El presente protocolo describe el método para establecer un modelo de ratón de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) utilizando tejido de osteosarcoma humano.
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Artículo de método
Establecimiento de un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de un paciente con tejidos de osteosarcoma humano
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El osteosarcoma es el tumor óseo maligno primario más común en niños y adolescentes. A pesar del desarrollo de nuevos planes de tratamiento en los últimos años, el pronóstico de los pacientes con osteosarcoma no ha mejorado significativamente. Por lo tanto, es crucial establecer un modelo preclínico robusto y de alta fidelidad. El modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) conserva fielmente las características genéticas, epigenéticas y heterogéneas de las neoplasias malignas humanas para cada paciente. En consecuencia, los modelos PDX se consideran auténticos modelos in vivo para el estudio de diversos cánceres en estudios de transformación. En este artículo se presenta un protocolo completo para crear y mantener un modelo de ratón PDX que refleje con precisión las características morfológicas del osteosarcoma humano. Esto implica el trasplante inmediato de tejido de osteosarcoma humano recién resecado a ratones inmunocomprometidos, seguido de un paso sucesivo. El modelo descrito sirve como plataforma para estudiar el crecimiento, la resistencia a los medicamentos, la recaída y la metástasis del osteosarcoma. Además, ayuda a seleccionar las terapias objetivo y a establecer esquemas de tratamiento personalizados.
Introducción
El osteosarcoma es una neoplasia maligna ósea primaria derivada de las células del lóbulo interóseo y es más común tanto en adolescentes como en niños. A menudo ocurre en la epífisis de la diáfisis larga y se caracteriza por una alta malignidad, metástasis tempranas y mal pronóstico 1,2. La metástasis pulmonar es la principal causa de muerte en los pacientes con osteosarcoma. La tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con osteosarcoma no metastásico es del 65%-70%3. Sin embargo, en los últimos 40 años, la tasa de supervivencia a 5 años (solo 20%) de los pacientes con osteosarcoma metastásico no ha mejorado significativamente, y el 25% de los pacientes con osteosarcoma tienen metástasis en el momento del diagnóstico4. En la actualidad, los fármacos de primera línea para el tratamiento del osteosarcoma han alcanzado un consenso, pero aún existen diferencias significativas en el régimen de quimioterapia y el tiempo de tratamiento5. Es importante realizar experimentos preclínicos basados en modelos animales apropiados para obtener regímenes de quimioterapia más efectivos.
En la actualidad, los modelos comúnmente utilizados para los experimentos preclínicos de osteosarcoma incluyen el cultivo celular in vitro basado en líneas celulares y los xenoinjertos derivados de células (CDX) in vivo, así como los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX)6,7.
Las líneas celulares son convenientes para el cultivo y para su uso en estudios in vitro , o para el trasplante en ratones inmunodeficientes para establecer modelos CDX8. Sin embargo, es posible que las líneas celulares cultivadas in vitro no reflejen con precisión la heterogeneidad de las neoplasias malignas y las características individuales de los pacientes debido a las posibles mutaciones que se producen para adaptarse al entorno de cultivo in vitro durante los pasos repetidos. Además, carecen del microambiente y el sistema inmunitario necesarios para el crecimiento y desarrollo tumoral in vivo. Si bien los modelos CDX ofrecen algunas ventajas sobre el cultivo celular in vitro , es posible que aún no reflejen completamente las características individuales de los pacientes con osteosarcoma, aunque los tejidos tumorales obtenidos a partir de modelos CDX tienen una heterogeneidad intratumoral y una representación del sistema inmunitario limitadas en comparación con las líneas celulares cultivadas in vitro9. Por lo tanto, establecer un modelo preclínico con alta fidelidad es crucial.
Los modelos PDX implican el trasplante inmediato de tejidos cancerosos humanos recién resecados en ratones inmunodeficientes. Este método permite la preservación fiel de las características genéticas, epigenéticas y heterogéneas de las neoplasias malignas humanas para cada paciente, incluso después de pases sucesivos en ratones. Además, se sabe que los modelos PDX predicen con precisión los resultados clínicos posteriores10, lo que los convierte en herramientas valiosas para crear tratamientos individualizados y avanzar en la investigación de medicina de precisión11.
En este trabajo se describe el procedimiento para establecer un modelo de PDX en ratones inmunodeficientes mediante el trasplante de tejido de osteosarcoma humano. Estos modelos sirven como plataformas para llevar a cabo experimentos preclínicos para el osteosarcoma.
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Protocolo
Todos los estudios con tejidos humanos han sido aprobados por el Comité de Revisión de Ética Institucional del Hospital Longhua, afiliado a la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (Shanghái, China) (2013LC52), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El número de IACUC para este estudio en animales es PZSHUTCM221017013. Ratones machos CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl de cuatro semanas de edad recibieron doble dieta para roedores irradiados con león GB 14924.3 y agua estéril, y se alojaron en la jaula de ratones IVC con cinco ratones por jaula, en condiciones de SPF con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. La Tabla de Materiales incluye información detallada sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.
1. Preparación del tejido de osteosarcoma humano
NOTA: En este estudio, se resecó el tejido de osteosarcoma humano12 de la lesión del fémur de un paciente con osteosarcoma de 15 años antes de la quimioterapia.
- Almacene inmediatamente el tejido de osteosarcoma recién resecado en una solución protectora de tejidos para maximizar la preservación de la activación de las células del osteosarcoma después del enjuague con solución salina fisiológica estéril.
NOTA: Los tejidos de osteosarcoma recién resecados deben trasplantarse a ratones lo antes posible. Pueden almacenarse en la solución protectora de tejidos durante un máximo de 24 horas antes del trasplante. Los tejidos de osteosarcoma que se usan para modelar deben provenir de pacientes que no hayan recibido quimioterapia. La actividad de las células tumorales de los pacientes que recibieron quimioterapia será deficiente, lo que llevará al fracaso del establecimiento del modelo y a la pérdida de la alta fidelidad. - Transfiera los tejidos de osteosarcoma recién resecados almacenados en la solución protectora de tejidos al laboratorio lo antes posible.
- Preparar instrumentos y materiales experimentales para establecer el modelo PDX: bisturíes (Figura 1A); pinzas oftálmicas (Figura 1B,C); tijera oftálmica (Figura 1D); aguja de sutura (Figura 1E); línea de sutura (Figura 1F); portaagujas recto (Figura 1G); rotulador (Figura 1H).
NOTA: Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizen en autoclave antes de usarlos. - Enjuague los tejidos del osteosarcoma dos veces con solución salina fisiológica estéril preenfriada en una capucha estéril.
- Extirpar áreas del tejido del osteosarcoma con sangrado y necrosis.
- Cortar el tejido limpio del osteosarcoma en trozos de 3 mm y3 con un bisturí en una placa de cultivo que contenga solución salina fisiológica estéril preenfriada y mantenerla en hielo.
2. Establecimiento de modelos PDX mediante trasplante de tejido de osteosarcoma en la región del flanco del ratón
- Administrar analgesia preoperatoria de meloxicam (5 mg/kg/24 h) mediante inyección subcutánea en ratones y colocar a los ratones desnudos en paños quirúrgicos estériles. Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento.
- Inducir la anestesia en ratones exponiéndolos a un 3% de isoflurano y un 97% de oxígeno. Después de que los ratones estén completamente anestesiados, transfiéralos al cono de la nariz y mantenga la anestesia con 1,5% de isoflurano y 98,5% de oxígeno.
- Pellizque los dedos de los pies para asegurarse de que los ratones estén completamente anestesiados y espere más tiempo si todavía hay espasmos o reacciones convulsivas.
NOTA: Todos los procedimientos deben llevarse a cabo utilizando equipo estéril en una capucha estéril. Evite la sequedad de los ratones durante la anestesia aplicando ungüento oftálmico en sus ojos. - Asegure el mouse en una posición de decúbito lateral (Figura 2A). Desinfecte un lado de la región del flanco del ratón para el trasplante de tejido de osteosarcoma 3 veces con rondas alternas de povidona yodada y bolas de algodón desinfectante con etanol al 70%.
NOTA: La desinfección quirúrgica se realiza en un patrón circular, comenzando en el centro y en espiral hacia afuera. - Marque el sitio de la incisión quirúrgica en la piel con un rotulador.
- Realice una incisión de 5 mm desde la piel hasta los tejidos subcutáneos con un bisturí (Figura 2B).
- Levantar la piel de la parte superior del margen de la incisión con pinzas oftálmicas con la mano izquierda y realizar una disección roma hacia arriba por debajo de la dermis de los ratones con un soporte de aguja recto con la mano derecha (Figura 2C).
- Sujete la piel de la parte superior de la incisión con las pinzas oftálmicas con la mano izquierda y coloque el tejido del osteosarcoma debajo de la piel aproximadamente 5 mm por encima del margen de la incisión con pinzas oftálmicas con la mano derecha para trasplantar el tejido del osteosarcoma (Figura 2C).
NOTA: Asegúrese de que el tejido del osteosarcoma se trasplante justo debajo de la dermis de la piel. La disección roma se realiza con unas pinzas de disección rectas y romas, como un portaagujas recto, para evitar penetrar en la cavidad torácica del ratón mientras se encuentra la capa dérmica de la piel del ratón. - Suturar la incisión con sutura reabsorbible con 2-3 puntos para una incisión de 5 mm (Figura 2D).
- Regrese a los ratones a jaulas limpias y vigílelos hasta que se recuperen por completo de la anestesia.
NOTA: La PDX establecida por el trasplante de tejido de osteosarcoma humano se designa como pasaje 0 (P0), la PDX establecida por el trasplante del tejido PDX en P0 se designa como pasaje 1 (P1), seguido de P2 y P3.
3. Recolección de tejidos tumorales PDX
- Mida el volumen del tumor una vez a la semana. Cuando el tamaño del tumor alcanza los 1500mm3, se practica la eutanasia a los ratones utilizando el método de dislocación cervical después de la inhalación de CO2 . Los criterios de valoración humanitarios incluyen la ulceración tumoral o problemas con la movilidad de las extremidades delanteras.
NOTA: Mida el diámetro largo (a) y el diámetro corto (b) del tumor con un calibrador. Calcule el volumen tumoral (V) mediante la fórmula: V = 1/2 × a ×b 2. - Coloque el ratón lateralmente para exponer el tumor y desinfecte la piel en el sitio del tumor con una bola de algodón empapada en alcohol.
- Use tijeras oftálmicas para separar todo el tumor. Pesar la masa tumoral con una báscula electrónica.
4. Examen anatomopatológico de los tejidos tumorales clínicos primarios y PDX
- Fijar los tejidos tumorales13 en un tubo de 50 mL que contenga 30 mL de solución de formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h. Enjuague bien los tejidos tumorales con agua corriente para eliminar el fijador.
- Deshidratar e incrustar los tejidos tumorales en parafina14.
- Cortar los tejidos tumorales y realizar el examen histológico de rutina15.
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Resultados
Este protocolo describe el procedimiento detallado para establecer un modelo de ratón PDX, que conserva las características morfológicas del osteosarcoma humano después del trasplante inmediato de tejido de osteosarcoma humano recién resecado y los pasajes sucesivos en ratones. Aquí, se estableció con éxito un modelo de ratón PDX utilizando tejido de osteosarcoma humano.
La figura 3A muestra un ratón representativo de PDX en P0, dos meses después del trasplante de...
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Discusión
Los modelos PDX pueden simular las características de los cánceres humanos y conservar más similitud con el tumor primario, incluyendo alteraciones genéticas y genómicas, histología, heterogeneidad y perfil de expresión génica 16,17,18,19. Por lo tanto, preservan los fenotipos moleculares y genotipos de los pacientes con cáncer, proporcionando enfoques innovado...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de (1) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408); (2) Proyecto de construcción del Centro de Investigación de Alta Prioridad de Shanghái (2022ZZ01009); (3) Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFE0201600); (4) Centro de Innovación Colaborativa de Shanghái de Transformación Industrial de Preparación de MTC Hospitalaria y (5) Proyectos de Investigación dentro del Presupuesto de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (2021LK047).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución neutra en formalina al 10% | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1101-500ml | Arreglar los tejidos |
| Autoclave | Japan Hiryama Company | HVE-50 | Esterilización de instrumentos quirúrgicos |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | |
| Calibre de | Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. | 034180A | Medir el volumen del tumor |
| Plato (60 mm) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 430166, Corning | Colocación de muestras durante el trasplante |
| Bolas de algodón desinfectantes | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Desinfectar la piel de los ratones |
| Guantes estériles desechables | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | Operación estéril |
| Dieta de roedores irradiados de león doble | Suzhou Shuangshi Tecnología de alimentación animal experimental Co., Ltd. | GB 14924.3 | Alimentación animal |
| Báscula electrónica | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 1-2000 | Pesar el peso del tumor |
| Eosina | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | E4009-25G | Hematoxilina eosina tinción |
| Hematoxilina | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | H3136-25G | Hematoxilina eosina tinción |
| Isoflurano | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anestesia de ratón |
| Jaula de ratones IVC | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | Barrera animal |
| Mark bolígrafo | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Marcar la incisión quirúrgica |
| Microscopio óptico Olympus | Compañía japonesa Olympus | BH20 | Escanear cortes de tejido |
| Ungüento oftálmico | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL | Evite los ojos secos de los ratones durante la anestesia |
| Tijeras oftálmicas | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Cortar la piel |
| Pinzas oftálmicas | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Sostener tejidos de osteosarcoma durante el trasplante |
| Parafina | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. | 80200-0015 | parafina de tejido de osteosarcoma enterrado |
| Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd. | RM2235 | Sección de tejido de osteosarcoma | |
| solución salina fisiológica | Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. | 605-004057 | Enjuague y almacenamiento temporal de bisturíes de tejido de osteosarcoma |
| Fábrica de instrumentos quirúrgicos de Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Separación del tejido del osteosarcoma y realización de incisiones quirúrgicas | |
| Campana estéril | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Mesa de operaciones |
| quirúrgicas paños quirúrgicos estériles | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | Proporcionar un área de cirugía estéril |
| Soporte de aguja recto | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | Sutura la |
| herida Línea de sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Sutura la herida |
| Aguja de sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Sutura la herida |
| Solución protectora de tejidos | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., Ltd | BC-CFM-03 | Mantener la actividad de las células tisulares |
| Tubo (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Instalar solución de fijación de formalina |
Referencias
- Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4(2018).
- Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772(2021).
- Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045(2019).
- Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352(2021).
- Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
- Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
- Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
- Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
- Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41(2022).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
- Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5(2017).
- Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
- Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162(2023).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
- de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
- Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
- Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
- Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206(2022).
- Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63(2022).
- Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911(2022).
- Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
- Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).
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