Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

1.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/66471

⸱

5 de enero de 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

En este artículo

Resumen

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Resumen

Acinetobacter baumannii es reconocido como un patógeno gramnegativo desafiante debido a su resistencia generalizada a los antibióticos. Es crucial comprender los mecanismos detrás de esta resistencia para diseñar opciones terapéuticas nuevas y efectivas. Desafortunadamente, nuestra capacidad para investigar estos mecanismos en A. baumannii se ve obstaculizada por la escasez de herramientas adecuadas de manipulación genética. Aquí, describimos métodos para utilizar un sistema basado en mini-Tn7 cromosómico para lograr la expresión génica de una sola copia en una cepa de A. baumannii que carece de mecanismos funcionales de eflujo de tipo RND. La inserción de copia única y la expresión de la bomba de eflujo inducible son bastante ventajosas, ya que la presencia de operones de eflujo de RND en plásmidos de alto número de copias a menudo es mal tolerada por las células bacterianas. Además, la incorporación de vectores de expresión de mini-Tn7 recombinantes en el cromosoma de un huésped sustituto de A. baumannii con mayor sensibilidad al eflujo ayuda a evitar la interferencia de otras bombas de eflujo. Este sistema es valioso no solo para investigar bombas de eflujo bacteriano no caracterizadas, sino también para evaluar la eficacia de los inhibidores potenciales dirigidos a estas bombas.

Introducción

Acinetobacter baumannii es un patógeno prioritario de la Organización Mundial de la Salud debido a su amplia resistencia a todas las clases de antibióticos1. Es un patógeno oportunista que afecta principalmente a personas hospitalizadas, lesionadas o inmunodeprimidas. A. baumannii evade en gran medida los antibióticos a través de bombas de eflujo, siendo la más relevante la familia de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Comprender cómo funcionan mecánicamente estas bombas de eflujo permitirá desarrollar opciones terapéuticas específicas.

Una forma común en que los procesos celulares se pueden distinguir específicamente es a través de la manipulación genética. Sin embargo, las herramientas disponibles para los estudios genéticos de A. baumannii son limitadas y, para confundir aún más el diseño experimental, los aislados clínicos a menudo son resistentes a los antibióticos utilizados rutinariamente para la selección en las manipulaciones genéticas3. Un segundo obstáculo que se encuentra cuando se estudian específicamente las bombas de eflujo es que están estrictamente reguladas, a menudo por factores desconocidos, lo que dificulta aislar con precisión y atribuir la función a una sola bomba4. Al ver esta necesidad de ampliar la caja de herramientas de investigación, desarrollamos un sistema de expresión inducible basado en mini-Tn7, de inserción de una sola copia, que incorpora un casete de diana recombinasa (FRT) Flp, que permite la eliminación del marcador de selección 5,6,7 (Figura 1). Creado por primera vez para Pseudomonas 8,9,10, este elegante sistema de clonación y expresión se utilizó para generar complementos de bomba de eflujo de copia única en una cepa de A. baumannii deficiente en bomba de eflujo RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: en lo sucesivo denominada A. baumannii AB258) que generamos11. Al poder estudiar una bomba de eflujo a la vez y no abrumar a las células bacterianas con una alta expresión de copia (como generalmente se ve con los sistemas de expresión basados en plásmidos), se puede aprender mejor sobre los aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de eflujo con una interferencia mínima y complicaciones reducidas.

Este artículo describe cómo utilizar el sistema mini-Tn7 para complementar un gen delecionado de interés, la bomba de eflujo de RND adeIJK, en el cromosoma de A. baumannii AB258 a través de una serie de pasos sin complicaciones realizados en el transcurso de 9 días7. El primer conjunto de pasos reintroduce los genes de la bomba de eflujo eliminados clonados en el plásmido de inserción basado en mini-Tn7 (Figura 2A) en el único sitio de inserción de Tn7att aguas abajo del gen glmS bien conservado (Figura 3A). Este proceso se ve facilitado por un plásmido auxiliar no replicativo (Figura 2B) que codifica los genes de la transposasa necesarios para la inserción impulsada por Tn7. El segundo conjunto de pasos utiliza un plásmido de escisión (Figura 2C) para la eliminación mediada por la recombinasa Flp del gen de la gentamicina flanqueada por sitios FRT (Figura 3B) para crear una cepa no marcada. Aunque este sistema se utiliza para dilucidar las funciones esenciales y los posibles inhibidores de las bombas de eflujo de RND con respecto a la resistencia a los antibióticos, se puede utilizar para investigar cualquier gen de interés.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación experimental

  1. Purificar el plásmido pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plásmido de inserción, Figura 2A) con el gen de interés.
    NOTA: Aquí, el gen de interés es adeIJK. La concentración final del plásmido debe ser de ≥100 ng/μL.
  2. Purificar el plásmido auxiliar (pTNS2)9 y el plásmido de escisión (pFLP2ab)6 (Figura 2B, C, respectivamente), idealmente hasta una concentración final de ADN plasmídico de ≥100 ng/μL.
  3. Prepare 50 ml de agua ultrapura estéril y 25 ml de caldo LB (Lennox) estéril (consulte la tabla de materiales).
  4. Prepare un mínimo de 10 LB de placas de agar, cada una con los siguientes aditivos: simple (sin aditivos), gentamicina (Gm) a 50 μg/mL, carbenicillina (Cb) a 200 μg/mL (para la selección a través del gen de resistencia a la ampicilina) y sacarosa al 5% (ver Tabla de Materiales).
  5. Escorar la cepa que se va a utilizar para la inserción en agar LB e incubar a 37 °C durante 16-18 h. En este caso, se utiliza A. baumannii AB258.
    NOTA: Este protocolo debe realizarse en un ambiente estéril en la medida de lo posible mediante el uso de un quemador Bunsen en el banco o una cabina de seguridad biológica. Todos los consumibles (puntas de pipeta, asas de inoculación, tubos de microfuga, etc.) deben ser estériles.

2. Preparación del cultivo

  1. Inocular una sola colonia de A. baumannii AB258 en 4 mL de caldo LB en un tubo de cultivo estéril de 13 mL utilizando un asa de inoculación estéril o una varilla inoculante de madera estéril.
    NOTA: Se utiliza un solo cultivo de 4 ml para una muestra y un control. Aumente el número de cultivos en función del número de muestras necesarias.
  2. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación (250 rpm).
  3. Coloque una botella de agua destilada estéril (25-50 ml) a 4 °C durante la noche para usarla en el paso 3.

3. Preparación de células electrocompetentes

  1. Coloque todos los tubos de microfuga estériles de 1,5 ml (dos por cultivo) y las cubetas de electroporación estériles (dos por cultivo) en hielo (consulte la Tabla de materiales). Mantenga las muestras en hielo tanto como sea posible durante todo el procedimiento.
  2. Coloque la botella de agua estéril almacenada a 4 °C sobre hielo.
  3. Transfiera 1,5 ml del cultivo bacteriano durante la noche a uno de los tubos de microfuga de 1,5 ml.
  4. Centrifugar a 13.000 x g durante 2 min para granular las células.
    NOTA: Lo ideal sería que la centrifugación se realizara a 4 °C, pero la centrifugación a temperatura ambiente es aceptable y no perjudicial.
  5. Con una pipeta de 1 ml, elimine todo el sobrenadante sin alterar el gránulo celular.
  6. Agregue otro 1,5 ml de cultivo bacteriano en el mismo tubo de microfuga. Centrifugar a 13.000 x g durante 2 min, luego eliminar todo el sobrenadante.
  7. Repita el paso 3.6 una última vez con el 1 ml restante de cultivo.
  8. Agregue 1 ml de agua estéril helada al gránulo de la celda y vuelva a suspender con un pipeteo suave hasta que el gránulo ya no se asiente en el fondo del tubo de microfuga.
  9. Centrifugar las células resuspendidas a 13.000 x g durante 2 min.
  10. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1 ml. No vierta el sobrenadante, especialmente en los pasos de lavado posteriores cuando las células tienden a formar gránulos menos compactos.
  11. Repita este paso de lavado con agua estéril helada, pasos 3.8 a 3.10, dos veces más.
  12. Vuelva a suspender suavemente el gránulo celular final en 200 μL de agua estéril helada.
  13. Transfiera 100 μL de la suspensión celular final al segundo tubo de microfuga helado de 1,5 mL. Esta segunda alícuota se convertirá en el control negativo para la electroporación. Mantenga las muestras de células en hielo.

4. Electroporación

  1. Precalentar 1 mL de caldo LB y una placa de agar LB + Gm50 (preparada en el paso 1.4) para cada muestra y controlar en una incubadora estática ajustada a 37 °C.
  2. En un volumen combinado de 5 μL o menos, añadir 100-200 ng de cada uno de los plásmidos auxiliares pTNS2 y el plásmido de inserción pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK a una alícuota de células electrocompetentes.
  3. Mezcle con suaves golpecitos con la yema de los dedos para asegurar una mezcla completa de los plásmidos con las células electrocompetentes sin introducir burbujas.
  4. Agregue un volumen equivalente de agua destilada estéril en la alícuota de la celda de control negativo y mezcle suavemente como se indicó anteriormente.
  5. Incubar las muestras en hielo durante 20 min.
  6. Transfiera toda la muestra de células a una cubeta de electroporación helada y, a continuación, vuelva a colocar la cubeta en hielo. Repita el procedimiento para la muestra de célula de control negativa.
  7. Electroporate la muestra de la célula.
    1. Encienda el electroporador y ajústelo a 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (consulte la Tabla de materiales).
    2. Limpie la superficie de la cubeta con un pañuelo de papel suave para eliminar el hielo o la humedad adheridos.
    3. Inserte la cubeta en el electroporador y administre la descarga eléctrica.
    4. Agregue inmediatamente 0,9 ml de caldo LB precalentado a las celdas de la cubeta y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las celdas con el medio.
    5. Transfiera toda la suspensión celular a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 ml (temperatura ambiente).
    6. Verifique el valor de la constante de tiempo en el electroporador; Para obtener los mejores resultados, este valor debe estar entre 4 y 6.
  8. Repita el procedimiento de electroporación (pasos 4.7.1 a 4.7.6) para la muestra de celda de control negativa.
  9. Incubar las muestras electroporadas a 37 °C durante 1 h a 250 rpm para permitir la recuperación celular.
  10. Con un esparcidor de inoculación, esparza 100 μL de cada muestra de célula electroporada en una placa de agar LB + Gm50 precalentada.
    1. Centrifugar las muestras restantes a 13.000 x g durante 2 min para granular las células.
    2. Después de eliminar todo el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender las células en 100 μL de caldo LB.
    3. Extienda cada muestra entera en placas individuales de agar LB + Gm50 precalentadas.
      NOTA: La eficiencia de la electroporación puede depender de la deformación. Al electroporar una cepa por primera vez, puede ser informativo colocar diferentes volúmenes, o incluso diluciones, de la muestra de electroporación para asegurarse de que las placas resultantes tengan colonias aisladas.
  11. Incubar las placas a 37 °C durante 16-18 h.

5. Selección de colonias transformadas para el cribado basado en PCR

  1. Revisa las placas de electroporación. El control negativo no debe tener colonias; La muestra debe tener colonias distintas.
    NOTA: Las placas con colonias, en esta etapa y en todas las etapas posteriores en las que se produzcan placas de agar con colonias o parches, pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 días antes de continuar.
  2. Con palillos de dientes estériles, recoja hasta 10 colonias individuales de las placas de agar LB + Gm50 y colóquelas en una placa de agar LB + Gm50 nueva.
  3. Incubar las placas a 37 °C durante 16-18 h.

6. Verificación de la inserción cromosómica mediante PCR de colonias

  1. Retire de la incubadora las placas de agar LB + Gm50 que contienen las colonias parcheadas.
  2. Con un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta estéril, extraiga una pequeña porción (aproximadamente del tamaño de una colonia grande) de un parche y colóquela en 20 μl de agua destilada estéril en un tubo de PCR de 0,2 ml; mezclar bien. La muestra de agua debe volverse visiblemente turbia a medida que las células se liberan del palillo. Prepare cualquier cantidad de muestras que necesiten ser analizadas, pero 6 deberían ser suficientes.
  3. Incubar el tubo de PCR que contiene la suspensión bacteriana a 100 °C durante 5-10 min.
  4. Con una minicentrífuga (ver Tabla de Materiales), haga girar la muestra a la velocidad máxima fija durante 2 minutos para granular los restos celulares.
  5. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de PCR de 0,2 ml y colóquelo en hielo. Esta muestra contiene el ADN molde para la reacción de PCR.
    NOTA: Este ADN molde se puede almacenar a -20 °C antes de proceder con la PCR.
  6. Prepare una mezcla de reacción de PCR que contenga 1x tampón polimerasa, 200 μM de dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New cebador directo, 0,18 μM de cebador inverso Tn7R (Tabla 1), 1 U de ADN polimerasa Taq y 1 μL del ADN molde preparado en un volumen total de 25 μL. Prepare un control sin plantilla (NTC), que incluya todo el ADN molde excepto el molde (ver Tabla de materiales).
  7. Introduzca las condiciones de reacción en un termociclador: 95 °C durante 2 min; 95 °C durante 30 s, 49 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s durante un total de 35 ciclos; 72 °C durante 10 min; 12 °C de retención. Ejecute los ejemplos.
  8. Después de la adición del colorante de carga de ADN a una concentración final de 1x, cargue 10 μL de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 2% y corra a 80 V durante 40 min. El tamaño de amplicón esperado para este par de cebadores es de 382 pb. El CNT no debería tener bandas.
  9. Identifique las muestras que produjeron el producto de PCR esperado. Prepare una placa de rayas en placas de agar LB + Gm50 a partir de cualquiera de los parches positivos para PCR; incubar a 37 °C durante 16-18 h. El objetivo es generar una placa con colonias individuales para la preparación de un caldo de glicerol para preservar esta cepa marcada y como punto de partida para crear una cepa no marcada (descrita a continuación).

7. Eliminación del marcador GmR usando pFLP2ab

  1. Siga el procedimiento mencionado en el paso 2: Preparación del cultivo. La muestra utilizada para preparar el cultivo nocturno es una sola colonia de las placas de agar LB + Gm50 preparadas para generar colonias discretas en el paso 6.9.
  2. Siga el procedimiento mencionado en el paso 3: Preparación de celdas electrocompetentes. Prepare las células del cultivo nocturno para la electroporación.
  3. Siga el procedimiento mencionado en el paso 4: Electroporación. En este caso, el plásmido que se introduce en las células es pFLP2ab (100-200 ng), que eliminará el gen de resistencia a la gentamicina, flanqueando el gen de interés insertado cromosómicamente.
  4. Después de que las células se hayan recuperado durante 1 h (paso 4.9), extienda 100 μL de la muestra de células electroporadas en una placa de agar LB + Cb200 precalentada (preparada en el paso 1.4). Esta presión selectiva asegura que solo crecerán las células que albergan el plásmido de escisiónab pFLP2.
  5. Incubar las placas a 37 °C durante 16-18 h.
  6. Revisa la placa en busca de colonias. La placa de control negativa no debe tener colonias; la placa de muestra de agar LB + Cb200 debe tener colonias distintas.
  7. Usando palillos de dientes estériles, coloque parches cruzados de hasta 20 colonias aisladas en una placa de agar LB + Cb200 y una placa de agar LB + Gm50 .
  8. Incubar las placas durante 16-18 h a 37 °C.
  9. Revise las placas en busca de parches. A los clones que crecen en la placa de agar LB + Cb200 pero no en la placa de agar LB + Gm50 se les ha eliminado el gen de resistencia a la gentamicina del inserto original.
  10. Seleccione los parches que son resistentes a la carbenicilina y a la gentamicina susceptibles de rayar en placas individuales de agar LB suplementadas con sacarosa al 5% (p/v), lo que obliga a la expulsión del plásmidoab pFLP2 de las bacterias. Elige hasta 10 colonias.
  11. Incubar las placas durante 16-18 h a 37 °C.
  12. Revisa las placas en busca de colonias.
  13. Como confirmación final de la pérdida del plásmidoab de pFLP2, se cruzaron 4-6 colonias aisladas de las placas de sacarosa al 5% en una placa de agar LB + Cb200 y una placa de agar LB.
  14. Incubar las placas durante 16-18 h a 37 °C.
  15. Elija un clon que esté creciendo en la placa de agar LB y que sea sensible a la carbenicilina para la preparación de un stock de glicerol para preservar esta cepa no marcada.
    1. La verificación genética de la cepa no marcada se puede realizar con PCR de colonias (paso 6: Verificación de la inserción cromosómica mediante PCR de colonias) utilizando los cebadores que se dirigen al gen de resistencia a la gentamicina.
    2. Preparar una mezcla de reacción de PCR que contenga 1x tampón polimerasa, 200 μM de dNTP, 0,18 μM de cebador Gm_F directo, 0,18 μM Gm_R cebador inverso (Tabla 1), 1 U de ADN polimerasa Taq y 1 μL del ADN plantilla preparado en un volumen total de 25 μL. Preparar un control sin plantilla (NTC) que incluya todo el ADN excepto el molde, y un control positivo utilizando ADN de la cepa marcada.
    3. Introduzca las condiciones de reacción en un termociclador: 95 °C durante 2 min; 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 40 s durante un total de 35 ciclos; 72 °C durante 10 min; 12 °C de retención. Ejecute los ejemplos.
    4. Después de la adición de colorante de carga de ADN a una concentración final de 1x, cargue 10 μL de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 1% y corra a 80 V durante 40 min. El tamaño de amplicón esperado para este par de cebadores es de 525 pb. El control positivo debe tener una sola banda; las muestras y el NTC no deben tener bandas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El procedimiento de inserción cromosómica toma solo 2 horas en total durante 3 días para ver un resultado: colonias creciendo en una placa de agar selectiva (Figura 1A-C). El número esperado de colonias en la placa de transformación depende de la cepa: se pueden ver 20-30 o incluso cientos de colonias, ya que la inserción de Tn7 en los sitios attTn7 es específica y eficiente9. La aplicación de parches a las colonias de placas...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

A pesar de que este procedimiento para la inserción cromosómica de un sistema de expresión génica inducible de una sola copia en A. baumannii es técnicamente sencillo y no requiere mucha mano de obra, hay algunos pasos importantes que deben enfatizarse. En primer lugar, la preparación de las células competentes debe realizarse en hielo tanto como sea posible, ya que las células se vuelven frágiles durante la sustitución de los medios por agua helada. Idealmente, los pasos de centrifugación se realizan a 4 °C, pe...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca Discovery Grant del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá para AK. Los esquemas utilizados en las figuras se crean con BioRender.com.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de PCR de 0,2 mLVWR20170-012Para preparaciones de ebullición de colonias y reacciones de PCR
Tubos de microfuga de 1,5 mLSarstedt72-690-301 Tubos de
cultivo de 13 mL de uso general, PyrexFisher14-957KRecipientes de cultivo líquido
6x tampón de carga de ADNFroggabioLD010Electroforesis en gel de agarosa colorante de carga de muestras
Acético ácido, glacialFisher351271-212Gel de agarosa componente tampón
AgarBioshopAGR003Medios de crecimiento sólidos
AgarosaBioBasicD0012Separación electroforética de productos de reacción PCR; utilizado a una concentración de 0,8 pulgadas; 2%
Unidad de electroforesis en gel de agarosaFisher29-237-54Electroforesis en gel de agarosa; separación de productos de reacción de PCR
CarbenicilinaFisher 50841231Medios selectivos Cierres
de tubos de cultivoFisher13-684-138Cierre de acero inoxidable para tubos de cultivo de 13 mL Set
de trifosfato de desoxinucleótido (dNTP)BiobasicDD0058componente de reacción PCR; suministrados en 100 mM cada uno dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mezclado y diluido para 10 mM cada uno dNTP
Calentador de baño/bloqueFisher 88860023Baño seco digital Isotemp para preparaciones de ebullición
Cubetas de electroporaciónVWR89047-208Cubetas de electroporación de 2 mm con tapón redondo
ElectroporadorCole Parmer940000009110 VCA, 60 Hz Electroporador
Bromuro de etidioFisherBP102-1Visualización de productos de reacción de PCR y marcadores de ADN en gel de agarosa
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)VWRCA-EM4050Componente tampón de funcionamiento de gel de agarosa
GentamicinaBiobasicGB0217Para la preparación de medios selectivos
GlicerolFisherG33Preparación de reservas bacterianas para el almacenamiento a largo plazo en un congelador ultrabajo
Incubadora (agitación)New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24 Incubadora Agitador para el crecimiento de cultivos líquidos
Incubadora (estática)Fisher11-690-550DHorno incubador Isotemp modelo 550D para el crecimiento de cultivos sólidos (agar LB)
Asa de inoculaciónSarstedt86.1562.050Colonias rayadas en placas de agar
Esparcidor de inoculaciónSarstedt86.1569.005Esparcimiento de cultivo en placas de agar
Caldo de lisogenia (LB) caldo, LennoxFisherBP1427Medios de crecimiento líquidos (20 g/L: 5 g/L de cloruro de sodio, 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura)
MicrofugeFisher 75002431Sorvall Legend Micro 17 para la centrifugación de muestras
MinicentrífugaFisherS67601BCentrifugación de tubos de PCR de 0,2 mL Placas de
PetriSPL Ciencias de la Vida10090Para medios de crecimiento sólidos (placas de agar): Pipetas de 90 x 15 mm
 MandelVariaspipetas monocanal Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Fuente de alimentaciónBiorad1645050PowerPac Fuente de alimentación básica para electroforesis
ImprimadoresIDTNAComponente de reacción PCR; específico para el gen de interés; preparado a 100 μ M como se indica en la hoja de especificaciones del producto
SacarosaBioBasicSB0498Para la preparación de medios contraselectivos para la eliminación del plásmido pFLP2ab de A. baumannii
ADN polimerasa Taqtransformado FroggaBioT-500Componente de reacción PCR; polimerasa suministrada con un tampón 10x
TermocicladorBiorad1861096modelo T100 para PCR
Palillos de dientesFisherS24559Para parchear colonias en placas de agar
Trizma baseSigmaT1503Componente tampón de gel de agarosa
Agua ultrapurade agua Millipore SigmaZLXLSD51040MilliQ: agua ultrapura para la preparación de medios y soluciones, y el lavado de células
Marcador de ADN de amplio espectroBiobasicM103R-2Determinación del tamaño de productos de PCR en un gel de agarosa
Varillas inoculantes de maderaFisher29-801-02Inoculación de cultivos con colonias a partir de placas de agar
Sistema de purificación

Referencias

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Expresión de la bomba de eflujosistema cromosómico Mini-Tn7mecanismos de eflujo RNDcélulas electrocompetentescribado mediante PCR de coloniaresistencia a los antibióticosinserción de genes
Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.