La eficacia y los mecanismos de vía subyacentes del tratamiento con ShiDuGao para el eczema del ano basados en conjuntos de datos GEO y farmacología de red

El eccema anal es una afección alérgica de la piel que afecta a la región perianal y a la mucosa, presentando diversas manifestaciones clínicas¹. Los síntomas característicos incluyen eritema anal, pápulas, ampollas, erosión, exudados y costras. Estos síntomas surgen principalmente debido al rascado, engrosamiento y aspereza del área afectada².

El eccema anal, caracterizado por una duración prolongada de la enfermedad, ataques recurrentes y tratamientos difíciles, puede tener efectos adversos en la salud física y mental de los pacientes³. La patogenia del eccema anal aún no está clara, y la medicina moderna sugiere que puede estar relacionado con lesiones anales locales, dieta, medio ambiente, genética y otros factores⁴. Además de evitar el contacto con irritantes y posibles alérgenos, el tratamiento del eczema anal se centra principalmente en métodos como la inhibición de la inflamación, la antialergia y el alivio del picor⁵.

SDG se ha utilizado ampliamente para el tratamiento del eccema anal y otras afecciones anales. SDG regula la exudación anal de la piel, reduce la humedad, repara la piel anal y aborda eficazmente el prurito ^6,7,8. Además, el SDG tiene el potencial de regular la microbiota del periano, mejorando así el eczema del ano ^9,10.

La farmacología en red, un enfoque bioinformático novedoso e interdisciplinario de vanguardia en el ámbito de la inteligencia artificial y el big data, proporciona una exploración en profundidad de la medicina tradicional china. Esta disciplina enfatiza la exposición sistémica de las reglas de correlación molecular entre medicamentos y enfermedades desde una perspectiva de red ecológica. Se ha adoptado ampliamente para varios aspectos, incluida la identificación de ingredientes activos clave en extractos de hierbas, el desciframiento de sus mecanismos de acción globales, la formulación de combinaciones de medicamentos y el estudio de la compatibilidad de prescripción. Las prescripciones tradicionales chinas exhiben los atributos de multicomponente y multiobjetivo, lo que significa su adaptabilidad sustancial al ámbito de la farmacología de red. Impulsados por esta metodología, han surgido nuevas perspectivas en el examen de sistemas complejos de medicina tradicional china, proporcionando un sólido apoyo técnico para la racionalización de las aplicaciones clínicas y la innovación de medicamentos 11,12,13,14.

Este estudio tiene como objetivo explorar el mecanismo de efectividad de los ODS en el tratamiento del eccema anal. Este esfuerzo de investigación buscó dilucidar el mecanismo de administración tópica de medicamentos utilizando una integración sinérgica de la farmacología de red y los conjuntos de datos GEO. Los hallazgos proporcionan información valiosa sobre la eficacia y los mecanismos subyacentes de los ODS en el tratamiento del eccema anono, lo que indica su potencial como un enfoque terapéutico eficaz para esta afección. El diagrama de flujo de trabajo detallado del estudio se presenta en la Figura 1.

Este estudio no se refiere a la aprobación ética y el consentimiento para participar. Los datos utilizados en este estudio se obtuvieron de bases de datos de genes.

1. Predicción de dianas de enfermedades

1. Acceda a la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org) y a la base de datos en línea sobre la herencia mendeliana en el hombre (OMIM, https://www.omim.org), utilizando "eczema ano" como término de búsqueda para objetivos de enfermedades.
2. Descargue las hojas de cálculo de los objetivos de la enfermedad. Elimine los objetivos repetidos para obtener los objetivos de eczema del ano.

2. Selección de componentes activos

1. Busque la palabra clave "índigo natural, ciprés dorado, yeso calcinado, calamina y agalla china" en la base de datos de farmacología del sistema de Medicina Tradicional China (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) para obtener la lista de los ingredientes activos candidatos y las metas de los ODS.
2. Confíe el componente a la base de datos suiza ADME (http://www.swissadme.ch/index.php), extrayendo los detalles de aquellos que presentan una absorción de IG "alta", junto con al menos dos valores de DL "Sí" como elementos activos.
   NOTA: Normalmente, solo se incluyen como ingredientes activos los ingredientes con valores similares a medicamentos (DL) ≥0.18 en la base de datos.

3. Construcción de la red de IBP y cribado de las proteínas centrales

1. En Venny2.1( https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html), introduzca los objetivos de los ODS y el eczema del ano en LIST1 y LIST2, respectivamente. Se genera instantáneamente una representación visual de la intersección. Haga clic en el área compartida para mostrar los objetivos comunes en la sección Resultados .
2. Acceda a la base de datos STRING (https://string-db.org/). Introduzca los destinos en el campo Lista de nombres . A continuación, seleccione Homo sapiens como organismo y proceda con la búsqueda > continuar.
3. Cuando los resultados estén disponibles, abra Configuración avanzada y seleccione la opción ocultar nodos desconectados en la red. En la puntuación mínima requerida de interacción, establezca la confianza más alta (0,900) y, a continuación, haga clic en Actualizar.
4. Haga clic en Exportaciones para descargar el texto de la red de interacción proteína-proteína (PPI) en formato .png y .tsv.

4. Construcción de una red fármaco-componente-enfermedad-diana

1. Abra Cytoscape 3.9.1 e importe el archivo .tsv mencionado en el paso 3.4. Haga clic en la barra de estilo en el panel de control para optimizar el color, la fuente y el lado de los nodos de red.
2. Para el análisis de la topología de red, emplee la función Analizar red . Para obtener genes hub, use CytoHubba en el software Cytoscape. Establecer la red fármaco-componente-enfermedad-diana.

5. Análisis de enriquecimiento de GO y KEGG

1. Acceda al sitio web de Metascape (https://metascape.org/). Seleccione un archivo o pegue una lista de genes en el cuadro de diálogo y haga clic en el botón Enviar . A continuación, seleccione H. sapiens tanto en Entrada como especie como en Análisis como especie; después de eso, habilite la función Análisis personalizado .
2. En la opción de enriquecimiento, seleccione Funciones moleculares GO, Procesos biológicos GO, Componentes celulares GO y la base de datos KEGG Pathway. Marque Seleccionar clústeres selectivos de GO y, a continuación, haga clic en el botón Análisis de enriquecimiento . Una vez completada la barra de progreso, inicie un clic en la página del informe de análisis para recuperar los resultados del enriquecimiento.

6. Análisis del conjunto de datos de chips genéticos GEO

1. Busque y analice el conjunto de datos de chips genéticos GEO (GDS3806) utilizando la herramienta GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) para investigar la expresión de genes centrales en diferentes grupos de datos (grupo de control-dermatitis no atópica; grupo experimental-dermatitis atópica).
2. Ingrese al sitio web de la base de datos GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Ingrese la palabra clave o GEO Accession, y haga clic en el botón Buscar . Seleccione el mejor resultado coincidente. Busque la serie de referencia (GSE26952).
3. Ingrese al sitio web de la herramienta GEO2R (https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/), ingrese la serie de referencia en el cuadro de acceso GEO y haga clic en el botón Establecer . Seleccione Dermatitis atópica como grupo experimental, seleccione Control no atópico como grupo de control y haga clic en el botón Analizar . Una vez completado el cálculo, aparecerá el resultado.

7. Acoplamiento molecular

1. Abra la base de datos TCMSP y descargue la estructura 3D de los ingredientes seleccionados. Utilice el cuadro de búsqueda Nombre químico y busque los nombres de los ingredientes seleccionados para descargar los archivos de estructura 3D correspondientes en formato mol2.
2. Abra la base de datos de proteínas RCSB (http://www.pdb.org/) y descargue las estructuras cristalinas de las dianas clave. En el cuadro de búsqueda, busque los nombres de destino y descargue los archivos de estructura cristalina correspondientes en formato pdb.
3. Importe los ingredientes y los archivos de estructura de destino en el software de análisis. Elimine las moléculas de agua haciendo clic en Editar > Eliminar agua. Agregue hidrógenos haciendo clic en Editar > Hidrógenos > Agregar. Establezca los ingredientes como ligando, seleccione objetivos completos como receptor y realice un acoplamiento ciego.
4. Determinar el rango de acoplamiento molecular.
   1. Seleccione el receptor y el ligando en secuencia. Haga clic en Cuadrícula > Cuadro de cuadrícula para ajustar el cuadro de cuadrícula para incluir todo el modelo. Haga clic en Archivo > Cerrar guardando corriente para guardar el estado del cuadro de cuadrícula. Guarde los archivos en formato gpf.
   2. Haga clic en Ejecutar > Ejecutar Autogrid4 > Nombre de archivo de parámetro > Examinar, seleccione el archivo gpf y, a continuación, haga clic en el botón Iniciar .
5. Utilice AutoDock 4 para realizar el acoplamiento molecular.
   1. Haga clic en Acoplamiento > macromolécula > Establecer nombre de archivo rígido para seleccionar el receptor. Haga clic en Acoplamiento > ligando > Abrir/ Elija seleccionar el ligando.
   2. Haga clic en Acoplamiento > Parámetros de búsqueda para establecer los algoritmos de operación y Acoplamiento > Parámetros de acoplamiento para establecer los parámetros de acoplamiento. Seleccione el archivo dpf y, a continuación, haga clic en el botón Iniciar. Guarde los archivos en formato dpf.
   3. Haga clic en Analizar > acoplamiento > Abrir, seleccione el archivo dlg, haga clic en Analizar > macromolécula para abrir el receptor, haga clic en Analizar conformaciones > > reproducir, clasificadas por energía para analizar los resultados. Haga clic en Establecer Reproducir > Escribir complejo para guardar los resultados en formato pdbqt.
6. Importe los archivos de acoplamiento en el software PyMOL para construir una mayor visualización.
   1. Seleccione el ligando y haga clic en Acción > Buscar contactos polares > > a otros átomos en el objeto para mostrar los enlaces de hidrógeno entre los ligandos y el entorno externo. Haga clic en c para cambiar el color.
   2. Haga clic en Acción > Extraer objeto. Haga clic en Mostrar > palos para mostrar la estructura del palo del receptor. Identifique los residuos conectados a los ligandos y muestre la estructura del palo.
   3. Haga clic en Ocultar > palos para ocultar la estructura del palo del receptor. Haga clic en Asistente > medición y haga clic en dos átomos en secuencia. Haga clic en Etiquetar > residuo para mostrar la etiqueta de los residuos. Ajuste el color de fondo y la transparencia si es necesario. Haga clic en Archivo > Exportar imagen como para guardar la imagen.

Genes relacionados con el eccema ano, genes diana de los ODS y dianas comunes
Un total de 958 posibles candidatos genéticos fueron seleccionados en Genecards y 634 en las bases de datos OMIM, mientras que los duplicados fueron excluidos. Para obtener una comprensión completa de los genes relacionados con el eccema anal, se fusionaron los hallazgos de múltiples bases de datos, lo que produjo un total de 958 genes distintos. En consecuencia, se formuló meticulosamente una red de interacción proteína-proteína (IBP) específica para el eccema anal. SDG se compone de cinco medicinas tradicionales chinas, a saber, índigo natural, ciprés dorado, yeso calcinado, calamina y agalla china15,16. El componente principal del yeso calcinado es el sulfato de calcio anhidro (CaSO4), mientras que el componente principal de la calamina es el carbonato de zinc (ZnCO3). El índigo naturalis, el ciprés dorado y la hiel china tienen ingredientes complejos. A partir de la base de datos TCMSP, los fármacos contienen 92 componentes compuestos, obteniéndose un total de 867 dianas farmacológicas fiables (Tabla 1).

A través de la superposición de ambos conjuntos de datos de genes diana, se identificaron un total de 149 genes diana que concurren con frecuencia (Figura 2A), seguidos de la construcción de una red esencial de interacción proteína-proteína diana (PPI) (Figura 2B). A través de un método de cribado basado en la mediana para el grado, la cercanía y la intermediación, se seleccionaron 59 dianas clave como posibles dianas farmacológicas para el eccema anal. La mediana de las puntuaciones de grado, cercanía e intermediación para los objetivos clave fueron 49, 40,31947 y 0,522, respectivamente. Los 10 genes principales con una puntuación de grado alta incluyeron AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS y PTGS2 (Tabla 2). Estos genes son muy relevantes para el eczema anal.

Vías y redes que implican objetivos comunes
Se utilizaron los métodos de enriquecimiento KEGG y GO para analizar 59 objetivos clave, revelando 218 vías asociadas y más de 3000 procesos biológicos asociados. El análisis descubrió vías que se correlacionan fuertemente con las proteínas SDG y del eccema anal, incluida la infección por el virus Cherry simplex 1, la shigelosis, la vía de señalización del TNF, la resistencia al inhibidor de la tirosina quinasa EGFR, la infección por citomegalovirus humano y la vía de señalización del receptor de células T (Figura 3A). Estas vías se relacionan principalmente con genes como AKT1, TNF, TP53, STAT3, SRC, EGFR y CASP3. La Figura 3B proporciona una descripción detallada de los genes diana y las vías. El análisis de GO se realizó en procesos biológicos (PA), composición celular (CC) y función molecular (MF) (Figura 4A). Los resultados sugieren que este estudio se centra principalmente en las dianas comunes para los ODS y el eczema anal en los procesos biológicos, con algunas relevantes para el CC y la MF. Las funciones biológicas que fueron particularmente relevantes incluyen la fosforilación de peptidil-tirosina, la modificación de peptidil-tirosina, la regulación de la adhesión célula-célula, la regulación positiva de la adhesión celular, la activación de células T, la regulación de la adhesión célula-célula leucocitaria (Figura 4B-D).

Predicción de la unión de los componentes activos de los ODS a las dianas del eccema del ano
Sobre la base de los valores medios de grado, cercanía e intermediación, se examinaron 59 objetivos clave, incluidos AKT1, TNF, TP53, EGFR, STAT3, SRC, JUN, CASP3, HRAS y PTGS2. Un análisis más detallado de la base de datos GEO reveló una regulación positiva de PPARG, EGFR y TNF, mientras que PTPRC, MMP9, MAPK14 y CASP3 se regularon a la baja en el grupo experimental (dermatitis atópica) (Figura 5). A través del análisis del enriquecimiento de la vía génica común, se determinó que estos genes participaban predominantemente en la cascada de señalización del TNF y en la vía de señalización del MAPK. En la vía de señalización del TNF, la expresión del TNF se reguló al alza, mientras que la expresión de MMP9, MAPK14 y CASP3 se reguló a la baja. En la vía de señalización de MAPK, la expresión de EGFR y TNF se reguló al alza, mientras que MAPK14 y CASP3 se regularon a la baja (Figura 6). Sobre la base de estos hallazgos, se consideraron TNF, MAPK14 y CASP3 como posibles dianas en la terapia de los ODS.

Para validar las dianas candidatas en los componentes activos de los ODS, se utilizó el análisis de acoplamiento para comprobar la precisión entre la estructura del componente activo y las posibles proteínas diana. Estas proteínas diana están implicadas en varias conexiones funcionales y son los ganglios superiores de la red, lo que sugiere que desempeñan un papel crucial en la respuesta de los ODS al eccema anal. El valor negativo de la energía de enlace de acoplamiento indica la capacidad de SDG para acoplarse con los objetivos de la enfermedad in vivo, y un valor más negativo indica un acoplamiento más fácil. En esta investigación, se logró el acoplamiento molecular exitoso de los componentes activos centrales con el objetivo clave, y la energía de unión de acoplamiento fue negativa, con valores inferiores a -1 kcal/mol. El índigo y la berberrubina tienen una buena actividad de unión, con una energía de unión inferior a -5 kcal/mol (Tabla 3, Figura 7). En conjunto, estos resultados proporcionan más pruebas de que estas proteínas correspondientes a los loci de los genes pueden actuar como dianas de los ODS en el eccema del ano.

Figura 1: Flujo de trabajo de análisis de farmacología de red. GO, Ontología Genética; KEGG, Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; TCMSP, Base de Datos y Análisis de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China; GEO, Ómnibus de Expresión Génica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama de Venn y red PPI de los objetivos comunes. (A) Diagrama de Venn de la intersección de la diana del fármaco y la diana de la enfermedad. (B) Red PPI de destino común por STRING. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG. (A) Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG. Las 10 principales vías KEGG se clasifican de acuerdo con los valores P en orden ascendente. (B) La conexión entre la vía y el objetivo: vía (amarillo), dianas (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de enriquecimiento de GO. (A) Resultados de GO de tres ontologías. (B) Gráfico de burbujas del proceso biológico (BP). (C) Gráfico de burbujas del componente de la celda (CC). (D) Gráfico de burbujas de función molecular (MF). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Predicción del resultado de los objetivos potenciales. (A) Mapa de calor de la expresión génica hub en la base de datos GEO, el grupo A es el grupo experimental (dermatitis atópica) y el grupo B es el grupo control (dermatitis no atópica); (B) Los nodos de la red PPI representan las proteínas, el borde representa las relaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: La vía de señalización. (A) Vía de señalización MAPK. (B) Vía de señalización del TNF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Acoplamiento molecular de genes e ingredientes centrales. El magenta representa los componentes centrales de los ODS, y el azul representa los residuos de los genes centrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Principios activos en los ODS.

Tabla 2: Características de los 10 genes principales del hub.

Tabla 3: La energía de unión de acoplamiento molecular de los ingredientes y los genes centrales.

Los autores no tienen nada que revelar.