Artículo de método

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

9 de febrero de 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

En este artículo

Resumen

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

Resumen

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme (DNM) para la detección de secuencias de ADN y ARN (analitos) son estructuras multifuncionales hechas de oligonucleótidos. Sus funciones incluyen la unión estrecha del analito, el reconocimiento altamente selectivo del analito, la amplificación de la señal fluorescente mediante múltiples escisiones catalíticas de un sustrato indicador fluorogénico y la atracción del sustrato fluorogénico para aumentar la respuesta del sensor. Las unidades funcionales están unidas a un andamiaje común de ADN para su acción cooperativa. Los DNM 10-23 de escisión de ARN presentan una sensibilidad mejorada en comparación con las sondas de hibridación no catalítica. La estabilidad del DNM y el aumento de las posibilidades de reconocimiento del sustrato son proporcionados por un fragmento de ADN de doble cadena, un mosaico. DNM puede diferenciar dos analitos con una sola diferencia de nucleótido en un ARN plegado y un ADN bicatenario y detectar analitos en concentraciones ~ 1000 veces más bajas que otras sondas de hibridación sin proteínas. Este artículo presenta el concepto detrás del potencial de diagnóstico de la actividad de las nanomáquinas de ADN y describe el diseño, el ensamblaje y la aplicación de DNM en ensayos de detección de ácidos nucleicos.

Introducción

Uno de los primeros métodos para la detección de ácidos nucleicos es la unión complementaria de oligonucleótidos selectivos a las secuencias de ARN o ADN analizadas. Este método emplea fragmentos de ácido nucleico (sondas) que pueden formar pares de bases de Watson-Crick con un analito de ADN o ARN1 específico. A continuación, el complejo se diferencia del analito y de la sonda no unida mediante una variedad de técnicas. Ciertos métodos, como el Northern blot, la hibridación in situ o qPCR, se basan en el fenómeno de la unión complementaria2. Las sondas de hibridación más comunes tienen dos inconvenientes significativos: baja sensibilidad (pueden alcanzar niveles de micromolar a nanomolar) y baja selectividad a variaciones de un solo nucleótido (SNV), incluidas las mutaciones puntuales. El problema requiere un enfoque sofisticado, ya que las soluciones a estos inconvenientes entran en conflicto entre sí3. Para proporcionar la mejor selectividad, el oligonucleótido de detección debe ser lo suficientemente corto como para formar híbridos inestables con analitos no coincidentes. Estos oligonucleótidos cortos no son capaces de unirse firmemente a los ácidos nucleicos específicos y desenrollar sus estructuras secundarias, por lo que a menudo no proporcionan una señal detectable. Es especialmente difícil detectar fragmentos ricos en CG en el ARN biológico o ADN bicatenario (dsDNA). Por otro lado, las sondas largas son insensibles a SNV3. Para romper el punto muerto, se ha desarrollado el concepto de una sonda binaria4.

Los sensores binarios dividen una sola sonda de detección en dos partes y especializan sus fragmentos, manteniendo uno de ellos largo para desenrollar las horquillas o invadir el dsDNA. El segundo fragmento de sonda binaria sigue siendo corto para ser sensible a una base no coincidente, lo que proporciona un medio para detectar SNV. La señal se producirá si las dos partes del sensor binario están unidas4. El complejo completo se puede visualizar a través de FRET5, sonda de baliza molecular 6,7 o G-quadruplex con actividad similar a la peroxidasa 8,9,10, o bien mediante escisión de ARN 11,12,13 DNAzyme. Los sensores binarios con un núcleo DNAzyme 10-23 han sido ampliamente descritos. Se han adaptado para detectar fragmentos de ácido nucleico monocatenario creados sintéticamente11, o productos de amplificación monocatenario 14,15. La detección sin amplificación también es posible, por ejemplo, en el caso del ARNr 16S extraído de un cultivo celular, ya que esta molécula es abundante en las células12,16. Los sensores binarios con un núcleo DNAzyme 10-23 también se pueden adaptar para la detección de ácidos no nucleicos, como para los iones de plomo17. Sin embargo, la baja sensibilidad sigue considerándose uno de los principales inconvenientes de los sensores binarios 10-23 DNAzyme, y se han desarrollado varios enfoques, como las cascadas18 o los métodos alternativos de mejora de la señal19, para abordar este problema. Desafortunadamente, las técnicas anteriores aumentan drásticamente el costo y la inestabilidad de los componentes del sensor, por lo que no se han puesto en práctica.

El experimento descrito en este trabajo utiliza 10-23 nanosensores de ADN basados en DNAzyme, denominados nanomáquinas de ADN (DNM)20,21. Estas estructuras incluyen sensores binarios y también (1) facilitadores de ADN que flanquean la sonda binaria, desenrollando las regiones estructuradas e invadiendo ADN bicatenario, y (2) una baldosa de ADN que mantiene todas las partes del DNM juntas en estrecha proximidad y aumenta las posibilidades de formación de señales (Figura 1). En conjunto, los DNMs basados en DNAzyme 10-23 disminuyen el límite de detección (LOD) hasta el rango picomolar21; pueden utilizarse para detectar 16rRNA en lisados celulares22 o informar de la presencia de ARN viral sin amplificación 23,24. Al mismo tiempo, los DNMs siguen siendo sensibles al SNV e incluso pueden ser utilizados para genotipar alelos en organismos heterocigotos25. El método DNM se puede utilizar como una técnica complementaria a cualquier tipo de amplificación para la visualización del producto o la identificación del producto en una mezcla compleja con alta selectividad. Los DNM, a diferencia de las sondas convencionales TaqMan y de baliza, no requieren el calentamiento de la muestra y, por lo tanto, se pueden utilizar en protocolos de detección de punto final, lo que hace que la detección general sea rentable.

Este artículo describe el desarrollo in silico de un DNM y demuestra los procedimientos para el ensamblaje y la caracterización funcional del DNM. El trabajo se realizó utilizando un fragmento sintético del virus de Epstein-Barr (VEB) correspondiente a las posiciones 13972-14154 del ADN viral (OR652423.1) (ver Tabla de materiales).

Protocolo

1. Diseño DNM

  1. Seleccione una región única dentro del genoma de interés.
    NOTA: Este trabajo utiliza una región del genoma del virus de Epstein-Barr (VEB) en las posiciones 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Cree un conjunto de cebadores para la amplificación del fragmento seleccionado, por ejemplo, a través de la herramienta Primer3 incrustada en Ugene26.
  3. Abra la herramienta web UNAFold27 (ver Tabla de Materiales) e inserte la región seleccionada. Cambie la temperatura de plegamiento a 55 °C y las condiciones iónicas a 250 mM de iones monovalentes y 200 mM de Mg2+.
    1. Abra la estructura secundaria resultante del fragmento de ssDNA y seleccione una horquilla estable. Localice el sitio de unión de las nanomáquinas de ADN en las regiones no estructuradas o, alternativamente, en los bucles de las estructuras de horquilla para lograr una unión más fuerte del objetivo.
  4. Si el sitio del analito objetivo está plegado en una estructura de bucle de tallo, coloque el brazo 1 y 2 de la siguiente manera: Asegúrese de que el brazo 2 se una a un lado del tallo, el bucle, y 3-5 nt del segundo lado del tallo; El brazo 1 une un fragmento del segundo lado del tallo.
  5. Abra la herramienta DinaMelt28 (ver Tabla de Materiales) y analice las secuencias de los brazos y sus secuencias de complemento inverso. Utilice la herramienta DinaMelt para asegurarse de que la Tm de los brazos 2 y 3 esté por encima de 65 °C: al menos 10 °C por encima de la temperatura del ensayo (55 °C).
    1. Mantener la Tm del brazo 1 al menos 1-3 °C por encima de la temperatura de reacción (55 °C) si se quiere lograr una alta selectividad de reconocimiento29.
  6. Combine las secuencias de los brazos 1 y 2 con las mitades del núcleo de DNAzyme y los fragmentos de unión F-sub13.
  7. Analizar la estructura secundaria de las hebras de ADN diseñadas utilizando UNAFold27.
    NOTA: 55 °C (temperatura de ensayo), 200 mM Mg2+, 250 mM iones monovalentes (HEPES, Na+, K+).
    1. Utilice el diseño solo si el ΔG de plegado es inferior a - 4 kcal/mol. Trate de evitar secuencias largas ricas en CG. Si la estructura secundaria es demasiado estable, introduzca una mutación en el brazo para aumentar el plegamiento ΔG30. Alternativamente, colocar el brazo 3 2-3 nt lejos del brazo 2 es otra estrategia para cambiar la secuencia del brazo 3 para evitar estructuras intermoleculares estables.
  8. Cree una secuencia aleatoria para el fragmento de mosaico de ADN tan larga como el Brazo 3. Combine la secuencia del brazo 3 con la secuencia de mosaicos de ADN a través de (dT)4-6 o etilenglicol (por ejemplo, trietilenglicol (TEG) o hexaetilenglicol (HEG)). La versión DNM presentada en el experimento utiliza (dT)6.
  9. Enlace el brazo 2 con la secuencia complementaria al fragmento de mosaico de ADN seleccionado en el paso 1.8 a través de un enlazador.
  10. Analice la estructura secundaria de las hebras de ADN diseñadas utilizando la aplicación web UNAFold. Asegúrese de que la energía de plegamiento de cada hebra de ADN sea superior a 4 kJ/mol a 55 °C y evite secuencias largas enriquecidas con CG. Preferiblemente, cambie la secuencia de mosaicos de ADN.
  11. Dibuja la estructura utilizando cualquier software de gráficos vectoriales disponible. En este artículo se utilizan Biorender y Pixelmator Pro para la visualización (consulte la tabla de materiales). Verifique la precisión en direcciones de 5'->3' para cada hebra.
    NOTA: Obtenga las secuencias de un proveedor comercial confiable.

2. Prueba de funcionamiento de la DNM

  1. Preparación de tampón y reactivos
    1. Prepare el tampón de reacción compuesto por 50 mM HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM de NaCl, 150 mM de KCl y 200 mM de MgCl2. Llene con el agua desionizada hasta 50 mL.
    2. Prepare 10 μM de alícuotas de oligonucleótidos Dzb-Tile y Tile-Arm3. Prepare una solución de 1 μM de Dza, un subwoofer F de 100 μM y analitos de 1 nM, 10 nM y 100 nM en ARNasa/agua libre o agua desionizada estéril. Los detalles de las secuencias de oligonucleótidos se proporcionan en la Tabla de Materiales.
  2. Ensamblaje DNM
    1. Descongele las soluciones de oligonucleótidos por completo antes de usarlas. Mezcle suavemente dando golpecitos (no haga vórtice intenso). Gire la solución (rápidamente, durante unos segundos) con una microcentrífuga.
    2. Mezcle 1 μM de Dzb-Tile y Tile-Arm3 en 200 μL del tampón de reacción en tubos de microcentrífuga de 0,5 mL.
    3. Mezcle el tubo suavemente y gire la solución.
    4. Envuelva la tapa del tubo cerrado con una película de parafina. Alternativamente, use tubos con tapón de rosca.
    5. Incuba el tubo en un vaso de precipitados de 500 ml con agua hirviendo durante 2 minutos, luego apaga el calentador y deja que la temperatura se enfríe pasivamente durante la noche.
    6. Prepare el 12% de PAGE nativo: Mezcle 1 mL de tampón 10х TBE, 3 mL de 40% AA:BA, agua desionizada hasta 10 mL, 50 μL de APS y 5 μL de TEMED (ver Tabla de Materiales). Pasa la mezcla al casete de gel y deja que se polimerice.
    7. Mezcle 1 μL de cada muestra, es decir, el DNM, el Dzb-Tile y el Tile-arm3 ensamblados, con 1 μL de colorante de carga 4x y cárguelos en el gel.
    8. Coloque el casete en la cámara, llénelo con 1x tampón TBE y deje que el gel funcione durante 90 minutos a 80 V.
    9. Tiñe el gel con bromuro de etidio y visualízalo usando un sistema de documentación en gel (ver Tabla de Materiales).
  3. Ensayo LOD
    1. Prepare 160 μL de F-sub de 200 nM en el tampón de reacción. Esto se hace para evaluar los antecedentes básicos de la estabilidad del sustrato.
    2. Prepare 7 alícuotas de 160 μL de DNM, F-sub y Dza preensamblados a concentraciones de 20 nM de DNM y Dza y 200 nM de F-sub en el tampón de reacción. De los siete tubos, mantenga el tubo # 1 como fondo en blanco para evaluar el ensamblaje espontáneo del núcleo de DNAzyme.
    3. Agregue el analito en los tubos # 2-7 a las concentraciones finales de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM y 1000 pM.
    4. Mezcle suavemente, gire los tubos y clasifique las soluciones en tres porciones de 50 μL en una placa negra de 96 pocillos. Selle la placa con una película ópticamente transparente.
    5. Incubar la placa en un baño de agua a 55 °C durante 1 h. Gira el plato.
    6. Mida la fluorescencia a 525 nm (λex = 495 nm). Calcula la media y la desviación estándar de cada punto.
    7. Calcule la relación entre el blanco y el básico dividiendo la señal del tubo que contiene F-sub y DNM por la señal del tubo que contiene F-sub solamente. Asegúrese de que la relación esté dentro del rango de 1,1 a 1,5.
    8. Calcule la relación señal-blanco dividiendo la señal del tubo que contiene F-sub, DNM y el analito por la señal del tubo que contiene F-sub y DNM solamente. Considere la señal como verdadera positiva si es mayor que el promedio de fondo más tres desviaciones estándar.
    9. Repita el experimento dos veces y asegúrese de que la desviación estándar entre las repeticiones analíticas sea inferior a 0,5.

Resultados

El objetivo del primer experimento fue mostrar el ensamblaje del DNM antes del fragmento sintético del analito. Todos los hilos de DNM constituyentes se añadieron al tampón de reacción y se ensamblaron en el vaso de precipitados. El complejo DNM ensamblado fue evaluado para determinar su tamaño y homogeneidad correctos por PAGE nativo. La página nativa muestra el DNM ensamblado con el analito en el carril 1 y dos hebras de DNM en los carriles 2 y 4. Si la nanomáquina de ADN no estuviera ensamblada, serían visibles 2 o 3 bandas separadas en lugar de una sola banda de baja movilidad (carril 2 en la Figura 2A).

La segunda parte del Protocolo implica la caracterización funcional del rendimiento del DNM y la detección de ácidos nucleicos objetivo. En este estudio se utilizó el fragmento sintético de EBV 13972-14154. Para ello, los fragmentos de los DNMs preensamblados, junto con el Dza, se incubaron con diversas concentraciones del analito durante 1 h a 55 °C. Se midieron dos valores de señal fluorescente de control: el de los fragmentos de DNMs preensamblados y Dzb sin el analito (blanco), y el del fondo de F-sub (básico). Se realizaron tres mediciones técnicas. En cuanto a las estadísticas, también se han realizado tres ensayos independientes. Cabe destacar que la concentración de magnesio en este estudio es superior a lo que se puede encontrar en la literatura30. Los altos niveles de iones de magnesio aumentan la señal en todos los tubos de ensayo, ya que promueven una escisión espontánea de F-sub31. Optimizamos la composición del tampón de reacción durante las etapas preliminares del desarrollo de la tecnología y no repetimos este proceso con cada estudio realizado.

Después de 1 h de incubación, la fluorescencia de la muestra se midió utilizando un espectrofluorómetro (ver Tabla de Materiales). Para confirmar la detección del ADN analizado por el DNM, se comparó la señal fluorescente del sensor ensamblado con el ADN analizado y la del testigo negativo, que no contiene ningún analito añadido. La relación señal/blanco (una relación entre las unidades de fluorescencia relativa media de los pocillos que contienen el analito y los pocillos que no tienen analito) no debe ser inferior a 1,5 para confirmar el éxito de la detección32. La relación entre el blanco y el principio básico (fluorescencia de la respuesta del sensor en ausencia de analito dividida por la del control F-sub solamente) debe estar en el rango de 1,1-1,5; esta relación se puede ajustar cambiando las concentraciones de DNM y Dzb (el rango de concentración típico para cada uno es de 5 a 20 nM). En nuestra práctica, el LOD se cuantifica como la intersección de la línea de tendencia y tres desviaciones estándar por encima del blanco medio (Figura 2B). El DNM es efectivo si el LOD es de <100 pM33. El DNM debe rediseñarse si el LOD es superior a 100 pM.

figure-results-1
Figura 1: Los tres brazos DNM utilizados en este estudio. Tres oligonucleótidos, Dza, Dzb-Tile y Tile-Arm3, están marcados como verde, azul y morado, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Caracterización del DNM. (A) Montaje del DNM mediante electroforesis nativa en gel de poliacrilamida al 12%, 80 V, 1 h, utilizando una escalera de ADN de 50 bp+. B) El límite de detección de ADN sintético después de 60 minutos de incubación a 55 °C. La línea horizontal representa el umbral y la línea vertical es el LOD. Los valores promedio de tres mediciones independientes se presentan con una desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El diseño de máquinas de ADN es sencillo, pero requiere cierta experiencia en el diseño de sondas de hibridación o nanoestructuras funcionales de ADN. Es conveniente mantener el fragmento de analito lo más corto posible para disminuir el número de posibles estructuras secundarias y simplificar la invasión de DNM a la estructura secundaria. El contenido de CG debe ser preferiblemente inferior al 60% para evitar estructuras intramoleculares estables. El ensamblaje exitoso del DNM se logra a velocidades de enfriamiento lentas. En algunos casos, los DNM se pueden ensamblar espontáneamente en el tubo y se puede eliminar el paso de recocido. El montaje de DNM se puede realizar en un termociclador a 0,1-0,3 °C/min o en grandes volúmenes de agua de refrigeración. En el caso de un ensamblaje DNM incorrecto, sugerimos ralentizar el cambio de temperatura durante el paso de recocido.

Para medir el LOD, se necesitan al menos siete puntos de concentración de analito: la concentración de analito de 0 pM, que es F-sub + DNM, y seis concentraciones de analito diferentes, por ejemplo, en el rango de 1 nM a 1 pM para observar la dependencia lineal (Figura 2B). A menudo, se utilizaban más de siete puntos de concentración para una mayor precisión. Para cada punto de concentración se realizarán tres ensayos técnicos (de 50 μl cada uno). Por lo tanto, el volumen total para cada concentración fue de 160 μL (10 μL de exceso, considerando el error de la pipeta).

La técnica DNM presenta una mayor sensibilidad para los SNV que otros sistemas basados en hibridación. La alta selectividad al SNV puede ser relevante para ciertos objetivos, como la identificación de mutaciones puntuales asociadas con el genotipado bacteriano22 o la selección de heterocigotos en plantas25. Los analitos inespecíficos requerirían el mismo procedimiento experimental. Para evitar cualquier incomprensión de SNV a una concentración baja de analito, sugerimos comparar la señal del analito experimental desconocido con la señal de un analito totalmente complementario conocido de la misma concentración.

El método se puede aplicar con éxito a ssDNA, miRNA, ARN plegado o amplicones de dsDNA. Los fragmentos largos de ARN o dsADN, especialmente los ricos en CG, pueden requerir DNM equipado con 4-6 brazos de unión al analito, mientras que dos brazos de unión al analto son suficientes para los analitos monocatenarios con una estructura secundaria inestable (plegamiento de ΔG por encima de -10 kcal/mol). El método se puede aplicar para la detección de amplicones PCR, SDA o LAMP. DNM se puede utilizar para la detección sin amplificación de ARNr en muestras hervidas de cultivo bacteriano sin aislar el ARN total 22,34,35. Es posible que la técnica no funcione bien con concentraciones tan bajas como el nivel femtomolar y con fragmentos de ADNds, cuyo contenido de CG en las regiones flanqueantes es superior al 65%. El contenido de CG se puede estimar, por ejemplo, con la calculadora de contenido de CG de productos biológicos36. Sugerimos agregar partes de gancho37 a los diseños de DNM para aumentar la sensibilidad o transformar el dsDNA en ssDNA en casos de alto contenido de CG. Otra limitación del método es que los DNM son sensibles a la calidad de las muestras, por lo que los ácidos nucleicos se purifican cuidadosamente. Lo mismo se aplica a la calidad de las secuencias de oligonucleótidos de los DNM. Por lo tanto, se sugiere verificar la estabilidad y pureza de cada suministro de oligonucleótidos. En comparación con las técnicas de amplificación convencionales, el diseño de los DNM requiere habilidades y, para la fecha de publicación del artículo, es casi completamente manual. Los DNM necesitan algunas pruebas preliminares en fragmentos sintéticos antes de someterlos a muestras reales de ADN o ARN, lo que aumenta la duración total del desarrollo del sistema de pruebas.

El método es versátil y puede adoptar diferentes tipos de sondas reporteras. Se puede multiplexar38, y la técnica se puede transformar en una versión colorimétrica si el F-sub se reemplaza con un sustrato formador de G-cuádruple39. La presencia de polimerasa se asocia con errores en el crecimiento de la hebra; por lo tanto, este método es ventajoso sobre la PCR convencional en tiempo real y la PCR digital, así como sobre otras técnicas dependientes de nucleasas, como SHERLOCK y DETECTR, debido a la falta de enzimas proteicas perecederas y al procedimiento de detección robusto y sencillo40,41.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Ekaterina V. Nikitina por proporcionar amablemente el ADNg del VEB. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya y Maria S. Rubel agradecen al Ministerio de Educación y Ciencia de la Federación de Rusia (Subvención n.º FSER-2022-0009) y al programa Prioridad 2030.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 1,5 mLBiofil CFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µ L pipetaKirgenKG-Pro1000
10-100 µ L pipetaKirgenKG-Pro100
1-10 µ L pipetaKirgenKG-Pro10
20-200 µ L pipetaKirgenKG-Pro200
2-20 µ Pipeta LKirgenKG-Pro20
4x Tinte de carga de gelEvrogenPB020
Acrilamida 4KAppliChemA1090,0500
Persulfato de amonioCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrilamidaMolekula22797959
Ácido bóricoTechSnabH-0202
Sistema de imagen ChemiDocBioRad12003153
Costar Placa de poliestireno negro de 96 pocillosCorningCOS3915
DinaMeltInstitutohttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Bromuro de etidioBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Cloruro de magnesioAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipeta 10 µ Puntas en LKirgenKG1111-L
pipeta 1000 µ Puntas en LKirgenKG1636
pipeta 200 µ Consejos LKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Cloruro de potasioCarl Roth1782751
PowerPac Basic Fuente de alimentaciónBioRad1645050
Agua libre de ARNasa/ADNasaInvitrogen10977049
Película de sellado para placas de PCRSovtechP-502
Cloruro de sodioVektonHCh (0,1)
microplacas multimodoTecanSpark- 10M
T100 amplificadorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hidroximetil)aminometanoAmrescoAm-O497
UNAFoldInstitutohttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Baño de aguaLOIPLB-140<
strong>Oligos utilizados
Analito: Evrogenorden directo, purificación
de desalinización estándarGAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGGGG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogenpedido directo, purificación de desalinización estándar
CCG GGCTGCTGTGTCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogenpedido directo, purificación de desalinización estándar
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCTCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogenpedido directo, purificación
de desalinización estándarF-sub oligonucleótido: AAGGTT (FAM) TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		Orden directo de ADN-Syntez, purificación de HPLC
de ARN Spark lector de de ARN

Referencias

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Nanom quinas de DNAzimaDNAzima de escisi n de ARNsondas de hibridaci npolimorfismo de nucle tido nicoamplificaci n de se al fluorescenteADN de cadena dobleandamio de ADNPAGE nativonanotecnolog a del ADN
DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.