Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino

Summary

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

Abstract

La termogénesis mediada por tejido adiposo marrón (BAT) desempeña un papel importante en la regulación del metabolismo, y su morfología y función pueden verse muy afectadas por los estímulos ambientales en ratones y humanos. En la actualidad, la MTD interescapular murina (iBAT), que se encuentra entre dos escápulas en el flanco dorsal superior de los ratones, es el principal depósito de MTD utilizado por los laboratorios de investigación para estudiar la función de las MTD. Recientemente, se identificaron algunos depósitos de MTD previamente desconocidos en ratones, incluido uno análogo al tejido adiposo marrón supraclavicular humano. A diferencia del iBAT, el tejido adiposo marrón supraclavicular murino (scBAT) está situado en la capa intermedia del cuello y, por lo tanto, no se puede acceder a él tan fácilmente.

Para facilitar el estudio de las scBAT de ratón recién identificadas, se presenta un protocolo que detalla los pasos para diseccionar scBAT intacto de ratones postnatales y adultos. Debido al pequeño tamaño de scBAT en relación con otros depósitos adiposos, los procedimientos se han modificado y optimizado específicamente para el procesamiento de scBAT. Entre estas modificaciones se encuentra el uso de un microscopio de disección durante la recolección de tejidos para aumentar la precisión y homogeneización de las muestras congeladas de scBAT para aumentar la eficiencia del análisis de qPCR posterior. Con estas optimizaciones, se puede determinar la identificación, el aspecto morfológico y la caracterización molecular de la scBAT en ratones.

Introduction

La creciente prevalencia de la obesidad en los Estados Unidos y en todo el mundo ha despertado un gran interés en comprender su etiología e identificar posibles tratamientos ^1,2. El tejido adiposo desempeña un papel vital en el metabolismo, y la desregulación del tejido adiposo puede conducir al desarrollo de obesidad. Generalmente, hay dos tipos de tejidos adiposos, el tejido adiposo blanco y el marrón. Mientras que el tejido adiposo blanco (WAT) puede almacenar energía química y secretar factores endocrinos, el tejido adiposo marrón (BAT) puede utilizar energía química para generar calor y mantener la temperatura corporal en el frío ^3,4. Debido a esta capacidad única, la activación de BAT también puede aumentar el gasto energético y mejorar la sensibilidad a la insulina⁵.

BAT ejerce su función a través de la termogénesis sin temblores, un proceso mediado por el desacoplamiento de la proteína 1 (UCP1)⁶. Los mamíferos, incluidos los ratones y los humanos, poseen cantidades variables de BAT. La visión clásica de las MTD es que estos tejidos adiposos son más abundantes en ratones y lactantes que en humanos adultos. iBAT, situado en el flanco dorsal superior entre las escápulas, es el depósito de MTD más estudiado en ratones. Mediante la aplicación de imágenes de radioisótopos y pruebas de biopsia, estudios recientes identificaron varios depósitos de MTD en humanos adultos. Algunos de ellos, incluyendo los depósitos encontrados en la región profunda del cuello y supraclavicular, no habían sido identificados previamente en ratones u otros animales modelo 7,8,9,10,11. Entre estos depósitos de MTD, el scBAT es el depósito que se observa con mayor frecuencia en humanos adultos. Para comprender mejor el origen y la contribución molecular de estos depósitos de MTD recién descubiertos en humanos, es esencial identificar depósitos equivalentes en ratones que permitan manipulaciones genéticas y moleculares para rastrear y probar el papel funcional de estos depósitos. Por lo tanto, nosotros y otros identificamos algunos depósitos de MTD previamente desconocidos en diferentes ubicaciones anatómicas en ratones, incluido el SCBAT^12,13, el BAT perivascular torácico^14,15, el BAT perirrenal¹⁶ y el BAT periaórtico¹⁷. El scBAT de ratón se asemeja anatómicamente al scBAT humano y morfológicamente se asemeja al iBAT clásico, expresando altos niveles de UCP1¹².

A diferencia del iBAT de ratón, que se puede diseccionar fácilmente, el scBAT está situado en la capa intermedia del cuello del ratón, debajo de las glándulas salivales y a lo largo de la vena yugular externa. El aislamiento de este depósito para análisis histológicos y moleculares puede ser un desafío. Aquí, describimos en detalle el procedimiento para diseccionar scBAT de ratones postnatales y adultos y procesar este depósito para el análisis histológico y de expresión génica.

Protocol

Los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Baylor. Todos los procedimientos se realizaron en ratones machos C57BL/6J de 3 semanas y 3 meses de edad. Antes de la disección, todos los ratones fueron sacrificados utilizando el procedimiento aprobado de eutanasia con dióxido de carbono para roedores. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Disección de scBAT

1. Coloque la carcasa del ratón en el banco de trabajo y limpie las tijeras quirúrgicas y las pinzas de punta superfina con etanol al 70%.
2. Rocíe el cuello ventral del ratón con etanol al 70% para humedecer el pelaje y minimizar la contaminación del pelaje.
3. Realice una incisión bilateral, de aproximadamente 1,5 cm, a lo largo de las clavículas.
4. Desde los extremos de la incisión anterior, cortar longitudinalmente hacia las orejas, de aproximadamente 1 cm de largo. Esto formará una incisión cuadrada en forma de U alrededor del cuello (Figura 1A, B).
   NOTA: scBAT se encuentra en la capa intermedia del cuello. La capa superficial, compuesta por la piel, el tejido adiposo subcutáneo y las glándulas salivales, queda expuesta durante este paso. La capa intermedia, junto con scBAT, contiene las venas yugulares y los músculos del cuello. La capa profunda del cuello, que contiene las MTD profundas del cuello y las venas arteriales y yugulares, queda expuesta mediante la extirpación del músculo esquelético.
5. Coloque el ratón bajo un microscopio de disección y enfoque el cuello expuesto (Figura 1C).
   NOTA: Este paso adicional aumenta en gran medida la precisión de la recolección de tejidos, necesaria dado el pequeño tamaño de scBAT.
6. Exponga las glándulas salivales por completo levantando las secciones de piel incisas con fórceps.
7. Con unas tijeras quirúrgicas y unas pinzas, desconecte el tejido que conecta las glándulas salivales con el tejido que rodea las clavículas y entre sí.
8. Exponga los depósitos de scBAT levantando las glándulas salivales. Busque el BAT a lo largo de la vena yugular externa y posiblemente conectado a la parte inferior de las glándulas salivales. Identifícalo por su color anaranjado, que destaca sobre el tejido circundante.
9. Sostenga el tejido adiposo objetivo con pinzas y retírelo suavemente de las glándulas salivales.
10. Una vez desprendido de las glándulas salivales, continúe desconectando el scBAT de la vena yugular externa y la musculatura del cuello hasta que los depósitos a ambos lados del cuello puedan eliminarse por completo.
11. Inspeccione cada muestra de scBAT disecada bajo el microscopio de disección (Figura 1D, E), usando fórceps para eliminar cualquier tejido conectivo restante.
12. Coloque cada muestra en un frasco de centelleo de vidrio que contenga 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y retire el ratón de debajo del microscopio.

2. Procesamiento y tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de scBAT (ilustrado en la Figura 2A)

1. Sustituya el PBS (paso 1.12) por 10 ml de paraformaldehído (PFA) frío al 4% y coloque el vial sobre un nutator, meciéndose a 4 °C durante la noche para fijar el scBAT.
   NOTA: La fijación por perfusión se puede aplicar en ratones posnatales, especialmente adultos, cuando se necesita un procesamiento adicional para el análisis inmunohistoquímico.
2. Al día siguiente, retire la solución de PFA del vial con una pipeta de transferencia estéril y reemplácela con 10-15 ml de PBS. Coloque el vial en un nutator y muévalo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Reemplace PBS con solución salina al 0.85% y continúe balanceándose durante otros 30 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: La solución salina es salina al 0,85 % (NaCl) p/v en agua tratada con DEPC (sin RNasa). El PBS puede sustituir la solución salina en este paso y en el siguiente.
3. Retire la solución salina al 0,85 % con una pipeta de transferencia y agregue 10 ml de solución salina al 70 % de etanol / solución salina al 0,85 % al vial. Guarde el vial en una nevera a 4 °C durante la noche o hasta que esté listo para la inclusión en parafina.
   NOTA: Se puede utilizar PBS si no se dispone de solución salina al 0,85%. scBAT debe procesarse lo antes posible para facilitar el corte y conservar mejor la morfología del tejido.
4. Antes de la inclusión en parafina, deshidrate scBAT a través de una serie de intercambios de etanol para eliminar el agua del tejido.
   1. Para comenzar, retire el vial con etanol al 70 % y solución salina al 0,85 % con una pipeta de transferencia y agregue 10-15 ml de alcohol deshidratante al 95 %, balanceando el vial sobre un nutator a temperatura ambiente durante 1 h. Repita este paso una vez.
      NOTA: El etanol se puede usar en lugar de soluciones de alcohol deshidratante.
   2. A continuación, reemplace el alcohol deshidratante al 95% con 10-15 ml de alcohol deshidratante al 100% y continúe meciéndose en un nutator durante 1 h. Rellene con alcohol deshidratante 100% nuevo y continúe meciendo durante varias horas o toda la noche, dependiendo de la cantidad de scBAT en el vial.
5. Para liberar scBAT para la inclusión, agregue 10 ml de tolueno al vial y continúe balanceándose en un nutator hasta que scBAT esté transparente, aproximadamente 6-8 h.
   NOTA: La duración del tiempo necesario para lograr una compensación satisfactoria depende del tamaño del SCBAT. Se recomienda comenzar a limpiar inmediatamente por la mañana para que la infiltración y la incrustación puedan tener lugar por la tarde.
6. Para incrustar scBAT en cera de parafina, retire el tolueno y agregue 10 ml de cera de parafina de infiltración derretida al vial. Introducir el vial en un horno a 65 °C durante 1 h. Repite este paso con cera nueva.
   NOTA: Comience a derretir los gránulos de cera en un horno durante la noche antes de que comience la incrustación para asegurarse de que la cera esté completamente líquida.
7. Sustituya la cera de parafina de infiltración por cera de parafina de inclusión y coloque el vial a la misma temperatura durante 1 h. Repita este paso una vez.
   NOTA: La etapa de infiltración puede interrumpirse y continuar más tarde. Retire el vial del horno y guárdelo a temperatura ambiente hasta que esté listo para continuar.
8. Incruste el tejido colocándolo primero en un molde de inclusión de tejido, agregue cera de inclusión derretida al molde y reoriente el tejido bajo un microscopio estereoscópico. Luego, coloque un casete de inclusión encima de la cera y continúe vertiendo cera de incrustación sobre la parte superior hasta que esté lleno y la tapa de inclusión esté sujeta al bloque de cera. Transfiera el bloque a un refrigerador a 4 ° C durante la noche para dejar que la cera se endurezca y se encoja antes de quitar el molde de metal.
9. Seccionar el scBAT con un micrótomo hasta un espesor de 5-6 μm¹⁸, de tres a cuatro secciones por portaobjetos de microscopio, y colocar en un baño de flotación de sección de parafina caliente a ~42 °C para permitir que las secciones de tejido se alisen.
10. Transfiera las secciones a los portaobjetos y colóquelos en posición vertical contra el baño de flotación para permitir que el agua gotee de los portaobjetos.
11. Transfiera los portaobjetos a una rejilla de tinción de acero inoxidable y colóquela en un banco de secado de portaobjetos para que se seque durante la noche.
    NOTA: Los portaobjetos de parafina se pueden almacenar a largo plazo a temperatura ambiente antes de que se logre un procesamiento posterior.
12. Realice la tinción H&E¹⁹. Para comenzar, coloque los portaobjetos en una rejilla de tinción, luego coloque la rejilla en un frasco de tinción con xileno durante 40 s. Repita este paso una vez.
    NOTA: Si la parafina sigue siendo visible después de las dos etapas, espere hasta que se haya disuelto por completo antes de continuar.
13. Para rehidratar el tejido, coloque la rejilla de portaobjetos en un frasco de tinción lleno de alcohol deshidratante al 100 % durante dos etapas de 20 s, seguidas de una etapa de 15 s en alcohol deshidratante al 95 % y un enjuague final de 15 s en ddH₂O.
14. Coloque los portaobjetos en una placa de tinción llena de solución de hematoxilina durante 75 s para lograr la tinción nuclear, luego enjuague los portaobjetos en una placa de tinción con ddH₂O durante 45 s.
    NOTA: El tiempo se puede ajustar según el color de tinte deseado.
15. Diferencie la tinción sumergiendo los portaobjetos en una placa de tinción llena de solución de HCl-etanol durante 15 s, luego transfiera los portaobjetos a otro enjuague ddH₂O durante 15 s.
    NOTA: La solución de HCl-etanol se prepara de acuerdo con un método publicado¹⁹.
16. Para la tinción citoplasmática, coloque el portaobjetos en una solución de contratinción de eosina Y durante 15 s.
17. Deshidratar el tejido sumergiendo los portaobjetos durante 15 s cada uno en tres etapas secuenciales de solución de alcohol deshidratante al 95 %, luego dos baños secuenciales de alcohol deshidratante al 100 %, el primero durante 15 s y el segundo durante 45 s, para terminar la deshidratación.
18. Finalmente, transfiera los portaobjetos a un baño de xileno durante 45 s para volver a aclimatar el tejido a los solventes orgánicos. Después de este paso, se completa la tinción; Retire el pañuelo de la solución.
19. Aplique medio de montaje a cada portaobjetos y cúbralo dentro de una campana de extracción de gases químicos. Secar durante la noche antes de tomar imágenes. Los resultados de las imágenes se muestran en la Figura 2B.

3. Análisis de la expresión génica de scBAT

1. Recolección de tejidos (molienda)
   1. Después de diseccionar scBAT, coloque inmediatamente el tejido en un tubo de microcentrífuga, haga un agujero en la parte superior del tubo con una aguja estéril y congele en nitrógeno líquido.
      NOTA: Los pasos principales del protocolo descritos aquí se ilustran en la Figura 3A. Hacer un agujero en la parte superior del tubo antes de dejarlo caer en nitrógeno líquido evita que el tubo explote debido al cambio repentino de presión.
   2. Llene un vaso de plástico con nitrógeno líquido y deje un mortero y una espátula delgada en remojo.
      NOTA: Es importante mantener la temperatura de todas las herramientas y muestras de tejido lo más fría posible, cerca de la temperatura del nitrógeno líquido, durante todo el procedimiento para evitar que el tejido se descongele. El tejido adiposo descongelado es muy adherente y hace que el polvo sea más desafiante. Retire las herramientas y muestras de los baños de nitrógeno líquido inmediatamente antes de usarlas.
   3. Tome una muestra de tejido ultracongelada a la vez y viértala desde su tubo de microcentrífuga en el mortero.
   4. Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido al mortero, luego use el mortero para moler el tejido congelado hasta que esté completamente pulverizado.
      NOTA: Si el tejido comienza a volverse blando o pegajoso en algún momento, se está descongelando; Vierte más nitrógeno líquido en el mortero.
   5. Use la espátula delgada para raspar con cuidado y transferir el tejido pulverizado nuevamente al tubo de microcentrífuga. Vierta nitrógeno líquido en el mortero mientras raspa para recoger los trozos de tejido sobrantes antes de transferirlos con una espátula. Repita los pasos de transferencia hasta que se retire todo el tejido del mortero.
   6. Limpie el mortero con un limpiador de pañuelos ligero y etanol al 70% antes de verter la siguiente muestra para moler. Guarde el pañuelo en polvo en un congelador a -80 °C a largo plazo.
2. Aislamiento total de ARN
   1. Preparación
      1. Limpie el banco de trabajo, las pipetas, los portapuntas y las gradillas de tubos con etanol al 70 % y descontaminante de superficies para eliminar la RNasa.
      2. Haga funcionar la máquina centrífuga hasta alcanzar los 4 °C.
      3. Calentar la solución de elución a 70 °C.
      4. Diluir la DNasa I mezclando 5 μL de DNasa I reconstituida con 75 μL de solución de dilución de DNasa por muestra. Coloque la solución de DNasa I en hielo hasta su uso.
   2. Procedimiento
      1. Para cada muestra, etiquete dos tubos de microcentrífuga, dos tubos de retención de columna (dos tubos de microcentrífuga graduados sin tapa) y una minicolumna de unión.
      2. Añadir 500 μL de solución de aislamiento de ARN a cada muestra y sonicar con un motor de mortero de pellets durante 30 s.
      3. Obtenga una jeringa para cada muestra y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para lisar aún más el tejido. Asegúrese de que no haya sólidos visibles después de la jeringa.
      4. Añadir 250 μL de cloroformo y vórtice de vez en cuando mientras se espera 5 min a que las muestras se incuben a temperatura ambiente.
      5. Centrifugar a 21.000 × g durante 20 min a 4 °C.
      6. Transfiera la porción acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue una cantidad equivalente de etanol al 70% (~ 500 μL).
         NOTA: La parte acuosa superior debe ser transparente, la inferior debe ser la solución de aislamiento de ARN rojo y entre las dos capas debe haber algunos sólidos no deseados.
      7. Transfiera 500 μL del nuevo lisado a la columna de unión. Centrifugar a 18.000 × g durante 60 s y luego desechar el filtrado.
      8. Repita el paso anterior con el lisado restante para que todo el ARN entre en la columna de unión.
      9. Añadir 700 μL de lavado de baja rigurosidad a la columna de unión, centrifugar durante 30 s y desechar el filtrado.
      10. Añadir 80 μL de DNasa I diluida a cada columna de unión. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
      11. Añadir 700 μL de lavado de alta rigurosidad, centrifugar durante 30 s y desechar el filtrado.
      12. Añadir 700 μL de lavado de baja rigurosidad, centrifugar durante 60 s y desechar el filtrado.
      13. Mueva las columnas de unión al segundo tubo de sujeción de la^{columna sin tapa} y centrifugue durante 2 minutos para asegurarse de que todos los líquidos se eliminen de la columna de unión.
      14. Mueva las columnas de unión a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 30 μL de solución de elución calentada. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
      15. Centrifugar durante 2 minutos para recoger el ARN eluido en el fondo del tubo de microcentrífuga.
      16. Mida la concentración total de ARN con un espectrofotómetro.
          NOTA: Si la pureza total del ARN es baja, indicada por un valor de 260/280 inferior a 2,0 o un valor de 260/230 inferior a 1,8, después del paso 3.2.2.12., las muestras se pueden lavar una vez más con un lavado de baja rigurosidad seguido de un lavado con etanol al 80% antes de continuar con el paso 3.2.2.13.
      17. Almacenar el ARN en un congelador a -80 °C.
   3. Transcripción inversa (RT)
      1. En una tira de tubo de PCR, agregue 0,5-1 μg de ARN total diluido en agua tratada con DEPC hasta un total de 8 μL por cada muestra de ARN a un pocillo diferente.
         NOTA: La cantidad de ARN utilizada para la transcripción inversa se puede aumentar o reducir de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      2. Agregue 1 μL de Oligo dT y 1 μL de dNTP a cada muestra en el tubo de PCR. Asegúrese de que el volumen total sea de 10 μL por muestra.
      3. Coloque la tira de tubos de PCR en un termociclador y ajústela a 65 °C durante 5 minutos seguidos de 4 °C indefinidamente.
      4. Después de 5 minutos a 65 °C, saque la tira del tubo de PCR y colóquelo en hielo durante al menos 2 minutos. Después de la incubación en hielo, agregue cinco reactivos: 4 μL de tampón de primera cadena 5x, 2 μL de 25 mM de MgCl₂, 2 μL de DTT 0.1M, 1 μL de inhibidor de RNasa y 1 μL de transcriptasa inversa a cada muestra. Asegúrese de que el volumen total sea ahora de 20 μL por muestra.
      5. Vuelva a colocar la tira de tubos de PCR en el termociclador y ajuste el programa a 50 °C durante 50 minutos, luego a 85 °C durante 5 minutos y luego a 4 °C indefinidamente.
      6. Una vez que el programa alcance los 4 °C, saque la tira y agregue 1 μL de ribonucleasa H (RNasa H).
         NOTA: La RNasa H se utiliza para eliminar cualquier molde de ARN restante en la reacción RT; en este paso, el ARN deseado ya debería haberse convertido en ADNc.
      7. Vuelva a colocar la tira en el termociclador y hágala funcionar a 37 °C durante 20 minutos y luego a 4 °C indefinidamente.
      8. La transcripción inversa está completa; medir la concentración de ADNc con un espectrofotómetro.
      9. Diluir el ADNc a 250 ng/μL; almacenar el ADNc en un congelador a -80 °C o -20 °C.
   4. PCR cuantitativa (qPCR)
      1. Haga una hoja de cálculo para organizar la posición de cada cebador y muestra en la placa de qPCR de 96 pocillos.
         NOTA: Uno de los cebadores debe ser un gen de referencia para normalizar la expresión de todos los demás genes de interés, como el 36B4.
      2. Haz una mezcla maestra de cebador para cada combinación de "cebador + muestra". A cada pocillo de reacción de qPCR, agregue 3 μL de agua de grado de biología molecular, 5 μL de mezcla maestra de enzimas qPCR, 0,5 μL de cebador directo y 0,5 μL de cebador inverso, lo que suma 9 μL por reacción. Agregue 1 μL de ADNc por reacción para hacer un total de 10 μL por pozo de reacción.
         NOTA: El estándar es tener tres réplicas técnicas para cada combinación de "cebador + muestra", por lo que cada mezcla maestra debe ser 4 veces mayor que las cantidades anteriores.
      3. Agregue 1 μL de ADNc por cada réplica a cada mezcla maestra de cebadores. Si cada mezcla maestra es 4x, pipetee 4 μL de cada muestra de ADNc en su propio tubo marcado.
      4. Finalmente, pipetee 10 μL de cada mezcla de reacción en la placa de qPCR de 96 pocillos en las posiciones determinadas por la hoja de cálculo.
      5. Selle la placa con un sello adhesivo grueso y, a continuación, centrifugue la placa de 96 pocillos a 450 × g a 20 °C durante 2 min.
         NOTA: Es fundamental que la placa esté completamente sellada para evitar que las muestras se evaporen durante el termociclado. Use limpiadores de pañuelos ligeros para presionar el sello sobre la placa, especialmente los bordes.
      6. Ejecute la placa en un instrumento de PCR en tiempo real. Programe la reacción de PCR según las instrucciones del fabricante: 2 min a 50 °C, seguidos de otros 2 min a 95 °C, y finalmente 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 30 s a 60 °C. Los resultados del análisis de expresión génica de qPCR se muestran en la Figura 3B.

Results

A diferencia del iBAT, que se sitúa en la capa subcutánea de la espalda entre dos escápulas, el scBAT se sitúa en la capa intermedia del cuello, extendiéndose profundamente entre las capas del músculo esquelético y la glándula salival a medida que crece a lo largo de la vena yugular externa (Figura 1A). La disección de scBAT no es tan sencilla como la de iBAT. Aquí, proporcionamos un procedimiento detallado que incluye pasos cruciales para diseccionar scBAT intacto de ratones postnatales y adultos (Figura 1B, C). Después de abrir el cuello utilizando el protocolo proporcionado, se puede identificar una capa delgada de scBAT bajo un microscopio de disección y despegar de la glándula salival conectada y la vena yugular externa con un par de pinzas (Figura 1D, E). Para evaluar la morfología del depósito, se procesó scBAT recién aislado utilizando el procedimiento de procesamiento proporcionado combinado con un procedimiento de tinción de H&E publicado previamente¹⁹ (Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2B, el scBAT posee estructuras tisulares típicas de los depósitos de MTD y está compuesto por muchos adipocitos pequeños y multiloculares en ratones sanos postnatales y adultos. Para evaluar los niveles de expresión génica en scBAT, se extrajo ARN de depósitos aislados de scBAT utilizando los procedimientos proporcionados (Figura 3A). Los niveles de expresión de los genes de interés pueden evaluarse mediante métodos estándar de RT-qPCR (Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3B, los niveles de expresión diferencial de los genes implicados en la mediación de la función scBAT, incluido Pparg, el regulador maestro del desarrollo de las MTD; Fabp4 y Glut4, dos transportadores de nutrientes; y Ucp1 y Ppargc1a, dos genes implicados en la termogénesis, pueden determinarse fácilmente. A modo de comparación, se extrajo ARN de iBAT aislado y se evaluó la expresión de los genes mencionados anteriormente utilizando también los procedimientos proporcionados (Figura 3A). Los niveles de expresión de estos genes son relativamente similares entre estos dos depósitos. (Figura 3B).

Figura 1: Localización anatómica del scBAT y proceso de su disección. (A) Localización del scBAT en la capa intermedia del cuello. (B) La capa superficial del cuello antes y después de la extracción de la piel. Barra de escala = 250 μm. Las líneas amarillas punteadas delimitan el área que debe quedar expuesta después de hacer la incisión en forma de U. (C) Imagen del cadáver de un ratón colocado debajo de un microscopio de disección para aumentar la claridad visual durante la disección. (D,E) Imágenes representativas de la capa intermedia del cuello antes y después de la extracción de scBAT de ratones de 3 semanas y 3 meses de edad. Barra de escala = 250 μm. Las líneas amarillas punteadas delimitan los depósitos bilaterales de scBAT expuestos; n = 2. Abreviaturas: scBAT = tejido adiposo marrón supraclavicular; SFI = capa superficial; SG = glándula salival; tr = tráquea; jv = vena yugular externa; SM = músculo esquelético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Procesamiento de scBAT para la tinción de H&E. (A) Diagrama de flujo que ilustra los principales pasos del procesamiento de scBAT para la tinción de H&E. Después de diseccionar el tejido, se fija secuencialmente, se deshidrata, se incrusta, se secciona y se tiñe. (B) Imágenes representativas de scBAT teñido con H y E de ratones de 3 semanas y 3 meses de edad; n = 3 para cada etapa de desarrollo; barra de escala = 250 μm para imágenes de menor aumento; Barra de escala = 50 μm para imágenes de mayor aumento. Abreviaturas: scBAT = tejido adiposo marrón supraclavicular; PFA = paraformaldehído; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Preparación del ARN de scBAT para el análisis de expresión génica. (A) Diagrama de flujo que ilustra las etapas del aislamiento de ARN y el análisis RT-qPCR de la expresión génica de scBAT. Debido a su pequeño tamaño y textura suave, congelar rápidamente el depósito de scBAT y triturarlo en nitrógeno líquido es crucial para el aislamiento exitoso del ARN. (B) Expresión relativa de genes marcadores, incluidos Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 y Ppargc1a, en scBAT e iBAT aislados de ratones machos de 3 meses de edad, n = 5. Los datos se presentan como media ± SEM. 36B4 se utilizó como gen de mantenimiento para la normalización. Abreviaturas: scBAT = tejido adiposo marrón supraclavicular; RT-qPCR = PCR cuantitativa con transcripción inversa; LN₂ = nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este protocolo, presentamos en detalle los procedimientos para diseccionar y procesar scBAT para análisis de H&E y expresión génica. Debido a que scBAT reside en la capa intermedia del cuello y se encuentra a lo largo de las venas grandes, el aislamiento de este depósito requiere una técnica precisa. Específicamente, para obtener una visión clara del depósito, recomendamos colocar al ratón bajo un microscopio de disección después de que se haya abierto el cuello. Usando un par de pinzas de punta superfina para despegar el scBAT de la glándula salival y las venas circundantes, se debe tener cuidado para evitar perforar las venas. El sangrado excesivo puede dificultar la localización del scBAT. Para procesar scBAT para la tinción de H&E, adaptamos el uso de un protocolo publicado¹⁹ con ligeras modificaciones para incluir el uso de PFA al 4%, alcoholes deshidratantes y un solvente orgánico, tolueno, para el procesamiento de tejidos, como se muestra en la sección de protocolo. Todo el procedimiento tarda ~ 6 días en completarse, y los portaobjetos teñidos con H & E se pueden obtener imágenes al día siguiente después de completar la tinción.

La RT-qPCR que utiliza ARN como material de partida es el método más utilizado para el análisis de la expresión génica en el campo de la biología del tejido adiposo. Debido a que scBAT es un depósito de BAT relativamente pequeño en comparación con iBAT, puede ser difícil obtener suficiente ARN para la expresión génica. Para aumentar el rendimiento de ARN, recomendamos aplicar pasos secuenciales de preparación de lisado como se describe en la sección de protocolo, comenzando por pulverizar el tejido con un mortero mientras está congelado. Utilizando este método de preparación de lisado, hemos obtenido con éxito una muestra de ARN de alto rendimiento y alta calidad para el análisis de la expresión génica de scBAT de un ratón adulto. Este método de preparación de lisado también se puede aplicar para obtener lisados de proteínas de alta calidad a partir de scBAT para Western blot con el uso de tampón de lisis de proteínas.

Utilizando iBAT de ratón, los investigadores han adquirido conocimientos sustanciales sobre la función de las MTD en la termogénesis y el metabolismo. La reciente identificación de algunos depósitos de MTD previamente no reconocidos en ratones y seres humanos, incluido el scBAT, reveló la necesidad de realizar más estudios antes de que podamos comprender plenamente la contribución fisiológica de las MTD en ratones y humanos adultos. En particular, se justifican estudios que arrojen luz sobre los orígenes, las funciones y la participación de estos depósitos de MTD recién descubiertos en la termogénesis y el metabolismo regional o de todo el cuerpo.

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List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol deshidratante al 95% (Flex 95)	Epredia	8201
Alcohol deshidratante 100% (Flex 100)	Epredia	8101
Placa PCR de 96 pocillos	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum Lavado de alta rigurosidad	Bio-Rad	7326803
Aurum Lavado de baja rigurosidad	7326804		Bio-Rad
(para incrustar)	Tissue-Tek	4122
BD Aguja PrecisionGlide 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Tubos de microcentrífuga sin tapa 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrífuga	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Instrumento de PCR en tiempo real	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Medio de montaje de baja viscosidad	Epredia	83104
Agua tratada con DEPC	Ambion	AM 9906
Microscopio de disección	Nikon
Solución de dilución de DNasa	Bio-Rad	7326805
DNasa I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
solución de elución	Bio-Rad	7326801
EM 400 medio de inclusión parafina	Leica Biosystems	3801320
Eosina Y (0,5% p/v)	RICCA	2858-16
Fórmula R Medio de infiltración parafina	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxilina	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (para HCL-Etanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Casetes de incrustación	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Etanol puro de Koptec - 200 grados (para etanol al 70%	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Tubos de microcentrífuga 1,7	mL Sellos Avantor	87003-294
Microseal 'B' (sellos adhseive)	Bio-Rad	MSB1001
Microtomo	Leica Biosystems	RM2245
Grado de Biología Molecular Agua	Corning	46-000-CM
Mortero Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (para solución salina al 0,85%)	Fisher Bioreagents	BP358-212
Espectrofotómetro NanoDrop	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Baño de flotación de sección de parafina	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
Tira de tubo de PCR	Avantor	76318-802
Mortle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Mortle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Tampón de fosfato salino (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Imprimación: 36B4  (adelante) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverso) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Base de datos Chen lab Oligo Primer
: Fabp4 (reverso) 10 μ M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (imprimación directa) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen lab Base de datos de oligonucleótidos
Imprimación: Glut 4 (reverso) 10 μ M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (adelante) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Base de datos de Chen lab Oligo Imprimación
: PPARg (reserva) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverso) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (adelante) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverso) 10 μ M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			la base de datos de oligonucleótidos de Chen lab
(PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNasa Away (descontaminante de superficies)	Thermo Scientific	1437535
RNasa H NEB		M0297S
la rnasa (RNasa Out)	Invitrogen	10777019
Vial de centelleo (vidrio)	Microscopía electrónica Ciencias	72632
Banco de secado de portaobjetos	Electrotermal (Cole-Parmer)	MH6616
Gradilla de tinción de acero inoxidable	Microscopía electrónica Sciences	70312-54
Microscopio estereoscópico (para incrustación)	Olympus	SZ51
Tijeras sugicales	McKesson	43-1-104
Pinza de disección recta de punta superfina	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
Superíndice III transcriptasa inversa (incluye 5 tampones de primera cadena y DTT de 0,1 M)	Invitrogen	18080044
Jeringa SUR-VET con aguja 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (mezcla maestra de enzimas qPCR)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Juego de tinción manual de portaobjetos (frascos)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	SKU: 62540-01
Tolueno	Fisher Chemical	T324-1
Pipeta de transferencia	Avantor	414004-005
Xileno	Fisher Chemical	X3P-1GAL