Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Summary

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Abstract

Acinetobacter baumannii es reconocido como un patógeno gramnegativo desafiante debido a su resistencia generalizada a los antibióticos. Es crucial comprender los mecanismos detrás de esta resistencia para diseñar opciones terapéuticas nuevas y efectivas. Desafortunadamente, nuestra capacidad para investigar estos mecanismos en A. baumannii se ve obstaculizada por la escasez de herramientas adecuadas de manipulación genética. Aquí, describimos métodos para utilizar un sistema basado en mini-Tn7 cromosómico para lograr la expresión génica de una sola copia en una cepa de A. baumannii que carece de mecanismos funcionales de eflujo de tipo RND. La inserción de copia única y la expresión de la bomba de eflujo inducible son bastante ventajosas, ya que la presencia de operones de eflujo de RND en plásmidos de alto número de copias a menudo es mal tolerada por las células bacterianas. Además, la incorporación de vectores de expresión de mini-Tn7 recombinantes en el cromosoma de un huésped sustituto de A. baumannii con mayor sensibilidad al eflujo ayuda a evitar la interferencia de otras bombas de eflujo. Este sistema es valioso no solo para investigar bombas de eflujo bacteriano no caracterizadas, sino también para evaluar la eficacia de los inhibidores potenciales dirigidos a estas bombas.

Introduction

Acinetobacter baumannii es un patógeno prioritario de la Organización Mundial de la Salud debido a su amplia resistencia a todas las clases de antibióticos¹. Es un patógeno oportunista que afecta principalmente a personas hospitalizadas, lesionadas o inmunodeprimidas. A. baumannii evade en gran medida los antibióticos a través de bombas de eflujo, siendo la más relevante la familia de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)². Comprender cómo funcionan mecánicamente estas bombas de eflujo permitirá desarrollar opciones terapéuticas específicas.

Una forma común en que los procesos celulares se pueden distinguir específicamente es a través de la manipulación genética. Sin embargo, las herramientas disponibles para los estudios genéticos de A. baumannii son limitadas y, para confundir aún más el diseño experimental, los aislados clínicos a menudo son resistentes a los antibióticos utilizados rutinariamente para la selección en las manipulaciones genéticas³. Un segundo obstáculo que se encuentra cuando se estudian específicamente las bombas de eflujo es que están estrictamente reguladas, a menudo por factores desconocidos, lo que dificulta aislar con precisión y atribuir la función a una sola bomba⁴. Al ver esta necesidad de ampliar la caja de herramientas de investigación, desarrollamos un sistema de expresión inducible basado en mini-Tn7, de inserción de una sola copia, que incorpora un casete de diana recombinasa (FRT) Flp, que permite la eliminación del marcador de selección ^5,6,7 (Figura 1). Creado por primera vez para Pseudomonas ^8,9,10, este elegante sistema de clonación y expresión se utilizó para generar complementos de bomba de eflujo de copia única en una cepa de A. baumannii deficiente en bomba de eflujo RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: en lo sucesivo denominada A. baumannii AB258) que generamos¹¹. Al poder estudiar una bomba de eflujo a la vez y no abrumar a las células bacterianas con una alta expresión de copia (como generalmente se ve con los sistemas de expresión basados en plásmidos), se puede aprender mejor sobre los aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de eflujo con una interferencia mínima y complicaciones reducidas.

Este artículo describe cómo utilizar el sistema mini-Tn7 para complementar un gen delecionado de interés, la bomba de eflujo de RND adeIJK, en el cromosoma de A. baumannii AB258 a través de una serie de pasos sin complicaciones realizados en el transcurso de 9 días⁷. El primer conjunto de pasos reintroduce los genes de la bomba de eflujo eliminados clonados en el plásmido de inserción basado en mini-Tn7 (Figura 2A) en el único sitio de inserción de Tn7att aguas abajo del gen glmS bien conservado (Figura 3A). Este proceso se ve facilitado por un plásmido auxiliar no replicativo (Figura 2B) que codifica los genes de la transposasa necesarios para la inserción impulsada por Tn7. El segundo conjunto de pasos utiliza un plásmido de escisión (Figura 2C) para la eliminación mediada por la recombinasa Flp del gen de la gentamicina flanqueada por sitios FRT (Figura 3B) para crear una cepa no marcada. Aunque este sistema se utiliza para dilucidar las funciones esenciales y los posibles inhibidores de las bombas de eflujo de RND con respecto a la resistencia a los antibióticos, se puede utilizar para investigar cualquier gen de interés.

Protocol

1. Preparación experimental

1. Purificar el plásmido pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plásmido de inserción, Figura 2A) con el gen de interés.
   NOTA: Aquí, el gen de interés es adeIJK. La concentración final del plásmido debe ser de ≥100 ng/μL.
2. Purificar el plásmido auxiliar (pTNS2)⁹ y el plásmido de escisión (pFLP2^ab)⁶ (Figura 2B, C, respectivamente), idealmente hasta una concentración final de ADN plasmídico de ≥100 ng/μL.
3. Prepare 50 ml de agua ultrapura estéril y 25 ml de caldo LB (Lennox) estéril (consulte la tabla de materiales).
4. Prepare un mínimo de 10 LB de placas de agar, cada una con los siguientes aditivos: simple (sin aditivos), gentamicina (Gm) a 50 μg/mL, carbenicillina (Cb) a 200 μg/mL (para la selección a través del gen de resistencia a la ampicilina) y sacarosa al 5% (ver Tabla de Materiales).
5. Escorar la cepa que se va a utilizar para la inserción en agar LB e incubar a 37 °C durante 16-18 h. En este caso, se utiliza A. baumannii AB258.
   NOTA: Este protocolo debe realizarse en un ambiente estéril en la medida de lo posible mediante el uso de un quemador Bunsen en el banco o una cabina de seguridad biológica. Todos los consumibles (puntas de pipeta, asas de inoculación, tubos de microfuga, etc.) deben ser estériles.

2. Preparación del cultivo

1. Inocular una sola colonia de A. baumannii AB258 en 4 mL de caldo LB en un tubo de cultivo estéril de 13 mL utilizando un asa de inoculación estéril o una varilla inoculante de madera estéril.
   NOTA: Se utiliza un solo cultivo de 4 ml para una muestra y un control. Aumente el número de cultivos en función del número de muestras necesarias.
2. Incubar durante la noche a 37 °C con agitación (250 rpm).
3. Coloque una botella de agua destilada estéril (25-50 ml) a 4 °C durante la noche para usarla en el paso 3.

3. Preparación de células electrocompetentes

1. Coloque todos los tubos de microfuga estériles de 1,5 ml (dos por cultivo) y las cubetas de electroporación estériles (dos por cultivo) en hielo (consulte la Tabla de materiales). Mantenga las muestras en hielo tanto como sea posible durante todo el procedimiento.
2. Coloque la botella de agua estéril almacenada a 4 °C sobre hielo.
3. Transfiera 1,5 ml del cultivo bacteriano durante la noche a uno de los tubos de microfuga de 1,5 ml.
4. Centrifugar a 13.000 x g durante 2 min para granular las células.
   NOTA: Lo ideal sería que la centrifugación se realizara a 4 °C, pero la centrifugación a temperatura ambiente es aceptable y no perjudicial.
5. Con una pipeta de 1 ml, elimine todo el sobrenadante sin alterar el gránulo celular.
6. Agregue otro 1,5 ml de cultivo bacteriano en el mismo tubo de microfuga. Centrifugar a 13.000 x g durante 2 min, luego eliminar todo el sobrenadante.
7. Repita el paso 3.6 una última vez con el 1 ml restante de cultivo.
8. Agregue 1 ml de agua estéril helada al gránulo de la celda y vuelva a suspender con un pipeteo suave hasta que el gránulo ya no se asiente en el fondo del tubo de microfuga.
9. Centrifugar las células resuspendidas a 13.000 x g durante 2 min.
10. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1 ml. No vierta el sobrenadante, especialmente en los pasos de lavado posteriores cuando las células tienden a formar gránulos menos compactos.
11. Repita este paso de lavado con agua estéril helada, pasos 3.8 a 3.10, dos veces más.
12. Vuelva a suspender suavemente el gránulo celular final en 200 μL de agua estéril helada.
13. Transfiera 100 μL de la suspensión celular final al segundo tubo de microfuga helado de 1,5 mL. Esta segunda alícuota se convertirá en el control negativo para la electroporación. Mantenga las muestras de células en hielo.

4. Electroporación

1. Precalentar 1 mL de caldo LB y una placa de agar LB + Gm⁵⁰ (preparada en el paso 1.4) para cada muestra y controlar en una incubadora estática ajustada a 37 °C.
2. En un volumen combinado de 5 μL o menos, añadir 100-200 ng de cada uno de los plásmidos auxiliares pTNS2 y el plásmido de inserción pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK a una alícuota de células electrocompetentes.
3. Mezcle con suaves golpecitos con la yema de los dedos para asegurar una mezcla completa de los plásmidos con las células electrocompetentes sin introducir burbujas.
4. Agregue un volumen equivalente de agua destilada estéril en la alícuota de la celda de control negativo y mezcle suavemente como se indicó anteriormente.
5. Incubar las muestras en hielo durante 20 min.
6. Transfiera toda la muestra de células a una cubeta de electroporación helada y, a continuación, vuelva a colocar la cubeta en hielo. Repita el procedimiento para la muestra de célula de control negativa.
7. Electroporate la muestra de la célula.
   1. Encienda el electroporador y ajústelo a 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (consulte la Tabla de materiales).
   2. Limpie la superficie de la cubeta con un pañuelo de papel suave para eliminar el hielo o la humedad adheridos.
   3. Inserte la cubeta en el electroporador y administre la descarga eléctrica.
   4. Agregue inmediatamente 0,9 ml de caldo LB precalentado a las celdas de la cubeta y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las celdas con el medio.
   5. Transfiera toda la suspensión celular a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 ml (temperatura ambiente).
   6. Verifique el valor de la constante de tiempo en el electroporador; Para obtener los mejores resultados, este valor debe estar entre 4 y 6.
8. Repita el procedimiento de electroporación (pasos 4.7.1 a 4.7.6) para la muestra de celda de control negativa.
9. Incubar las muestras electroporadas a 37 °C durante 1 h a 250 rpm para permitir la recuperación celular.
10. Con un esparcidor de inoculación, esparza 100 μL de cada muestra de célula electroporada en una placa de agar LB + Gm⁵⁰ precalentada.
    1. Centrifugar las muestras restantes a 13.000 x g durante 2 min para granular las células.
    2. Después de eliminar todo el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender las células en 100 μL de caldo LB.
    3. Extienda cada muestra entera en placas individuales de agar LB + Gm⁵⁰ precalentadas.
       NOTA: La eficiencia de la electroporación puede depender de la deformación. Al electroporar una cepa por primera vez, puede ser informativo colocar diferentes volúmenes, o incluso diluciones, de la muestra de electroporación para asegurarse de que las placas resultantes tengan colonias aisladas.
11. Incubar las placas a 37 °C durante 16-18 h.

5. Selección de colonias transformadas para el cribado basado en PCR

1. Revisa las placas de electroporación. El control negativo no debe tener colonias; La muestra debe tener colonias distintas.
   NOTA: Las placas con colonias, en esta etapa y en todas las etapas posteriores en las que se produzcan placas de agar con colonias o parches, pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 días antes de continuar.
2. Con palillos de dientes estériles, recoja hasta 10 colonias individuales de las placas de agar LB + Gm⁵⁰ y colóquelas en una placa de agar LB + Gm⁵⁰ nueva.
3. Incubar las placas a 37 °C durante 16-18 h.

6. Verificación de la inserción cromosómica mediante PCR de colonias

1. Retire de la incubadora las placas de agar LB + Gm⁵⁰ que contienen las colonias parcheadas.
2. Con un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta estéril, extraiga una pequeña porción (aproximadamente del tamaño de una colonia grande) de un parche y colóquela en 20 μl de agua destilada estéril en un tubo de PCR de 0,2 ml; mezclar bien. La muestra de agua debe volverse visiblemente turbia a medida que las células se liberan del palillo. Prepare cualquier cantidad de muestras que necesiten ser analizadas, pero 6 deberían ser suficientes.
3. Incubar el tubo de PCR que contiene la suspensión bacteriana a 100 °C durante 5-10 min.
4. Con una minicentrífuga (ver Tabla de Materiales), haga girar la muestra a la velocidad máxima fija durante 2 minutos para granular los restos celulares.
5. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de PCR de 0,2 ml y colóquelo en hielo. Esta muestra contiene el ADN molde para la reacción de PCR.
   NOTA: Este ADN molde se puede almacenar a -20 °C antes de proceder con la PCR.
6. Prepare una mezcla de reacción de PCR que contenga 1x tampón polimerasa, 200 μM de dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New cebador directo, 0,18 μM de cebador inverso Tn7R (Tabla 1), 1 U de ADN polimerasa Taq y 1 μL del ADN molde preparado en un volumen total de 25 μL. Prepare un control sin plantilla (NTC), que incluya todo el ADN molde excepto el molde (ver Tabla de materiales).
7. Introduzca las condiciones de reacción en un termociclador: 95 °C durante 2 min; 95 °C durante 30 s, 49 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s durante un total de 35 ciclos; 72 °C durante 10 min; 12 °C de retención. Ejecute los ejemplos.
8. Después de la adición del colorante de carga de ADN a una concentración final de 1x, cargue 10 μL de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 2% y corra a 80 V durante 40 min. El tamaño de amplicón esperado para este par de cebadores es de 382 pb. El CNT no debería tener bandas.
9. Identifique las muestras que produjeron el producto de PCR esperado. Prepare una placa de rayas en placas de agar LB + Gm⁵⁰ a partir de cualquiera de los parches positivos para PCR; incubar a 37 °C durante 16-18 h. El objetivo es generar una placa con colonias individuales para la preparación de un caldo de glicerol para preservar esta cepa marcada y como punto de partida para crear una cepa no marcada (descrita a continuación).

7. Eliminación del marcador Gm^R usando pFLP2^ab

1. Siga el procedimiento mencionado en el paso 2: Preparación del cultivo. La muestra utilizada para preparar el cultivo nocturno es una sola colonia de las placas de agar LB + Gm⁵⁰ preparadas para generar colonias discretas en el paso 6.9.
2. Siga el procedimiento mencionado en el paso 3: Preparación de celdas electrocompetentes. Prepare las células del cultivo nocturno para la electroporación.
3. Siga el procedimiento mencionado en el paso 4: Electroporación. En este caso, el plásmido que se introduce en las células es pFLP2^ab (100-200 ng), que eliminará el gen de resistencia a la gentamicina, flanqueando el gen de interés insertado cromosómicamente.
4. Después de que las células se hayan recuperado durante 1 h (paso 4.9), extienda 100 μL de la muestra de células electroporadas en una placa de agar LB + Cb²⁰⁰ precalentada (preparada en el paso 1.4). Esta presión selectiva asegura que solo crecerán las células que albergan el plásmido de escisión^ab pFLP2.
5. Incubar las placas a 37 °C durante 16-18 h.
6. Revisa la placa en busca de colonias. La placa de control negativa no debe tener colonias; la placa de muestra de agar LB + Cb²⁰⁰ debe tener colonias distintas.
7. Usando palillos de dientes estériles, coloque parches cruzados de hasta 20 colonias aisladas en una placa de agar LB + Cb²⁰⁰ y una placa de agar LB + Gm⁵⁰ .
8. Incubar las placas durante 16-18 h a 37 °C.
9. Revise las placas en busca de parches. A los clones que crecen en la placa de agar LB + Cb²⁰⁰ pero no en la placa de agar LB + Gm⁵⁰ se les ha eliminado el gen de resistencia a la gentamicina del inserto original.
10. Seleccione los parches que son resistentes a la carbenicilina y a la gentamicina susceptibles de rayar en placas individuales de agar LB suplementadas con sacarosa al 5% (p/v), lo que obliga a la expulsión del plásmido^ab pFLP2 de las bacterias. Elige hasta 10 colonias.
11. Incubar las placas durante 16-18 h a 37 °C.
12. Revisa las placas en busca de colonias.
13. Como confirmación final de la pérdida del plásmido^ab de pFLP2, se cruzaron 4-6 colonias aisladas de las placas de sacarosa al 5% en una placa de agar LB + Cb²⁰⁰ y una placa de agar LB.
14. Incubar las placas durante 16-18 h a 37 °C.
15. Elija un clon que esté creciendo en la placa de agar LB y que sea sensible a la carbenicilina para la preparación de un stock de glicerol para preservar esta cepa no marcada.
    1. La verificación genética de la cepa no marcada se puede realizar con PCR de colonias (paso 6: Verificación de la inserción cromosómica mediante PCR de colonias) utilizando los cebadores que se dirigen al gen de resistencia a la gentamicina.
    2. Preparar una mezcla de reacción de PCR que contenga 1x tampón polimerasa, 200 μM de dNTP, 0,18 μM de cebador Gm_F directo, 0,18 μM Gm_R cebador inverso (Tabla 1), 1 U de ADN polimerasa Taq y 1 μL del ADN plantilla preparado en un volumen total de 25 μL. Preparar un control sin plantilla (NTC) que incluya todo el ADN excepto el molde, y un control positivo utilizando ADN de la cepa marcada.
    3. Introduzca las condiciones de reacción en un termociclador: 95 °C durante 2 min; 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 40 s durante un total de 35 ciclos; 72 °C durante 10 min; 12 °C de retención. Ejecute los ejemplos.
    4. Después de la adición de colorante de carga de ADN a una concentración final de 1x, cargue 10 μL de cada reacción de PCR en un gel de agarosa al 1% y corra a 80 V durante 40 min. El tamaño de amplicón esperado para este par de cebadores es de 525 pb. El control positivo debe tener una sola banda; las muestras y el NTC no deben tener bandas.

Results

El procedimiento de inserción cromosómica toma solo 2 horas en total durante 3 días para ver un resultado: colonias creciendo en una placa de agar selectiva (Figura 1A-C). El número esperado de colonias en la placa de transformación depende de la cepa: se pueden ver 20-30 o incluso cientos de colonias, ya que la inserción de Tn7 en los sitios attTn7 es específica y eficiente⁹. La aplicación de parches a las colonias de placas de transformación en medios selectivos (Figura 4A) preserva la cepa transformada y proporciona material de partida para el cribado por PCR de colonias (Figura 1E y Figura 4B). El cribado de las colonias mediante PCR puede reducirse al mínimo: no debería ser necesario procesar más de 10 colonias, y la mayoría debería arrojar un resultado positivo para la inserción. El producto de PCR para los cebadores de cribado, ABglmS2_F_New y Tn7R (Tabla 1), es de 382 pb (Figura 4B carril 4); Los controles negativos de la reacción incluyen A. baumannii ATCC 17978 de tipo salvaje (Figura 4B carril 2), AB258 (Figura 4B carril 3) y sin plantilla (Figura 4B carril 5). Las colonias que son positivas para PCR representan cepas marcadas y complementadas.

La eliminación del gen de resistencia a la gentamicina (desmarcado) tarda menos de 3 h, abarcando 6 días, ya que las células transformadas con el plásmido de escisión deben elegirse mediante siembra selectiva y, a continuación, el plásmido de escisión debe curarse de las bacterias (Figura 1F). La escisión basada en la recombinación Flp-FRT es precisa y eficaz y debería dar lugar a ≥20 colonias en la placa de transformación. Las colonias que se cruzan con carbenicilina (seleccionando la resistencia a los β-lactámicos conferida por el plásmido de escisión) y la gentamicina (en busca de la pérdida de resistencia a la gentamicina) deben ser todas resistentes a la carbenicilina y sensibles a la gentamicina, respectivamente. El plásmido de escisión es expulsado de las bacterias por el crecimiento en placas de agar sacarosa al 5%. El crecimiento de la sacarosa obliga a las células a eliminar pFLP2^ab, ya que el gen sacB del plásmido promueve la conversión de la sacarosa en levans, un polisacárido tóxico para las bacterias^12,13. Todas las colonias que crecen en medios de sacarosa al 5% deben crecer solo en placas de agar LB simples; No debe haber crecimiento en las placas de agar carbenicilina. Las colonias que crecen en las placas de agar LB simples representan cepas no marcadas. La confirmación de la pérdida del marcador de gentamicina puede lograrse mediante PCR de colonias utilizando los cebadores Gm_F y Gm_R (Tabla 1 y Figura 5). Este par de cebadores produce un amplicón de 525 pb solo en el control positivo (la deformación marcada creada inicialmente, Figura 5 carril 4); El ATCC 17978 de tipo salvaje (Figura 5 carril 2), AB258 (Figura 5 carril 3), cualquier colonia probada (Figura 5 carril 5) y el control sin plantilla (Figura 5 carril 6) no deben mostrar amplificación.

Una vez que se confirma la cepa no marcada, las pruebas funcionales pueden comenzar con ensayos fenotípicos. En este caso, la primera opción obvia es determinar la concentración inhibitoria mínima (CMI) de una serie de antibióticos: la ciprofloxacina es un sustrato conocido de AdeIJK, la tetraciclina puede ser eliminada por AdeIJK (la principal bomba de eflujo es AdeAB) y la kanamicina tiene un efecto relativamente menor sobre A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Utilizando el método de microdilución de caldo de acuerdo con las directrices CLSI¹⁵, la cepa complementaria no marcada AB258::adeIJK se desafió con cada antibiótico en ausencia y presencia de 50 μM de IPTG; se incluyeron como controles la cepa de tipo salvaje ATCC 17978 y la cepa AB258 con deficiencia de eflujo de RND (Tabla 2). En general, la tendencia observada en los valores de CMI indica la historia esperada: disminución de la susceptibilidad de AB258::adeIJK a ciprofloxacino y tetraciclina con la expresión inducida de la bomba de eflujo, verificando que la inserción de adeIJK fue exitosa.

Figura 1: Resumen del procedimiento. (A) Se prepara un cultivo nocturno de la cepa de A. baumannii que se complementará. (B) Las células del cultivo nocturno se lavan con agua 3 veces mediante centrifugación y se mantienen en hielo. (C) Los plásmidos de entrega y auxiliares se añaden a las células y se incuban en hielo durante 20 min. La muestra se electropora, se añade un medio LB y se deja que las células se recuperen durante 1 h a 37 °C. Una alícuota de 100 μL de células se extiende en placas de agar LB + Gm⁵⁰ y se incuba a 37 °C durante la noche. (D) Las colonias de la placa de transformación se parchean en una placa de agar LB + Gm⁵⁰ y se cultivan durante la noche a 37 °C. (E) Las colonias parcheadas se preparan para la PCR con el fin de detectar la presencia de un producto de amplificación que abarque el sitio de inserción cromosómica. La amplificación por PCR se visualiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Las muestras positivas para PCR representan la inserción exitosa del gen de interés en el cromosoma y la creación de una cepa marcada. (F) Se prepara una colonia positiva para gentamicina como en los pasos (A-C), con electroporación del plásmido^ab pLFP2 para eliminar el casete de gentamicina de la inserción cromosómica. La siembra selectiva en agar LB + Cb²⁰⁰ confirma la absorción del plásmido. El parcheo duplicado en placas de agar LB + Cb²⁰⁰ y LB + Gm⁵⁰ revela colonias que son Cb^R y Gm^S, lo que confirma la pérdida del casete de gentamicina de la inserción. El crecimiento de colonias Cb^R seleccionadas con sacarosa al 5% cura el plásmido pLFP2^ab de las células. Las colonias de la placa de sacarosa al 5% se parchean en agar LB + Cb²⁰⁰ y agar LB para revelar las colonias deseadas de Cb^S y GM^S y confirmar la creación de la cepa no marcada. Gm⁵⁰, gentamicina a 50 μg/mL; Cb²⁰⁰, carbenicilina a 200 μg/mL; ^R, resistente; ^S, sensible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Plásmidos utilizados en este protocolo. Mapas generales de plásmidos de (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (plásmido de inserción), (B) pTNS2 (plásmido auxiliar) y (C) pFLP2^ab (plásmido de escisión). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Esquema de inserción y desmarcado. a) Inserción. El único sitio de inserción de Tn7 en el cromosoma A. baumannii se encuentra a 24 pb del final del gen glmS2. La coelectroporación del plásmido de inserción y el plásmido auxiliar permite la complementación del gen de interés (gen insertado, morado) junto con el resto del casete de inserción (sitios FRT para escisión de marcadores, amarillo; gen accC1 para la resistencia a gentamicina, verde; lacIq para la expresión inducible, azul) en el cromosoma. (B) Desmarcado. La electroporación de la cepa de inserción complementada y marcada con el plásmido de escisión^ab pFLP2 facilita la eliminación del gen de resistencia a la gentamicina (accC1, verde) a través de la recombinación Flp-FRT (sitios FRT, amarillo), creando una cepa no marcada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Confirmación de transformación, parcheo e inserción mediante PCR de colonias. Resultado representativo de (A) el crecimiento de colonias de transformación después del parcheo y (B) la amplificación de colonias por PCR con cebadores ABglmS_F_New (gris) y Tn7R (naranja) para confirmar la inserción cromosómica. Carril 1: Escalera de ADN de bajo peso molecular; Carril 2: ATCC 179798; Carril 3: AB258; Carril 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Carril 5: control sin plantilla. La banda esperada de 382 pb está etiquetada. Tenga en cuenta que los cebadores específicos de gentamicina (Gm_F y Gm_R, verde) también podrían usarse para afirmar la inserción cromosómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Confirmación de la pérdida de marcador por PCR de colonias. Resultado representativo de la amplificación por PCR de colonias con cebadores específicos de gentamicina (Gm_F y Gm_R) para confirmar la pérdida del marcador antibiótico mediante escisión basada en pFLP^ab. Carril 1: escalera de ADN de bajo peso molecular; Carril 2: ATCC 179798; Carril 3: AB258; Carril 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Carril 5: AB258::adeIJK; Carril 6: control sin plantilla. La banda esperada de 525 pb está etiquetada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cepas, plásmidos y cebadores	Características relevantes	Referencia
Mancha
A. baumannii ATCC 17978	Tipo de cepa	ATCC
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmidios
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Este estudio
pTNS2	AmperajeR	9
pFLP2ab	pWH1266 origen o replicación, sacB, AmpR	7
Imprimaciones	Secuencia (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Este estudio
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Este estudio

Tabla 1: Cepas bacterianas, plásmidos y cebadores utilizados en este protocolo. GM, gentamicina; Amp, ampicilina; ^R, resistente.

	Ciprofloxacino		Tetraciclina		Kanamicina
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Cambio de pliegue		4.01		4.03		0.25

Tabla 2: Prueba de la funcionalidad de los genes insertados a través de la susceptibilidad a los antibióticos. Comparación de los valores de concentración inhibitoria mínima (CMI) para A. baumannii ATCC 17978, AB258, AB258::adeIJK no inducida y AB258::adeIJK inducida por IPTG frente a ciprofloxacino, tetraciclina y kanamicina. Cambio de pliegue = inducido (+ IPTG)/no inducido (− IPTG); nd = no determinado.

Discussion

A pesar de que este procedimiento para la inserción cromosómica de un sistema de expresión génica inducible de una sola copia en A. baumannii es técnicamente sencillo y no requiere mucha mano de obra, hay algunos pasos importantes que deben enfatizarse. En primer lugar, la preparación de las células competentes debe realizarse en hielo tanto como sea posible, ya que las células se vuelven frágiles durante la sustitución de los medios por agua helada. Idealmente, los pasos de centrifugación se realizan a 4 °C, pero la centrifugación a temperatura ambiente es aceptable. Dada la creciente fragilidad de las células durante los lavados con agua, el pipeteo suave también es fundamental. En segundo lugar, la electroporación es sensible a la presencia de iones. El lavado de las celdas con múltiples rondas de peletización y resuspensión en agua garantiza que el medio se elimine por completo. Además, los plásmidos deben purificarse recién purificados y pueden eluirse en tampones de elución de kit estándar (normalmente tampón TE) siempre que la concentración de ADN plasmídico sea lo suficientemente alta. Nuestro objetivo es añadir <5 μL de plásmido a 100 μL de suspensión celular para mantener la fuerza iónica de la muestra muy baja, aunque se deben tolerar hasta 10 μL. En tercer lugar, se deben preparar placas de agar selectivas según sea necesario para garantizar la eficacia del antibiótico añadido. Obsérvese que se utilizó carbenicilina en lugar de la ampicilina habitual para la selección durante la transformación del plásmido de escisión, pFLP2^ab. A. baumannii es intrínsecamente resistente a las aminopenicilinas (ampicilina)¹⁶; La sustitución de una carboxipenicilina (carbenicilina) permite una selección continua con la β-lactamasa codificada por plásmidos.

La optimización del protocolo experimental es más matizada y variará entre las diferentes especies de Acinetobacter (o incluso cepas manipuladas genéticamente dentro de la misma especie) y, posiblemente, los reactivos particulares utilizados en el laboratorio. Por ejemplo, el voltaje utilizado para la electroporación puede variar entre 1,8 y 2,5 kV, y es posible que sea necesario modificar ligeramente las condiciones de termociclado dependiendo de la ADN polimerasa utilizada para la PCR. Los consejos útiles a tener en cuenta si las células están creciendo mal después de la electroporación incluyen reducir la concentración de gentamicina en las placas de agar de 50 μg/mL a 30 μg/mL y/o extender el tiempo de incubación de las placas de agar a ≥24 h. En cuanto a los pasos para retirar el casete de gentamicina, se puede tener más éxito utilizando placas de agar LB con sacarosa al 10% y/o incubándolas a 30 °C durante ≥24 h si persiste la resistencia a la carbenicilina.

En la literatura se pueden encontrar numerosos métodos de preparación de células de A. baumannii para su uso con electroporación, pero a menudo incluyen un paso de subcultivo después del cultivo inicial durante la noche y luego una larga fase de crecimiento hasta una densidad óptica prescrita. Hemos descubierto que un simple cultivo de la noche a la mañana se puede utilizar con la misma eficacia. La electroporación de A. baumannii ha sido bien descrita, y los lectores pueden obtener más información sobre este aspecto específico del protocolo aquí^17,18. Las principales ventajas de este sistema de complementación génica cromosómica mini-Tn7 en comparación con un sistema de complementación basado en plásmidos son la capacidad de regular el nivel de expresión del gen complementado a través del sistema represor lacI^q controlable por IPTG y la opción de eliminar el marcador de gentamicina (gen aacC1) a través de los sitios FRT flanqueantes. Se observó que la tolerancia de las células a la expresión de las bombas de eflujo puede variar dependiendo de la bomba insertada. Por ejemplo, las células son más sensibles a la expresión de AdeIJK en comparación con AdeABC o AdeFGH; esto se puede abordar modificando la concentración de IPTG en condiciones de cultivo. La eliminación del marcador antibiótico reduce el riesgo mutacional de la cepa debido a la presión constante de selección y también permite realizar investigaciones de susceptibilidad a los antibióticos sin restricciones³.

Este sistema mini-Tn7 se ha utilizado con éxito con las especies Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ y Acinetobacter ^5,6,21,22, sin embargo, existen algunas limitaciones. Por ejemplo, en A. baumannii solo hay un sitio de inserción funcional attTn7 en el genoma⁵, por lo que se puede crear una cepa con múltiples deleciones, pero solo se puede complementar un gen a la vez. Además, este sistema aún no ha demostrado su eficacia para las bacterias Gram-positivas¹⁰.

Las bombas de eflujo de RND son importantes facilitadores de la resistencia a los antibióticos en A. baumannii. Lo que los hace tan poderosos es su estructura de tres partes que se extiende a través de las membranas interna y externa, lo que permite la eliminación de antibióticos desde el periplasma hacia el exterior de la célula. Se ha demostrado que las bombas RND más estudiadas y ubicuas, designadas AdeABC, AdeFGH y AdeIJK, eliminan los antibióticos que abarcan todas las clases. Esclarecer en detalle la función de la bomba de eflujo proporcionará un buen punto de partida para diseñar nuevas opciones terapéuticas contra cepas multirresistentes. El uso de la cepa de deleción de la bomba triple RND AB258 y la complementación de una bomba a la vez permite el estudio de cada bomba independientemente de las demás, discerniendo para cada una sus perfiles de sustrato únicos y los inhibidores más efectivos. Por supuesto, las bombas de eflujo también tienen un papel "día a día" en el funcionamiento normal de la bacteria. Comprender esas funciones podría conducir a la paralización indirecta de las bombas, lo que, a su vez, interrumpiría el flujo de antibióticos, lo que posiblemente haría que las bacterias multirresistentes a los antibióticos de uso común volvieran a ser susceptibles a los antibióticos de uso común. Generalmente, el sistema mini-Tn7 se puede utilizar para introducir cualquier gen de interés para un estudio detallado o marcadores útiles, por ejemplo, proteínas fluorescentes para imágenes microscópicas⁶.

La creciente prevalencia de bacterias multirresistentes es una preocupación para todos nosotros. Comprender los mecanismos de protección proporcionados por las bombas de eflujo en patógenos como A. baumannii es fundamental para combatir infecciones graves. Este sistema de expresión génica cromosómica de copia única es una poderosa herramienta para estudios mecanicistas, así como para identificar inhibidores que frustren la función de la bomba de eflujo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de PCR de 0,2 mL	VWR	20170-012	Para preparaciones de ebullición de colonias y reacciones de PCR
Tubos de microfuga de 1,5 mL	Sarstedt	72-690-301 Tubos de
cultivo de 13 mL de uso general, Pyrex	Fisher	14-957K	Recipientes de cultivo líquido
6x tampón de carga de ADN	Froggabio	LD010	Electroforesis en gel de agarosa colorante de carga de muestras
Acético ácido, glacial	Fisher	351271-212	Gel de agarosa componente tampón
Agar	Bioshop	AGR003	Medios de crecimiento sólidos
Agarosa	BioBasic	D0012	Separación electroforética de productos de reacción PCR; utilizado a una concentración de 0,8 pulgadas; 2%
Unidad de electroforesis en gel de agarosa	Fisher	29-237-54	Electroforesis en gel de agarosa; separación de productos de reacción de PCR
Carbenicilina	Fisher 50841231		Medios selectivos Cierres
de tubos de cultivo	Fisher	13-684-138	Cierre de acero inoxidable para tubos de cultivo de 13 mL Set
de trifosfato de desoxinucleótido (dNTP)	Biobasic	DD0058	componente de reacción PCR; suministrados en 100 mM cada uno dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mezclado y diluido para 10 mM cada uno dNTP
Calentador de baño/bloque	Fisher 88860023		Baño seco digital Isotemp para preparaciones de ebullición
Cubetas de electroporación	VWR	89047-208	Cubetas de electroporación de 2 mm con tapón redondo
Electroporador	Cole Parmer	940000009	110 VCA, 60 Hz Electroporador
Bromuro de etidio	Fisher	BP102-1	Visualización de productos de reacción de PCR y marcadores de ADN en gel de agarosa
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Componente tampón de funcionamiento de gel de agarosa
Gentamicina	Biobasic	GB0217	Para la preparación de medios selectivos
Glicerol	Fisher	G33	Preparación de reservas bacterianas para el almacenamiento a largo plazo en un congelador ultrabajo
Incubadora (agitación)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubadora Agitador para el crecimiento de cultivos líquidos
Incubadora (estática)	Fisher	11-690-550D	Horno incubador Isotemp modelo 550D para el crecimiento de cultivos sólidos (agar LB)
Asa de inoculación	Sarstedt	86.1562.050	Colonias rayadas en placas de agar
Esparcidor de inoculación	Sarstedt	86.1569.005	Esparcimiento de cultivo en placas de agar
Caldo de lisogenia (LB) caldo, Lennox	Fisher	BP1427	Medios de crecimiento líquidos (20 g/L: 5 g/L de cloruro de sodio, 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura)
Microfuge	Fisher 75002431		Sorvall Legend Micro 17 para la centrifugación de muestras
Minicentrífuga	Fisher	S67601B	Centrifugación de tubos de PCR de 0,2 mL Placas de
Petri	SPL Ciencias de la Vida	10090	Para medios de crecimiento sólidos (placas de agar): Pipetas de 90 x 15 mm
	Mandel	Varias	pipetas monocanal Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Fuente de alimentación	Biorad	1645050	PowerPac Fuente de alimentación básica para electroforesis
Imprimadores	IDT	NA	Componente de reacción PCR; específico para el gen de interés; preparado a 100 μ M como se indica en la hoja de especificaciones del producto
Sacarosa	BioBasic	SB0498	Para la preparación de medios contraselectivos para la eliminación del plásmido pFLP2ab de A. baumannii
ADN polimerasa Taq	transformado FroggaBio	T-500	Componente de reacción PCR; polimerasa suministrada con un tampón 10x
Termociclador	Biorad	1861096	modelo T100 para PCR
Palillos de dientes	Fisher	S24559	Para parchear colonias en placas de agar
Trizma base	Sigma	T1503	Componente tampón de gel de agarosa
Agua ultrapura	de agua Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ: agua ultrapura para la preparación de medios y soluciones, y el lavado de células
Marcador de ADN de amplio espectro	Biobasic	M103R-2	Determinación del tamaño de productos de PCR en un gel de agarosa
Varillas inoculantes de madera	Fisher	29-801-02	Inoculación de cultivos con colonias a partir de placas de agar