parece exclusivo de estas células, pero la sensibilidad y la rápida cinética del biosensor permiten su detección. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el biosensor puede saturarse fácilmente, por lo que este biosensor puede verse limitado en la cuantificación de las diferencias entre las señales de cAMP medianas y grandes. Esta característica limitante es particularmente relevante cuando se emplean inhibidores de la fosfodiesterasa que causan aumentos globales en los niveles de AMPc cuando también está presente un estímulo receptor. Si bien presentamos la infección de HASM en este estudio, es importante reconocer el desafío asociado con la infección de células primarias utilizando el vector BacMam. Las condiciones deben optimizarse para los tipos de células individuales con el fin de lograr una expresión suficiente del biosensor. No obstante, la sensibilidad y la escalabilidad del biosensor lo hacen muy adecuado para ensayos de alto rendimiento.

Otra mejora del uso de este biosensor sobre los sensores basados en FRET es la minimización del fotoblanqueo. Muchos biosensores fluorescentes están sujetos a fotoblanqueo después de una excitación prolongada y repetida. Los protocolos descritos aquí involucran excitaciones de corta duración que están espaciadas por 30 s. El biosensor también es extremadamente brillante, lo que limita el potencial de fotoblanqueo para este tipo de análisis. El fotoblanqueo se observaría durante la lectura inicial de la línea de base como una deriva. Si se produjera una deriva de la línea de base, se podría restar la línea de base de la deriva de los datos antes de ajustar la curva o aumentar el intervalo de muestreo para reducir la frecuencia de excitación.

Al igual que otros biosensores de AMPc, este biosensor tiene una alta especificidad para unirse a AMPc. En consecuencia, las señales generadas por este ensayo se correlacionan directamente con los niveles de AMPc, lo que reduce significativamente la interferencia potencial de otros componentes celulares y proporciona resultados fiables. Además, cabe destacar la versatilidad del biosensor. Si bien el ensayo GloSensor se usa ampliamente en el campo, tiene ciertas limitaciones. Por ejemplo, confiar en la transfección transitoria puede dar lugar a ineficiencias en tipos de células específicas, y el análisis de múltiples parámetros o procesos dentro de la misma célula es un desafío. Además, el ensayo se basa en enzimas luciferasas que pueden ser influenciadas por ciertos compuestos, lo que puede comprometer la precisión de los resultados21. Por otro lado, el biosensor, puede ser empleado en varios tipos de células y sistemas experimentales, incluyendo células adherentes y en suspensión. Su compatibilidad con diversos contextos celulares permite a los investigadores investigar la dinámica del AMPc en diferentes sistemas biológicos 22,23,24. La integración de este ensayo biosensor con la microscopía de fluorescencia aumenta aún más su utilidad, ya que también se puede recopilar información morfológica celular 25,26,27.

Este ensayo proporciona a los investigadores una gran flexibilidad en el diseño experimental, lo que permite una amplia gama de investigaciones relacionadas con la señalización de cAMP. Sirve para múltiples propósitos, permitiendo la medición de los niveles basales de AMPc, el estudio de las fluctuaciones de AMPc en respuesta a diversos estímulos o tratamientos, y la exploración de la dinámica del AMPc en diversas condiciones fisiológicas o patológicas. Uno de los puntos fuertes del ensayo es su compatibilidad con otras técnicas, lo que permite una comprensión más completa de la señalización del AMPc. Al combinar el biosensor con métodos como la tinción de inmunofluorescencia o la manipulación genética10, los investigadores pueden obtener conocimientos más profundos sobre la regulación espacial y temporal precisa del AMPc dentro de compartimentos celulares específicos o vías de señalización. A través de esta integración, los investigadores pueden investigar las diversas funciones del AMPc en diversos contextos, lo que conduce a información valiosa sobre las complejidades de los procesos celulares mediados por AMPc. El empleo de estas técnicas permite a los investigadores visualizar y cuantificar los niveles de AMPc tanto a nivel de célula individual como de población, ofreciendo una comprensión completa de su distribución dentro de la célula, incluida la identificación de grupos de AMPc. Como resultado, la combinación de estos métodos permite la adquisición de datos precisos, lo que contribuye significativamente a nuestro conocimiento de la señalización de cAMP.

Si bien los métodos tradicionales han sido valiosos para el análisis de AMPc, la introducción de cADDis representa un avance prometedor en este campo. Su especificidad, sensibilidad y capacidades en tiempo real lo convierten en una valiosa adición al conjunto de herramientas del investigador, particularmente debido a su compatibilidad con células vivas. Con la capacidad de monitorizar los niveles de AMPc en tiempo real y su alta sensibilidad, el biosensor ofrece una ventaja significativa en diversos entornos experimentales. Este progreso contribuye a una comprensión más profunda de la naturaleza dinámica de la señalización de cAMP y sus implicaciones funcionales en procesos fisiológicos y patológicos.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue respaldado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI, por sus siglas en inglés) (HL169522).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de 96 pocillos (transparente)Fisherbrand21-377-203
Plato de 35 mmGreiner Bio-One627870Platos de cultivo celular con fondo de vidrio
Placa de 96 pocillos Corning3904Negro con fondo plano
transparente Antibiótico-Antimicótico (100x)Gibco15240062Para medios HEK y HASM
Microscopio de fluorescencia BZ-XKeyence
Cloruro de calcio (IM)Quality Biological IncE506Para medios HASM
Tubo de centrífuga (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092HEK
medios DPBS con Mg2+ y Ca2+ Gibco14040-133
DPBS sin Mg2+ y Ca2+Corning14040-133
Suero fetal bovino (FBS)R& D systemsS11195Para medios HEK y HASM
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMolecular#D0200GReactivo
Ham's F-12K Gibco21127022Para medios HASM
HEPES (1M)Gibco15630080Para medios HASM
IsoproterenolSigmaI6504Droga
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081Para medios HASM
Tubo de microcentrífuga (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiótico para medios HASM
Eliminación de ARNasaReactivoThermo Scientific
Solución de hidróxido de sodioSigmaS2770Para medios HASM
Lector de placas Spectrmax M5Dispositivos Moleculares Trichostatina
ATCI AmericaT2477Reactivo
Tripsina EDTAGibco25200-056Reactivo
Montana de 700511

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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