Artículo de método

Una tarea de memoria de trabajo espacial apetitiva para ratones en un laberinto radial semiautomatizado de 8 brazos, que reduce la asociación de memoria temerosa en el laberinto

DOI:

10.3791/66456

⸱

29 de julio de 2025

 ,  ,  , 
1The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College London, 2Gerald Choa Neuroscience Institute, The Chinese University of Hong Kong

En este artículo

Resumen

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La mayoría de los experimentos de comportamiento para roedores se diseñaron originalmente para ratas. Debido a las diferencias de comportamiento entre ratas y ratones, a veces se requieren modificaciones para los ratones. Presentamos un método para probar la memoria de trabajo espacial en ratones, minimizando el estrés durante la tarea de memoria de trabajo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este documento de método detalla un protocolo para probar la memoria de trabajo espacial en ratones utilizando un laberinto radial semiautomatizado de 8 brazos (RAM). El RAM es un aparato parcialmente cerrado con 8 brazos horizontales igualmente espaciados que irradian desde un eje central, desde el cual el acceso a cada brazo se puede controlar individualmente mediante puertas motorizadas servocontroladas. Los animales comienzan en el eje central y se les permite explorar el laberinto para obtener una recompensa de comida al final de cada brazo o brazo seleccionado. La tarea RAM se diseñó originalmente para ratas, pero hemos adaptado el protocolo para ratones, por ejemplo, al incluir más pasos de habituación. En nuestro protocolo, todos los brazos se ceban inicialmente con leche condensada azucarada, y los ratones se admiten secuencialmente en cuatro brazos seleccionados pseudoaleatoriamente para recoger las recompensas ("carrera forzada") antes de abrir todas las puertas juntas para permitir que los ratones corran libremente y encuentren las cuatro recompensas restantes ("carrera libre"). Se introduce un retraso de 5 s entre las ejecuciones forzadas y libres para desafiar la memoria de trabajo; Se registra un error si el mouse ingresa a cualquier brazo visitado anteriormente durante la ejecución libre. La tarea se completa cuando se recuperan todas las recompensas. Después de 6 días de habituación y 9 días de entrenamiento en laberintos, los ratones machos C57BL / 6 logran regularmente ≥ puntuación de tasa de éxito diaria del 80%, definida como 4 / (4 + E), donde E es el número de errores. Esta tarea semiautomatizada podría, en principio, combinarse con métodos de monitorización in vivo como la electrofisiología, la microscopía de fotones múltiples o la obtención de imágenes de calcio.

Introducción

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La memoria de trabajo1 es un proceso cognitivo que puede contener una cantidad limitada de información durante un período corto mientras se manipula y utiliza en la planificación y ejecución de una tarea mental, como memorizar un número de teléfono o una ruta para un destino desde una ubicación diferente. Está estrechamente relacionado con la inteligencia fluida, que es la capacidad de razonar rápidamente y pensar de forma abstracta. Se cree que el entrenamiento de la memoria de trabajo puede mejorar la inteligencia fluida2. La memoria de trabajo, por lo tanto, es crucial para los estudios de investigación.

Los experimentos de comportamiento más populares para roedores se diseñaron originalmente para ratas en la década de 1980, y los investigadores de hoy a menudo aplican esos protocolos a ratones. Sin embargo, existen diferencias de comportamiento consistentes entre ratas y ratones 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Especialmente, el manejo del miedo es un factor importante que puede afectar los resultados de los experimentos, ya que los ratones son más propensos al estrés en comparación con las ratas 3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Por lo tanto, es importante considerar las diferencias al aplicar esos protocolos a ratones. En nuestro protocolo, tratamos de minimizar los factores de estrés durante la tarea de memoria de trabajo en el laberinto del brazo radial. Esto se hizo cronometrando cuidadosamente los cierres de las puertas utilizando el software de seguimiento del mouse y control de laberintos. Además, se evitó la captura de ratones al final de la sesión en el eje central. Este enfoque permitió a los ratones elegir su próximo brazo sin asociar la ubicación con el miedo a ser atrapados. Retrasar la captura de los ratones hasta después de que se hubieran recogido todas las recompensas en el laberinto aseguró que la última recompensa no estuviera vinculada a la experiencia de ser atrapado.

El laberinto de brazo radial terrestre (RAM) es un aparato popular y de uso común para evaluar el aprendizaje y la memoria espacial y no espacial, y para probar la memoria de trabajo y de referencia en roedores. Es uno de los aparatos más populares para el aprendizaje espacial y la memoria en ratones 20,21,22. RAM aprovecha la tendencia natural de los roedores a explorar el laberinto, encontrar novedades y aprender información espacial a base de prueba y error, además de buscar comida. Esta tendencia se puede aumentar restringiendo su dieta y recompensándolos con la comida preferida en el laberinto. Hoy en día, se utilizan varias variantes del aparato RAM, por ejemplo, con 6, 8, 12 o 16 brazos y un aparato parcialmente cerrado o abierto/elevado 23,24,25. La mayoría de los protocolos actuales se basan en el de Olton et al.20,26, pero utilizan laberintos más simples (6 u 8 brazos) 9,24,27,28,29. Probar la memoria de trabajo en un laberinto de brazos radiales (6 u 8 brazos) es más poderoso que el laberinto T (2 brazos) porque los animales tienen más opciones de brazos para explorar.

La RAM original fue diseñada por Olton y Samuelson20 para evaluar el aprendizaje espacial y la memoria en ratas utilizando cebos de comida para el refuerzo positivo, a diferencia de los laberintos acuáticos como el laberinto acuático de Morris y el laberinto acuático radial de 8 brazos que utilizan refuerzo negativo, es decir, inmersión en agua 20,30,31,32. Olton y Samuelson20descubrieron que las ratas tienen excelentes recuerdos de los lugares a medida que pasan por la RAM. Demostraron que el hipocampo está involucrado en el procesamiento de información espacial. Por lo tanto, introdujeron el concepto de un sistema de memoria dual, que comprende memoria de trabajo y de referencia, en roedores. Este sistema de memoria dual había sido sugerido previamente por Honig36 basado en experimentos con palomas. Olton et al. encontraron que la función del hipocampo es esencial para la memoria de trabajo. Esto se logró haciendo lesiones en el área entorrinal, el cuerpo de la fimbria-fórnix, anterior al hipocampo, el tabique o el fórnix postcomisural para interrumpir cada una de las principales conexiones de fibras extrínsecas de la formación del hipocampo 26,33,34,35. Las lesiones de fórnix-fimbria no afectaron la memoria de referencia26.

En los protocolos modernos, los animales se habitúan al medio ambiente permitiéndoles explorar el laberinto libremente durante 10-15 minutos por día durante 3 días consecutivos, seguido de un entrenamiento de laberinto durante 1-3 semanas con un alimento preferido al final de todos los brazos o brazos seleccionados fijos, probando la memoria de trabajo o la memoria de trabajo y la memoria de referencia en el mismo experimento. respectivamente 9,29,37.

A menudo, estos protocolos no se describen completamente y las diferencias de comportamiento entre ratas y ratones no se consideran bien. Aquí presentamos nuestro protocolo y experiencia en detalle, especialmente cómo evitar asociar experiencias de miedo con lugares y momentos basados en las diferencias de manejo del miedo entre ratas y ratones. Este protocolo es para investigadores que desean estudiar la memoria de trabajo espacial y aplicarla a la electrofisiología, las imágenes en tiempo real y la histología con ratones.

Protocolo

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Todos los experimentos con ratones fueron aprobados previamente por el Comité de Ética de la UCL y autorizados bajo la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y la legislación posterior del Gobierno del Reino Unido.

1. Preparación de programas para el control automatizado de laberintos en una aplicación de software

NOTA: Se utilizó el laberinto de brazo radial automatizado, como se muestra en la Figura 1A-C, y el diseño de la sala en la Figura 1D.

  1. Prepare un flujo de trabajo experimental para el cierre de puertas como se describe en la Figura 2.
  2. Establezca el inicio de la etapa de habituación 1 (Figura 2A) en una aplicación de software. Para hacerlo, siga los pasos a continuación.
    1. Establezca el inicio de la prueba y las grabaciones de video, y cierre todos los brazos del software. 5 s después de que el software reconozca el mouse en el eje central del laberinto, comienza a rastrear y abre todas las puertas.
    2. Cuando el ratón entre en un brazo y esté a 4 cm de la puerta más cercana de las puertas del cubo central, cierre todas las puertas. Luego, inmediatamente después de cerrar todas las puertas, abra la puerta del brazo que seleccionó el mouse.
    3. Una vez que el mouse regrese al eje central, cierre la puerta y confínelo al eje central durante 5 s. Repita esto durante 30 min.
    4. Detenga la grabación y el seguimiento de video cuando transcurran 30 minutos y el mouse regrese al concentrador central.
      NOTA: Deje que el ratón explore el laberinto libremente a su voluntad.
  3. Etapa de habituación 2 (Figura 2B)
    1. Configure el inicio de la prueba y la grabación de video en el software asociado y cierre todas las puertas.
    2. 5 s después de que el software reconozca el mouse en el eje central del laberinto, comience su seguimiento y abra todas las puertas.
    3. Finalice la prueba si el ratón entra en cada brazo al menos dos veces o después de 30 minutos y luego regresa al eje central. Deja que el ratón explore el laberinto libremente a su antojo.
  4. Etapa de habituación 3 (Figura 2C)
    NOTA: Esta etapa es la combinación de las etapas 1 y 2.
    1. Configure el software para iniciar la prueba y la grabación de video y cierre todas las puertas.
    2. Configure el software para controlar las puertas del laberinto 5 s después de que el software reconozca el mouse en el concentrador central. Establezca el inicio del seguimiento en este punto y abra todas las puertas.
    3. Cierre todas las puertas cuando el ratón entre en un brazo y esté a 4 cm de la puerta más cercana de las puertas del cubo central. Luego abre la puerta del brazo.
    4. Cierre la puerta cuando el mouse ingrese completamente al eje central y confine el mouse en el eje central durante 3 s. Repita esta secuencia durante 30 minutos o hasta que el ratón entre en cada brazo al menos una vez.
    5. Establezca el final de la prueba después de cumplir la condición y cuando el mouse ingrese completamente al eje central.
      NOTA: Deje que el ratón explore el laberinto libremente a su voluntad.
  5. Tarea de memoria de trabajo (Figura 2D, E)
    1. Configure el software para iniciar la prueba y la grabación, y cierre todas las puertas.
    2. 5 s después de que el software reconozca el ratón en el concentrador central, configure el software para que inicie el seguimiento.
    3. Inicie la fase de ejecución forzada. Presente 4 brazos elegidos pseudo-aleatoriamente uno por uno al ratón.
    4. Cuando el ratón entre en el primer brazo y esté a 3 cm del eje central, asegúrese de que la puerta se cierre y lo confine en el brazo durante 15 s.
    5. Deje que la puerta se abra y deje que el mouse regrese al eje central.
    6. Cierre la puerta y luego abra el segundo brazo.
    7. Repita esto hasta el cuarto brazo.
    8. Cuando el mouse regrese al eje central después del cuarto brazo de la fase de ejecución forzada, confinarlo al eje central durante 5 s.
    9. Deja que se abran todas las puertas y comienza la fase de carrera libre.
    10. Termina la prueba cuando el ratón regrese al eje central después de recoger todas las recompensas/entrar en todos los brazos al menos una vez.

2. Preparación de jaulas caseras para alojamiento individual

  1. Configure nuevas jaulas utilizando materiales de anidamiento estándar para un nuevo experimento.
    1. Coloque ropa de cama nueva, aserrín, un iglú de papel, un túnel de papel, rayas de anidación de papel y un bloque de mordida de madera en jaulas nuevas para cada ratón para el experimento.
    2. Coloque la tolva de alimentos y cierre la tapa.
      NOTA: Los ratones pueden dañar las piezas de ventilación si no tienen la tolva de alimentos.

3. Manejo, pesaje y restricción de la dieta en la sala de almacenamiento de animales (Día -7 al Día 0)

  1. Guíe suavemente al ratón hasta el túnel de papel suministrado en la jaula de la casa.
  2. Levante el ratón de la jaula agrupada usando el túnel de papel 38,39,40 con la mano, manténgalo a la altura del pecho durante varios segundos. Alternativamente, deje que el mouse se suba a la mano voluntariamente.
    NOTA: Manejar animales con un estrés mínimo es esencial para los experimentos de comportamiento. Nunca los levante por la cola, lo cual es estresante para los ratones. Habituar a los ratones al experimentador también es importante. Los ratones necesitan estar bien habituados y relajados, o no aprenderán bien en el laberinto más tarde.
  3. Sostenga siempre el mouse con el mismo método de manejo. Coloque el ratón en la báscula para controlar el peso corporal y registre su peso corporal.
    NOTA: No estrese a los ratones con movimientos corporales rápidos o haciendo ruidos fuertes. Es mejor hacer esto en un ambiente tranquilo. De lo contrario, pueden saltar de la báscula o de la mano del experimentador. Además, si los ratones están estresados, pueden mostrar los ojos entrecerrados, chillar y morder la mano del experimentador41,42.
  4. Después de pesarlo, coloque el ratón en la nueva jaula preparada anteriormente.
  5. Ponga a los ratones a dieta con una cantidad restringida durante una semana antes de la exposición al laberinto del brazo radial. Esto los motiva a buscar en el laberinto las recompensas de comida proporcionadas. La recompensa de comida durante el experimento es leche condensada azucarada diluida.
  6. Coloque 2 ~ 3 g de comida estándar en la jaula y mantenga el peso corporal entre el 85 ~ 90% del peso inicial durante todo el experimento.
    NOTA: Los ratones C57BL/6 comen 3-4 g de comida estándar todos los días43.
  7. Observe la caída del peso corporal durante la noche como guía para estandarizar la cantidad de comida que se le dará al día siguiente. A partir de ese momento, administre una cantidad diaria suficiente de comida estándar para mantener el 85-90% de su peso corporal inicial durante todo el experimento.
    NOTA: Estos animales necesitan perder peso lentamente. Controle su peso corporal y sus expresiones faciales para evitar el estrés.
  8. Proporcionar 1 ml de leche condensada diluida (recompensa; leche condensada azucarada: agua = 1: 1) en un pequeño vaso de plástico en la jaula de la casa para habituar a los ratones hasta el final de la etapa de habituación 1. Asegúrese de que los ratones coman la recompensa. Cambie la comida de recompensa si la cepa de ratones muestra neofobia a la comida presentada.
    NOTA: A partir de la etapa de habituación 2, no proporcione la recompensa en la jaula del hogar. Si el peso corporal de cualquier ratón cae por debajo del 80% del peso inicial, debe ser sacrificado según las pautas específicas de IACUC y de cada país. Si un ratón no está en el rango de peso corporal normal para la línea de ratones que se está utilizando (20-30 g a las 8-12 semanas de edad) en el primer control de peso corporal, no debe considerarse en la cohorte para evitar dificultades para mantener su peso corporal en el rango requerido más adelante.

4. Llevar ratones a la sala de pruebas

  1. Use un carrito para llevar a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento lentamente.
  2. Deje a los ratones tranquilos en el carrito durante 5 minutos.

5. Montaje de la sala

  1. Configure la iluminación de la habitación iluminando el eje central indirectamente, a 80 lux con bombillas de luz blanca cálida, y reproduzca ruido blanco a 70 dB medido en el eje central. NOTA: Se sabe que la exposición al ruido blanco de intensidad moderada hace que las ratas se desempeñen mejor en un laberinto geométricamente complejo44,45. El ruido blanco parece hacer más que simplemente enmascarar el ruido inevitable en el medio ambiente; El ruido blanco de 70 dB aumenta la captación de colina en varias regiones del cerebro de las ratas, incluida la corteza prefrontal, el hipotálamo y el hipocampo (pero no en el cuerpo estriado)46 y se sabe que el rendimiento de la memoria de trabajo RAM depende de la integridad de las vías colinérgicas entre el hipocampo, la corteza frontal y el prosencéfalo32,47. También se sabe que los animales utilizan señales visuales distales y proximales para navegar con precisión en sus entornos. Sin embargo, los ratones dependen de las señales visuales distales más que de las proximales para navegar durante el aprendizaje espacial48. En este experimento, se introdujeron señales proximales impresas en una pequeña hoja de papel en las paredes posteriores de todos los brazos de la RAM de 8 brazos, pero no redujeron el comportamiento de conexión en cadena. Las señales visuales distales geométricamente asimétricas (en el techo y las paredes de la habitación), por otro lado, redujeron la conexión en cadena y fueron esenciales para la navegación espacial en la RAM.

6. Habituación etapa 1 - No recompensado (Día 1 - 2)

NOTA: No se ceban recompensas en el laberinto. Esta etapa es para habituar a los ratones a las puertas del laberinto y sus sonidos.

  1. Inicie el seguimiento del mouse y la grabación de video haciendo clic en el botón Inicio en el software y llevando el mouse al laberinto sin estresarlo. Haga esto moviéndose lentamente y cambiando la altura lentamente mientras el mouse está en la mano del experimentador. Coloque el mouse en el eje central.
    NOTA: Si los ratones tiemblan en la mano del experimentador, reduzca la velocidad de los movimientos. Es una señal de miedo. Los ratones se mueven durante el período de confinamiento de 5 s en el eje central antes de comenzar la fase de ejecución forzada. Pueden mirar hacia cualquier lado cuando se colocan en el eje central.
  2. Siga observando el comportamiento del mouse en el monitor de la PC colocado lejos del laberinto o debajo del nivel de la pared del laberinto. Si el ratón intenta escapar del laberinto trepando por la pared, simplemente levántese de la silla para mostrar la existencia del experimentador y camine hacia ella, monitoreando su desempeño. En el peor de los casos, empuje el mouse hacia el laberinto.
    NOTA: Normalmente, los ratones regresan al laberinto después de escuchar el ruido de fricción de la ropa del experimentador cuando se acercan a él. Esto debe hacerse rápidamente. Si el experimentador continúa haciendo esto, los ratones permanecerán en el laberinto después de las etapas de habituación 1 a 3. Si los ratones siguen saltando fuera del laberinto, es aconsejable eliminarlos de más experimentos y análisis.
  3. Después de la prueba, recoge el ratón de un brazo del laberinto dejando que el ratón se suba voluntariamente a la mano del experimentador mientras la otra mano cubre el brazo para evitar que salte del laberinto.
  4. Cepilla las heces de ratón y limpia el laberinto con un pañuelo seco para eliminar cualquier rastro de las recompensas. Luego, limpie con un pañuelo húmedo y seque el laberinto con un pañuelo seco (aproximadamente 2 minutos).
  5. Haga esto para cada ratón por turno durante dos días.
    NOTA: Después de 30 minutos, es posible que los ratones no hayan visitado los 8 brazos del laberinto. Esto es normal y no es un problema. Los ratones tienden a visitar los brazos en un patrón no sistemático y no secuencial y se mueven con cautela, pasando tiempos desiguales en cada brazo. Los ratones pueden trepar por las paredes del laberinto y/o saltar fuera del laberinto en esta etapa. Si esto sucede (por ejemplo, el ratón intenta trepar por las paredes), prevístelo asegurándote de que el experimentador haga que el ratón sea consciente de su presencia acercándose al laberinto y haciendo algún ruido, como el crujido de la ropa. Por lo tanto, es posible que se requiera una observación cuidadosa del comportamiento del mouse en la RAM y una acción rápida. Después de algunas repeticiones de este procedimiento, los ratones permanecerán en el laberinto. Si, a pesar de todo, el mouse no permanece en la RAM durante la habituación, elimínelo del análisis.

7. Habituación etapa 2 - Recompensado (Día 3 - 4)

NOTA: Esta etapa es para alentar a los ratones a explorar el laberinto libremente para obtener recompensas de comida.

  1. Coloque 70 μL de la recompensa de comida en cada pocillo de comida en cada brazo.
  2. Inicie el seguimiento del mouse y la grabación de video haciendo clic en el botón Inicio en el software y luego colocando el mouse en el concentrador central del laberinto como se explica en 6.1.
  3. Siga observando el comportamiento del mouse en el monitor de la PC desde un lugar distante y anótelo si es necesario, por ejemplo, trepando a la pared o saltando del laberinto. Finalice la prueba cuando el ratón entre en cada brazo al menos dos veces o hayan transcurrido 30 minutos.
  4. Después de la prueba, recoge el ratón del laberinto en un brazo dejando que el ratón se suba voluntariamente a la mano del experimentador mientras la otra mano cubre el brazo para evitar que salte del laberinto.
  5. Limpie el laberinto como se describe en 6.4 (Etapa de habituación 1; aproximadamente 2 min).
  6. Haga esto para cada ratón dos veces al día durante dos días.
    NOTA: En esta etapa, los ratones pueden mostrar un comportamiento de conexión en cadena, pero no es necesario preocuparse porque las entradas adicionales de 4 brazos en la tarea de memoria de trabajo pueden desalentar este movimiento. En este paso, los ratones pueden detenerse en el brazo sin consumir la recompensa. El día 4, los ratones deben estar más entrenados que el día 3, pero aún pueden detenerse en el medio del brazo.

8. Habituación etapa 3 - Recompensado (Día 5 - 6)

NOTA: Esta etapa es para permitir que los ratones se acostumbren al entorno de la combinación de las etapas 1 y 2.

  1. Ceba todos los pozos de comida con 70 μL de la recompensa.
  2. Inicie el seguimiento del mouse y la grabación de video haciendo clic en el botón de inicio del software y colocando el mouse en el eje central del laberinto.
  3. Siga observando el comportamiento del mouse en el monitor de la PC desde un lugar distante, hasta que el mouse ingrese a cada brazo al menos una vez o transcurran 30 minutos. Si el ratón intenta escapar del laberinto, actúe rápido como se indica en la Etapa de habituación 1 (6.2).
  4. Después de la prueba, retire el ratón del laberinto dejándolo trepar voluntariamente a la mano del experimentador mientras la otra mano cubre el brazo para evitar que salte del laberinto.
  5. Limpie el laberinto como se describe en 6.4 (etapa de habituación 1) (aproximadamente 2 min).
  6. Haga esto para cada ratón dos veces al día durante dos días.
    NOTA: En esta etapa, lo mejor es eliminar del análisis a los ratones que intentan escapar del laberinto.

9. Tarea de memoria de trabajo - Recompensado (Día 7 - Día 15)

  1. Cebo todos los brazos con 40 μL de la recompensa. Coloque la recompensa en cada alimento cerca del eje central para dificultar que los ratones vean desde el eje central.
  2. Inicie el seguimiento y la grabación del mouse haciendo clic en el botón de inicio del software y luego coloque el mouse en el eje central del laberinto sin estresarlo.
  3. Durante el confinamiento de 5 s en el eje central, aléjese y siéntese en algún lugar alejado del laberinto. Supervise el comportamiento del ratón y anote la secuencia del brazo que visita el ratón en el laberinto (consulte el archivo complementario 1).
  4. Deje de registrar la secuencia de visita del brazo cuando el mouse recolecte las ocho recompensas de comida, que es el final de la tarea de memoria de trabajo, y luego deje que visite cuatro brazos adicionales.
    NOTA: Al hacer esto, los ratones pueden tener más tiempo antes de ser atrapados, lo que permite que los ratones se concentren en la tarea de memoria de trabajo. Este paso también permite a los ratones reforzar el hecho de que las recompensas no se reponen una vez recolectadas.
  5. Después de las cuatro visitas adicionales del brazo, retire el ratón del laberinto al final de la última visita del brazo dejándolo trepar a la mano mientras cubre el brazo con la otra mano.
    NOTA: Al no atrapar ratones en el eje central, los ratones no asociarán ser atrapados con el eje central, donde los ratones deciden a qué brazo ir a continuación. Una vez que los ratones se familiarizan con la tarea, incluidas las visitas adicionales del brazo, pueden moverse libremente cerca del último pozo de comida o pasar algún tiempo en el eje central. Sin embargo, deben terminar las 4 visitas adicionales del brazo en 3 minutos. Si no lo terminan en 5 minutos, devuélvalos a la jaula de casa.
  6. Seleccione la siguiente jaula para ajustar el nivel de excitación tocando la jaula para la siguiente prueba.
  7. Limpie el laberinto como se describe en 6.4 (etapa de habituación 1) (aproximadamente 2 min).
  8. Pase al siguiente mouse y repita esto 6 veces para cada mouse a su vez durante 9 días.
    NOTA: La duración promedio de las cuatro visitas adicionales del brazo debería ser más larga en ensayos posteriores, ya que los ratones aprenden a reconocer cuándo no hay más recompensas disponibles o que no hay nuevos brazos no visitados para ingresar.

10. Puntuación

  1. Calcule la "puntuación de la tasa de éxito diaria" (%) = 4 (goles) / (número total de entradas del brazo [4 + errores]) x 100.
    NOTA: Después de la carrera forzada, solo cuatro brazos se llenan con la recompensa, las metas. Si ingresan un brazo que el mouse visitó en la ejecución forzada, cuéntelo como un error, así como los brazos repetidos en la ejecución libre.
  2. Calcule la "puntuación de la proporción de ensayos perfectos" (%) en 6 ensayos = [(número de ensayos perfectos) / 6 ] x 100
    NOTA: Una puntuación perfecta significa que no hay error en la memoria de trabajo.
  3. Seleccione la velocidad, la distancia y la aceleración del mouse en el software para el análisis y calcule los promedios de cada día. Asegúrese de excluir las cuatro visitas adicionales del brazo de estos análisis. Además, mida la duración de las cuatro visitas adicionales del brazo revisando los videos de seguimiento del mouse después del experimento.
    NOTA: Los ratones pueden hacer giros rápidos inmediatamente después de entrar en un brazo. No cuente y califique esto como una entrada, ya que es una corrección rápida de errores, lo que significa que la memoria de trabajo es válida49. Sin embargo, si el mouse cruza el punto medio del brazo o permanece en el brazo durante más de 3 s, cuente y marque la entrada. Las puntuaciones de las tasas de éxito diarias indican las curvas de aprendizaje de los ratones, y las puntuaciones de la proporción de prueba perfecta indican la eficiencia de retención de la memoria de trabajo.

11. Estadísticas

  1. Si estudia la diferencia entre la línea de control y una línea de ratón knockout, como se hizo en la publicación anterior50, realice las estadísticas como se describe a continuación.
    1. Compare los datos resultantes de los grupos de control y experimentales utilizando ANOVA bidireccional de medidas repetidas con un análisis post hoc (por ejemplo, prueba de Bonferroni) [midiendo cada sujeto en 9 puntos de tiempo diferentes].
    2. Si compara grupos, pruebe al menos 10 y preferiblemente ~ 20 ratones en cada grupo. Cuando el efecto de la manipulación genética, la creación de lesiones o el tratamiento farmacológico es obvio, los tamaños de muestra pueden ser más pequeños para concluir.

Resultados

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Este protocolo se utilizó en nuestra publicación anterior, donde preguntamos si los nuevos oligodendrocitos y las vainas de mielina son necesarios para el rendimiento de la tarea de memoria de trabajo espacial utilizando ratones MyRF cKO y el control50. Descubrimos que el rendimiento de la tarea de memoria de trabajo mejoró en los ratones de control, pero no en los ratones MyRF cKO. La tarea de memoria de trabajo estimuló y promovió la proliferación y diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y la mielinización de oligodendrocitos (OL) en las áreas cerebrales relacionadas con el procesamiento de la memoria de trabajo en ratones de tipo salvaje. También realizamos la tarea de alternancia recompensada T-maze para evaluar la memoria de trabajo espacial. Esta tarea se realizó para detectar la deficiencia de memoria de trabajo en ratones MyRF cKO. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el análisis histológico entre el grupo de ratones que tuvo la tarea de alternancia recompensada con el laberinto en T y el grupo de control de jaula domiciliaria. Por lo tanto, concluimos que el protocolo presentado aquí es más efectivo que la tarea de alternancia recompensada por T-maze para estudiar la memoria de trabajo.

Cada ratón tuvo 6 pruebas de la tarea de memoria de trabajo por día que duraron una hora en total. Por lo tanto, este protocolo permitió un máximo de 8 ratones en una cohorte. En los primeros días de la habituación, los ratones pasaban un tiempo desigual en los brazos del laberinto y sus movimientos eran lentos. Permanecieron al final de los brazos durante mucho tiempo. Hasta el final del día 5 de la habituación en el laberinto, pasaron tiempos variables en los brazos del laberinto y pudieron regresar al eje central sin tocar las recompensas (Figura 3A). Sin embargo, en el sexto día, los animales entraron en cada brazo al menos una vez en 8-15 minutos, pasaron un período similar en cada brazo, lo que indicó que los animales estaban habituados al laberinto y estaban listos para la tarea (Figura 3A, fila inferior del día 6 y Figura 3B).

Durante las etapas de habituación, a menudo se paraban sobre sus extremidades traseras y miraban hacia arriba desde los brazos o el eje central. Se observó un comportamiento similar durante la tarea de memoria de trabajo, pero no necesariamente giraron en la misma dirección (p. ej., 2 -> 3-> 5 -> 8 [en el sentido de las agujas del reloj] u 8 -> 5 -> 3 ->2 [en el sentido contrario a las agujas del reloj]). Podrían cambiar su dirección (p. ej., 5 -> 4 -> 6 -> 1). Los ratones individuales no tenían una tendencia comunitaria aparente a elegir la secuencia del brazo. Los ratones tienden a pasar un poco más de tiempo seleccionando el último brazo recompensado que el primer brazo recompensado en la carrera libre. Esto probablemente se debió a que tenían cuatro opciones para elegir en la primera opción en la carrera libre, y solo una opción para la última recompensa. El primer brazo en la fase de carrera forzada se presentó a ratones al menos 50 (15 + 15 + 15 + 5) s antes del inicio de la carrera libre. Por lo tanto, esta tarea de memoria de trabajo no era muy fácil de realizar sin errores de memoria de trabajo. El video complementario 1 muestra a un ratón sometido a una prueba perfecta en el día 8 del entrenamiento de tareas de memoria de trabajo.

Usando cualquiera de los dos sistemas de puntuación, encontramos que su rendimiento fue casi plano durante los primeros 3 días del período de prueba de RAM de 9 días, pero mejoró notablemente después de eso (Figura 4A, B). Después de 6 días de habituación y 9 días de entrenamiento en laberintos, los ratones machos C57BL / 6 lograron regularmente ≥ puntaje de tasa de éxito diario del 80 % desde el día 8, definido como 4 / (4 + E), donde E es el número de errores. La distancia promedio recorrida en las carreras libres se acortó con el tiempo, pero la velocidad promedio y la aceleración fueron bastante constantes de un día a otro (Figura 4C-F). Los ratones podrían haber desarrollado un recuerdo de miedo de ser atrapados durante las cuatro visitas adicionales al brazo, lo que podría ser una de las razones por las que los ratones pasaron más tiempo hacia el final del experimento (Figura 4G).

En este protocolo, los pasos de habituación duraron 6 días, lo que podría llevar a ajustar el reloj biológico para el experimento, incluso si el ciclo de luz / oscuridad no se invirtió en una instalación de animales.

figure-results-1
Figura 1: Especificaciones y características de RAM. (A) Vistas del laberinto desde el CCD montado en el techo y desde el costado, y las dimensiones. (B) El pozo de comida se hundió 1,5 cm por debajo del nivel del piso del laberinto para que los ratones no puedan ver el contenido a >10 cm de distancia. (C) Escenario de arena de laberinto. Se muestran el buje central y el brazo 1-8. (D) Esquema de la sala experimental y las señales visuales externas con una fotografía de la sala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Diagramas de flujo de los programas de control del laberinto. (A) Etapa de habituación 1 (días 1 y 2). (B) Etapa de habituación 2 (días 3 y 4). (C) Etapa de habituación 3 (días 5 y 6). (D) Tarea de memoria de trabajo (días 7-15). (E) Esquema del paradigma de tareas de memoria de trabajo. Los ratones pasaron por los cuatro brazos de carrera forzada elegidos pseudo-al azar, fueron confinados en el eje central durante 5 s y luego salieron a correr libremente para recoger las recompensas restantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Mapas de calor y mapas de nidos de aves durante la habituación de 6 días. (A) Mapas de calor de las trayectorias de los ratones durante los días de habituación 1-6, para tres ratones. Para los días de habituación 3-6, los ratones se sometieron a dos ensayos por día; Los mapas de calor superiores muestran las primeras pruebas y las inferiores muestran las segundas pruebas. (B) Mapas de nidos de aves para el día de habituación 6. Los tres superiores muestran los primeros ensayos y los tres inferiores muestran los segundos ensayos de los ratones 1, 2 y 3. La tabla inferior enumera la duración de los ensayos para los mismos tres ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: La tarea de memoria de trabajo RAM. (A) Puntuaciones promedio de la tasa de éxito diaria (%) calculadas por [4/(número de entradas de brazos durante la carrera libre) x 100]. Se promediaron los puntajes de 6 ensayos para el día. (B) Puntajes de prueba perfectos durante los 9 días de la tarea. (C) Distancias individuales recorridas y el promedio. (D) Velocidades de carrera individuales de los ratones en la tarea y el promedio. (E) Aceleraciones individuales de los ratones y el promedio. (F) Desaceleraciones individuales de los ratones y el promedio. (G) Duración individual y promedio de las 4 visitas adicionales de brazos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo complementario 1: El ratón se somete a una prueba perfecta el día 8 del entrenamiento de tareas de memoria de trabajo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Ejemplo de hoja de registro. Anote la secuencia de las visitas del brazo mientras observa el comportamiento del ratón. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Entrenamiento y prueba de la memoria de trabajo en la RAM
La memoria de trabajo es un proceso cognitivo que puede contener una cantidad limitada de información durante un corto tiempo mientras se manipula y utiliza en la planificación y ejecución de una tarea mental. Los ejemplos incluyen memorizar el código de entrada de una puerta en una ubicación remota o memorizar la ruta a un destino específico. La tarea dual N-back y la tarea de lapso espacial son tareas de memoria de trabajo visuoespacial de uso común en las que se les pide a los sujetos humanos que memoricen la ubicación, la identidad y el orden temporal de los estímulos. Takeuchi et al. encontraron que la cantidad de entrenamiento en tareas exitosas de memoria de trabajo en humanos, que incluyen la tarea dual N-back, se correlaciona con el aumento de la anisotropía fraccional en la parte anterior del cuerpo del cuerpo calloso en su estudio utilizando MRI51. En nuestro estudio anterior50, utilizando el protocolo descrito en este artículo, encontramos que los oligodendrocitos mielinizantes aumentaron en el cuerpo calloso anterior y otras áreas del cerebro que se cree que están involucradas en el procesamiento de la memoria de trabajo, incluida la corteza cingulada anterior, que se cree que está involucrada en la atención. El aumento de oligodendrocitos se correlaciona estrechamente con el rendimiento de sus tareas de memoria de trabajo, lo que es consistente con el estudio en humanos de Takeuchi et al 50,51,52. Sin embargo, todavía es necesario estudiar si existen similitudes en los procesos psicológicos entre humanos y ratones (por ejemplo, electrofisiología). La memoria de trabajo está estrechamente relacionada con la atención. Se correlaciona con las medidas de "inteligencia fluida" en los humanos y es importante para el aprendizaje, por lo que es importante estudiarlo. Olton y Samuelson describieron una tarea de laberinto radial (RAM) de 8 brazos para entrenar y evaluar la memoria espacial en ratas20. En el experimento de libre elección, proporcionaron a todos los brazos del laberinto 0,1 g de comida para ratas, que no se repuso durante la prueba. Entonces, solo se obtuvieron ocho recompensas en una prueba. Todos los brazos estaban abiertos y las ratas tenían acceso inmediato a todos los brazos durante el experimento. Dado que las recompensas de comida no se reponían, las ratas tenían que usar la memoria de trabajo para evitar volver a visitar los brazos visitados anteriormente, con el fin de recuperar tantas recompensas como fuera posible antes del final de la tarea. Cada rata se colocó en el eje central al principio y se le permitió ingresar a cualquier brazo a voluntad, para recuperar la recompensa de comida hasta que se hicieran 16 elecciones de brazo o transcurrieran 10 minutos. Olton et al. contaron el número de brazos distintos que visitaron las ratas dentro de las primeras 8 opciones y encontraron que todas las ratas eligieron un promedio de más de 7 brazos distintos dentro de los 10 días20. Probamos un protocolo similar con ratones y descubrimos que los ratones, a diferencia de las ratas, mostraron conexión en cadena durante unos días y no cambiaron su estrategia después, lo que eludió el propósito de evaluar su memoria de trabajo. Por lo tanto, el ratón estaba confinado en el eje central entre las visitas del brazo, con la esperanza de que el confinamiento en el eje central evitara el comportamiento de conexión en cadena.

Olton et al. confinaron ratas en el eje central durante 1 minuto o 15 s para interferir con cualquier secuencia de elecciones. Esto les impidió adoptar su tendencia habitual a progresar alrededor del laberinto continuamente, en el sentido de las agujas del reloj o en sentido contrario a las agujas del reloj20,53. Si la elección de cualquier brazo es aleatoria, igualmente probable y completamente independiente de las elecciones anteriores, el experimento es un ejemplo del clásico 'problema de ocupación'20, por lo que las probabilidades p (n, 8) de seleccionar n brazos distintos dentro de las primeras ocho visitas sucesivas del brazo son: p (1,8) = 4.8x10-7, p (2,8) = 4.2x10-4, p (3,8) = 0.019, p(4,8)=0,17, p(5,8)=0,42, p(6,8)=0,32, p(7,8)=0,067, p(8,8)=0,0024. A partir de estas probabilidades, se puede calcular que la probabilidad media de elegir brazos distintos es 5,3 (valor esperado = figure-discussion-1 = 5,25; 5,3/8= 66%) sobre 8. Olton et al. informaron que, durante un período de entrenamiento de 10 días, las ratas ingresaron en promedio 5.7 / 8 brazos distintos (71%; rango: 4.2-6.6) durante los días 1-5, aumentando a 7.6 / 8 brazos distintos (95%; rango: 7.2-8.0) durante los días 6-1020, que es significativamente más alto que el azar. Esto indicó que las ratas usaban la memoria de trabajo para evitar los brazos sin alimentos. Probamos un enfoque similar con ratones, confinándolos en el eje central durante 5 s entre visitas de brazos. Los ratones ingresaron un promedio de 5.7 / 8 brazos diferentes por prueba de 8 brazos durante los días 1-5 (71%; rango: 5.2-5.8; once ratones C57BL / 6) y 5.9 / 8 brazos durante los días 6-10 (74%; rango: 5.7-6.5; once ratones C57BL / 6). Por lo tanto, los ratones no pudieron aprender, o aprendieron muy lentamente, para mejorar su rendimiento en la búsqueda de recompensas significativamente por encima de los niveles de probabilidad durante los 10 días del experimento. Por lo tanto, los protocolos anteriores se consideraron inadecuados para ratones, optando en su lugar por un paradigma de "carrera forzada / carrera libre", similar al descrito para ratas por Sasaki et al.27

En el protocolo de Sasaki et al.27, todos los brazos fueron cebados al comienzo del experimento, las recompensas no se repusieron y cada rata se limitó inicialmente al eje central de una RAM elevada abierta de 8 brazos. Luego se liberaron en cada uno de los 4 brazos preseleccionados, un brazo a la vez, sin confinarlos en los brazos y el eje central entre las visitas del brazo (la 'carrera forzada'). Después de la visita del4º brazo, la rata regresaría al eje central, y todas las puertas se abrieron inmediatamente para permitir que la rata visitara todos y cada uno de los brazos a voluntad (la 'carrera libre'). Para recolectar todas las recompensas de comida restantes de la manera más eficiente durante la carrera libre, los animales deben recordar y evitar cualquier arma que ya hayan visitado en las carreras forzadas o libres. Utilizamos un enfoque muy similar (Figura 2E) con ratones. Diez minutos de períodos de habituación al comienzo del entrenamiento de RAM de cada día en Sasaki et al.27 fueron reemplazados por un solo período de habituación de 6 días antes del entrenamiento. Otra modificación realizada fue permitir que los ratones hicieran cuatro visitas adicionales al brazo al final de cada ensayo una vez que se hubieran recuperado todas las recompensas. Esto tenía la intención de reforzar el hecho de que las recompensas no se reponen en las armas visitadas anteriormente. Además, dado que los ratones aprenden a "evitar el arrepentimiento"54,55, podría desalentar el comportamiento de conexión en cadena en el siguiente ensayo, porque dicho comportamiento no sería recompensado durante las cuatro visitas adicionales del brazo inmediatamente antes de comenzar el ensayo posterior. Otra razón para las cuatro visitas adicionales de los brazos fue evitar que los ratones asociaran una recuperación exitosa de todas las recompensas con la experiencia posiblemente temerosa de ser atrapados por el experimentador al final de la tarea. Los ratones podrían haber desarrollado una memoria de miedo cuando fueron atrapados durante las cuatro visitas adicionales del brazo, lo que podría ser una de las razones por las que pasaron más tiempo hacia el final del experimento (Figura 4G). De hecho, los ratones rompieron el comportamiento de conexión en cadena durante las visitas adicionales de cuatro brazos, si lo hicieron en el ensayo. Además, los ratones fueron confinados en cada brazo durante 15 s durante la carrera forzada y luego en el eje central durante 5 s antes de abrir todas las puertas para comenzar la carrera libre. Sin confinar el mouse en el eje central, los ratones tendían a ir en cadena como se describió anteriormente.

Para la ejecución forzada, seleccionamos de un conjunto de cinco secuencias pseudoaleatorias de 4 brazos que contienen 3 o menos brazos adyacentes. Estos fueron (1,3,5,7), (2,4,5,8), (1,4,5,7), (2,3,4,7), (1,2,5,6), y sus variaciones de diferentes órdenes y rotaciones de brazos, numerando los brazos del 1 al 8 en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior (Figura 1C). Cada ratón de una cohorte se sometió a seis ensayos (un ensayo = carrera forzada + confinamiento de 5 s en el eje central + carrera libre) por día durante la etapa posterior a la habituación de 9 días de la prueba de RAM. Durante la carrera libre, si un ratón hacía solo cuatro visitas de brazo para recuperar las cuatro recompensas restantes después de la carrera forzada, se denominaba una "prueba perfecta". Su rendimiento durante los 9 días de entrenamiento se cuantificó mediante la "puntuación de la tasa de éxito diaria", calculada como 4/(4+E), donde E es el número de errores durante la carrera libre o la proporción de ensayos que fueron "ensayos perfectos" (es decir, E = 0). Por ejemplo, si un ratón necesitara 7 visitas de brazo para recuperar las 4 recompensas restantes durante la carrera libre, entonces la "puntuación de la tasa de éxito diaria" sería 4/7 = 0,57 o 57% y una prueba perfecta obtendría una puntuación del 100% en esta escala; Si un ratón hiciera 5 pruebas perfectas en el día, la puntuación de la proporción de prueba perfecta sería 5/6 = 83,3 %.

Los puntajes de la tasa de éxito diaria logrados por la conexión en cadena se calcularon manualmente para cada uno de los patrones de carrera forzada de 4 brazos que se emplearon (párrafo anterior), asumiendo que los ratones comienzan su carrera libre al azar en cualquiera de los 8 brazos de la RAM. La puntuación promedio en muchos ensayos que se puede lograr mediante la conexión en cadena está entre el 53% y el 56% para los patrones individuales de brazos forzados, o ~55% en los patrones generales de los brazos. La probabilidad de obtener una puntuación perfecta (100%) mediante la conexión en cadena es cero, y la de las visitas aleatorias al brazo es del <1% (4/8 x 3/7 x 2/7 x 1/7 = 0,87%), suponiendo que los ratones nunca regresen al brazo del que acaban de salir. Por lo tanto, las puntuaciones promedio de la tasa de éxito diaria (>80%) y el porcentaje de puntajes de prueba perfectos (>60%) alcanzados por nuestros ratones en los últimos 2 días del período de prueba de 9 días (Figura 4A, B) solo se pudieron lograr de manera consistente utilizando una estrategia basada en la memoria de trabajo.

Los ratones que estaban familiarizados con la tarea tendían a merodear en el último pozo de comida, o en el eje central, una vez que habían consumido todas las recompensas, y también tendían a pasar más tiempo en las visitas adicionales de cuatro brazos al final de la tarea (Figura 4G), lo que sugiere que habían aprendido la "regla" de que cada brazo contenía una y solo una recompensa. y también que podían hacer un seguimiento del hecho de que habían visitado todas las armas disponibles. Para ratones con un fondo genético diferente al utilizado aquí (C57BL / 6), los resultados pueden variar porque el fondo genético es importante en los experimentos de comportamiento 56,57,58. Sin embargo, en nuestro estudio anterior50, utilizando ratones con un fondo mixto C57BL / 6, CBA, 129P2 pero retrocruzado con ratones C57BL / 6J, se encontró que el rendimiento de sus tareas de memoria de trabajo mejoró enormemente utilizando el protocolo descrito aquí, con menos ratones que recurrieron a la conexión en cadena durante la ejecución libre. Koike et al.59 informaron que las 129 subcepas endogámicas de ratón portan un polimorfismo de deleción Disc-1 que consiste en una deleción de 25 pb en el exón 6 de Disc-1 que causa un cambio de marco y truncamiento de la proteína DISC-1, afectando su funcionalidad60,61. Esta mutación causó deterioro de la memoria de trabajo cuando se estudió con la tarea de alternancia retardada T-maze59, otra tarea de laberinto de cambio de victoria motivada de forma apetitiva, lo que posiblemente explica por qué los ratones de control utilizados en nuestro estudio anterior50 tenían puntuaciones de memoria de trabajo ligeramente más bajas que los ratones endogámicos C57BL / 6. Siempre utilizamos ratones que se encuentran dentro del rango de peso corporal normal para su edad y cepa para evitar dificultades para mantener su peso entre el 85% y el 90%. El tamaño de la camada podría influir en la memoria espacial y el comportamiento similar a la ansiedad debido a la sobrealimentación temprana en una cepa llamada NMRI62. El tamaño pequeño de la camada causa sobrealimentación y aumento de peso corporal en las cepas de ratones NMRI y C57BL / 6. Sin embargo, las dos cepas resolvieron las tareas de aprendizaje espacial de manera diferente. Mientras que los ratones C57BL / 6 no mostraron diferencias entre el tamaño de la camada pequeña y el de control, los ratones NMRI mostraron un deterioro significativo en la fase de aprendizaje con la prueba del laberinto de agua de Morris (MWM) y un ligero deterioro con la tarea de alternancia espontánea del laberinto en Y, aunque no fue significativo. Además, el tamaño pequeño de la camada disminuyó significativamente los niveles de proteínas del factor neurotrófico derivado del cerebro del hipocampo (BDNF) y aumentó el contenido de proteínas de la interleucina-1b del hipocampo (IL-1b) después de las pruebas MWM y Y-maze en la cepa NMRI. Sin embargo, estos cambios no se observaron en la cepa C57BL/6. La cepa NMRI de ratones exhibió un aumento significativo en los comportamientos similares a la ansiedad y los niveles de corticosterona inducidos por el estrés cuando se criaron en camadas pequeñas. Por el contrario, los tamaños de camada pequeños para la cepa C57BL / 6 condujeron a una reducción tanto en los comportamientos similares a la ansiedad como en los niveles de corticosterona. Por lo tanto, es importante tener en cuenta el tamaño de la camada de la cepa de ratón al diseñar experimentos de comportamiento.

Diferencias de comportamiento entre ratas y ratones
La mayoría de las tareas cognitivas fueron diseñadas originalmente para ratas. Además, el aprendizaje / memoria espacial se ha estudiado ampliamente en ratas. Debido a la ventaja de las tecnologías transgénicas y de modificación del genoma actuales para ratones, los investigadores a menudo aplican protocolos diseñados para ratas a ratones. Sin embargo, existen diferencias de comportamiento consistentes entre ratas y ratones 3,4,5,6,7. Por ejemplo, tienen diferencias de preferencia (preferencia social de las ratas y preferencia alimentaria de los ratones)3 y utilizan diferentes estrategias para negociar diferentes tareas de laberinto (laberintos de agua o tierra)4. Además, los ratones tienden a tardar más tiempo en lograr buenos puntajes de aprendizaje espacialen RAM 4,8,9 de 8 brazos, que es una de las razones por las que los ratones generalmente se consideran inferiores a las ratas en tareas de aprendizaje espacial.

Las ratas y los ratones también difieren en el comportamiento/carácter general, incluidas sus respuestas al estrés o al manejo del miedo 3,4,5,6,7,10. Por ejemplo, estudios anteriores encontraron un aprendizaje deficiente de extinción del miedo en ratones adolescentes 11,12,13,14, pero no en ratas 15,16,17,18. Además, los ratones son más propensos al estrés y no les gusta que los manipulen en comparación con las ratas, que, cuando están familiarizadas con el manejo, aparentemente disfrutan de que el adiestrador les haga cosquillas y tratan de interactuar con los manipuladores para obtener más cosquillas19. Por lo tanto, el manejo del miedo es un factor importante a considerar al estudiar el comportamiento del ratón. Además, Borrow et al.63 han informado que el estrés variable crónico disminuye el ARNm de oxitocina y aumenta el volumen somático de las neuronas de oxitocina en el núcleo paraventricular. Además, estudios recientes han demostrado que el manejo de túneles puede reducir el estrés y mejorar el rendimiento en experimentos de comportamiento 38,39,40. Por lo tanto, es importante evitar estresar a los ratones durante o antes de los experimentos de comportamiento.

A los ratones no les gusta estar expuestos al aire libre, por ejemplo, en la prueba de campo abierto o en el laberinto elevado plus, prefiriendo lugares más cerrados y oscuros64,65. En el contexto de la RAM, el eje central es el espacio más abierto, y es a partir de ahí que los ratones deciden qué brazo visitar a continuación. Si están ansiosos en el eje central, es posible que se distraigan de la tarea y se desempeñen por debajo de la media. Por esta razón, decidimos atrapar ratones en uno de los brazos radiales (ver parte del procedimiento), no en el eje central, para que no asocien el centro con una experiencia temerosa.

Al explorar la RAM de 8 brazos en busca de recompensas de comida, las ratas que emergen de un brazo determinado tienden a girar en ángulo recto para su próxima visita al brazo, saltándose el brazo intermedio, y rara vez visitan los brazos secuencialmente (lo que llamamos "conexión en cadena"); es decir, las ratas tienden a visitar en el orden 1,3,5,7 no 1,2,3,4 20,53,66. Por el contrario, los ratones a menudo adoptan una estrategia de conexión en cadena, posiblemente debido al tamaño de su cuerpo y flexibilidad. La estrategia de conexión en cadena es una forma bastante rentable para que los ratones recuperen las recompensas de comida, pero es un inconveniente considerable para el experimentador que intenta probar la memoria de trabajo espacial porque elude el propósito del experimento67. Sin embargo, la exposición al estrés puede afectar la capacidad de aprendizaje y cambiar la estrategia de aprendizaje68. Dado que el enfoque de conexión en cadena puede indicar estrés, es importante asegurarse de que los ratones permanezcan sin estrés. Describimos nuestro protocolo actual como libre de estrés para los ratones durante la tarea de memoria de trabajo porque los ratones no utilizan la estrategia de conexión en cadena.

Se sabe que los ratones confían más en las señales visuales distales que en las señales visuales proximales cuando navegan por el laberinto 48,69,70. Encontramos que la incorporación de señales visuales proximales adicionales que se imprimieron en trozos de papel y se colocaron en las paredes posteriores de todos los brazos no redujo dicho comportamiento, lo que es consistente con la afirmación de Olton et al. para ratas20. Sin embargo, colocar balizas en los brazos de la portería como una señal intramaze ayudó a los ratones más que las señales extramaze a resolver la tarea de la memoria de referencia del laberinto radial de 6 brazos y las pruebas de memoria de trabajo en un experimento71. Además, diferentes cepas de ratones muestran diferentes habilidades visuales72, pero su capacidad de aprendizaje visuoespacial y su memoria probada en el laberinto de Barnes no reflejaron necesariamente su capacidad visual, lo que sugiere que los ratones con habilidades visuales deficientes, como BALB / c, pueden depender de diferentes procesos cerebrales. Por lo tanto, los experimentadores deben considerar qué señales quieren usar para adaptarse mejor a sus experimentos.

Reducir la ansiedad en ratones durante el manejo
Se sabe que el estrés de manejo influye en los animales fisiológica y conductualmente 73,74,75,76,77. Además, Sandi et al demostraron que el deterioro de la memoria espacial causado por el estrés agudo se asocia con una disminución de la expresión de la molécula de adhesión de células neuronales (NCAM) en el hipocampo y la corteza prefrontal al probar ratas en una tarea de laberinto de agua dependiente del hipocampo utilizando una gata como factor estresante entre la última prueba de aprendizaje y la prueba de la sonda78, lo que sugiere que el hipocampo y la corteza prefrontal son vulnerables a altos niveles de estrés. Por lo tanto, es importante reducir el estrés / ansiedad en animales de experimentación para evitar variaciones inexplicables dentro y entre estudios en animales. Especialmente, las tareas de memoria de trabajo requieren que los animales se concentren durante la tarea, por lo que se deben evitar distracciones innecesarias. Los protocolos publicados para probar la memoria de trabajo en ratas, o la memoria de trabajo y la memoria de referencia juntas, a menudo no incluyen detalles importantes como cómo, cuándo y de dónde los experimentadores retiran a los animales del laberinto al final de la tarea. Dado que los ratones son menos sociales que las ratas con el manipulador y son más propensos al estrés, tales detalles son más importantes para los experimentos con ratones. Los roedores pueden desarrollar memoria episódica, que es una forma de memoria explícita a largo plazo que incluye memoria de tiempos, lugares y emociones asociadas 79,80,81. Por lo tanto, elegimos no eliminar a los ratones del laberinto inmediatamente después de que hubieran recolectado todas las recompensas de comida en la RAM, sino que les permitimos hacer cuatro visitas posteriores al brazo sin obtener recompensas de comida. Esto se hizo para evitar que los ratones asociaran la recuperación exitosa de todas las recompensas con la experiencia posiblemente temerosa de ser atrapados por el experimentador, lo cual es importante, especialmente para la etapa temprana de aprendizaje en la RAM. Además, las cuatro visitas adicionales a los brazos sin recompensa pueden reforzar el hecho de que las recompensas de alimentos no se reponen en los brazos que los ratones han visitado anteriormente. Si el manejo no es demasiado estresante para los ratones, interactúan con el experimentador con más frecuencia38. Para evitar el estrés, levante al ratón de su jaula de origen al comienzo del experimento de RAM usando un tubo de papel en la jaula de origen suministrado cuando se separaron de la jaula agrupada para el experimento38, o bien permita que el ratón se suba a la mano del experimentador voluntariamente, cuando lo manipule en su jaula de origen antes del experimento y cuando lo lleve de su jaula de origen al laberinto. Cuando recupere a los ratones del laberinto al final de un experimento, no los persiga en el laberinto, sino que bloquee la entrada del brazo del laberinto con una mano y deje que los ratones se suban a él voluntariamente, mientras cubre el brazo del laberinto con la otra mano para evitar que el ratón salte fuera del laberinto. Esto reduce el estrés de ser perseguido en el laberinto o atrapado por la cola. Los experimentadores masculinos a veces inducen más estrés que las experimentadoras femeninas, en lo que respecta a los ratones82. Sin embargo, al prestar atención a los pasos para reducir el estrés descritos aquí, se descubrió que los experimentadores masculinos podían realizar las pruebas de RAM sin mayores problemas. Por lo tanto, la forma de manejar ratones es más importante.

Diferencias de sexo
Solo se utilizan ratones machos en los experimentos informados aquí debido a los diversos impactos del sexo en la cognición, el aprendizaje y la memoria observados en diferentes especies (roedores y humanos), y porque las respuestas de afrontamiento del estrés difieren entre machos y hembras 63,83,84,85,86,87 . Sin embargo, al interpretar los resultados obtenidos con roedores para los posibles beneficios para los humanos, es importante estudiar ambos sexos. Las pautas de los NIH y otros consejos de financiamiento también sugieren usar animales machos y hembras.

Ventajas del protocolo
Nuestro laberinto radial semiautomático de 8 brazos es un laberinto cerrado con paredes acrílicas blancas opacas pero sin tapas (consulte la Figura 1A para conocer las dimensiones). Mientras navegan por el laberinto, los ratones no pueden ver al experimentador, lo que puede ser una distracción en laberintos con paredes transparentes o brazos abiertos y elevados, pero pueden ver señales visuales distales del extralaberinto sobre el laberinto (ver Figura 1). Además, este protocolo es, en principio, aplicable a imágenes in vivo en tiempo real y electrofisiología porque no hay cableado sobre el laberinto y los ratones pueden aprender la tarea de manera eficiente.

Direcciones futuras
El protocolo actual tiene una duración de 15 días desde la habituación hasta el final de la tarea de memoria de trabajo. Realizamos el protocolo sin descansos los fines de semana; Sin embargo, tener un descanso de fin de semana después de la habituación de 6 días no debería afectar significativamente la siguiente tarea de memoria de trabajo de 9 días. Tomar un descanso de fin de semana durante la tarea de memoria de trabajo de 9 días puede ralentizar el aprendizaje en ratones. Por lo tanto, tener dos experimentadores que estén bien entrenados en el manejo de ratones podría ayudar a reducir el estrés de los experimentadores sin ralentizar el aprendizaje de los ratones. Según la Figura 4A, B, los primeros tres días son cruciales, ya que los ratones logran más de una prueba perfecta en promedio después del cuarto día. Por lo tanto, es recomendable evitar descansos durante los tres primeros días. Si la tarea de memoria de trabajo es demasiado fácil para los ratones de su interés, podría ser necesario aumentar el tiempo de confinamiento después de las ejecuciones forzadas. Estos deben ajustarse para casos individuales.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

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Agradecemos a nuestros colegas del Instituto Wolfson de Investigación Biomédica por sus útiles discusiones y a David Bannerman (Universidad de Oxford) por sus consejos sobre el comportamiento de los ratones y por revisar un primer borrador del artículo. También agradecemos a Matthew Grist por su apoyo técnico y administrativo. Esta investigación fue financiada por Wellcome Trust [108726/Z/15/Z y 214286/Z/18/Z] y el Instituto de Neurociencia Gerald Choa [PJ8425013].

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinzas o alicates para arteriasCualquieraN/APara cortar el chow estándar
C57BL/6J ratonesJackson laboratorio0006642~3 meses
Leche condensada (clavel)NestléN/AUtilizado como recompensa en la tarea
Agua destiladaCualquierN/APara la limpieza y diluyente de la leche condensada
EthovisionXT13 NoldusN /A Controle las puertas del laberinto y el mouse de seguimiento
--Módulo de puntos de cuerpo múltipleNoldusN/APara seguimiento de puntos de cuerpo múltiple
--Prueba y Módulo de control de hardwareNoldusN/Apara prueba y Control de hardware
: caja de E/SNoldusN/AControla las puertas del laberinto
Señales visuales de extramazeCualquieraN/APara mapear el laberinto con ratones
Cámara de alta resoluciónTracksysN/APara el seguimiento y la filmación del ratón
PincelCualquieraN/APara limpiar
el túnel de papelCualquieraN/APara manipular ratones
Iglú de papelCualquieraN/APara anidar
Rayas de papel anidadoCualquierN/APara anidar
Pipetteman P1000 GilsonF144059MPara proporcionar leche condensada diluida a la jaula doméstica Punta de
pipeta P1000CualquieraCualquiera Pipetteman
P200GilsonF144058MPara cebar el laberinto
Punta de pipeta P200Cualquiera
de brazo radialTracksysN/Ahechas a medida
CualquieraN/APara incluso Iluminación en el laberinto
Vaso de plástico pequeñoCualquieraN/APara proporcionar leche condensada diluida a la jaula de la casa
Altavoces para ruido blancoCualquieraN/APara reproducir ruido blanco
Chow estándarCualquieraN/APara papel de seda de restricción dietética
CualquieraN/APara limpiar
Lente verifocalTracksysN/A5-50 mm, enfoque manual, iris manual
Bloque de mordida de maderaCualquieraN/APara anidar
tubo de centrífuga de 50 mlFalconFalcon™ 352070Para mezclar la leche condensada con agua destilada (1:1)
Laberinto Lámparas de habitación

Referencias

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