Cuantificación de la columna dendrítica mediante un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensional

Las espinas dendríticas son protuberancias de las dendritas, que a menudo comprenden el sitio postsináptico de las sinapsis glutamatérgicas ^1,2. Las espinas dendríticas son de particular interés en el campo de la plasticidad sináptica. Las espinas a menudo se alteran cuando cambia la fuerza sináptica, volviéndose más grandes y fuertes en la potenciación sináptica a largo plazo o más pequeñas y débiles en la depresión sináptica a largo plazo 3,4,5,6,7. Más allá de la plasticidad sináptica, el perfil de las espinas dendríticas cambia a lo largo de la vida. En el desarrollo temprano, hay un período de formación y crecimiento de la espina dendrítica, seguido de poda de la espina dendrítica hasta alcanzar un estado estacionario ^8,9,10. En el cerebro envejecido, la pérdida de la columna vertebral acompaña a la contracción del cerebro^{y al deterioro} cognitivo. Además, muchos trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos se caracterizan por espinas dendríticas aberrantes. Múltiples regiones cerebrales en individuos afectados con esquizofrenia tienen menos espinas dendríticas, probablemente como resultado de la poda sináptica alterada¹². Los trastornos del espectro autista también se caracterizan por patologías dendríticas de la columna^{vertebral 13}. La pérdida de la columna dendrítica es un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Parkinson^14,15. Dada la amplia gama de temas de investigación que abarcan las propiedades de la espina dendrítica, las técnicas para la cuantificación precisa de la columna vertebral son de suma importancia.

La tinción, es decir, el método de Golgi, o el marcaje de neuronas mediante relleno de colorante o la expresión de proteínas fluorescentes son métodos comunes para la visualización de la columna dendrítica 16,17,18. Una vez visualizadas, las espinas se pueden analizar con una variedad de clientes de software gratuitos y disponibles comercialmente. El resultado deseado del análisis es un factor importante para determinar qué software será más útil. Fiji es una opción de software viable para preguntas centradas en la densidad de la espina dendrítica. Sin embargo, esta técnica se basa en gran medida en el recuento manual que requiere mucho tiempo y que puede introducir el potencial de sesgo. Nuevos complementos como SpineJ permiten la cuantificación automática, lo que también permite un análisis más preciso del cuello de la columna^{vertebral 19}. Un inconveniente de estos enfoques es la pérdida de un análisis tridimensional para determinar el volumen del lomo, ya que SpineJ se limita a pilas de imágenes bidimensionales. Además, obtener información sobre los subtipos de columna vertebral se vuelve un desafío a través de estos procesos. Los cuatro subtipos de espinas predominantes, delgada, seta, rechoncha y filopodio, connotan funciones individuales y se clasifican en gran medida a través de la morfología²⁰. Las espinas delgadas se caracterizan por un cuello alargado y una cabeza definida²¹. Las espinas de los hongos tienen una cabeza de espina mucho más grande y pronunciada²². Las espinas rechonchas son cortas y tienen poca variación entre la cabeza y el cuello²³. Los filopodios son espinas inmaduras con un cuello largo y delgado y sin cabeza obviamente observable²⁴. Si bien la clasificación proporciona información valiosa, las espinas existen en un continuo de dimensiones. La clasificación en categorías se basa en rangos de medidas morfológicas^25,26. La medición manual de los lomos para la clasificación agrava la carga logística para los investigadores en este enfoque.

Otras opciones de software que se centran específicamente en el análisis tridimensional de la columna dendrítica son más adecuadas para las investigaciones sobre el volumen de la columna vertebral y las propiedades del subtipo 27,28,29,30,31. A pesar de la dificultad que presenta el análisis tridimensional, como la mala resolución del plano z y el frotis, estas opciones de software permiten una reconstrucción tridimensional fiable de las dendritas y las espinas dendríticas de forma semiautomatizada guiada por el usuario. La clasificación automática de las espinas identificadas en sus subtipos también es una característica presente en algunos de estos paquetes de software de análisis de espinas. Esto puede mejorar las preocupaciones sobre la posible carga de trabajo y el sesgo experimental. Neurolucida 360 es un software disponible en el mercado que permite la identificación y clasificación tridimensional fiable y reproducible de la columna dendrítica³². Aquí, presentamos un protocolo integral para preparar de manera efectiva el tejido fijo, adquirir imágenes y, en última instancia, cuantificar y clasificar las espinas dendríticas utilizando este software.

Todos los procedimientos con animales siguieron las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. sobre el uso de animales en la investigación intramuros y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental.

1. Preparación de rodajas fijas del hipocampo

1. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina (ketamina: 100 mg/kg; Xilacina: 8 mg/kg). Validar la anestesia mediante un pellizco de cola y fijar el ratón a la placa de perfusión.
2. Con unas tijeras quirúrgicas grandes, retire la piel y el pelaje del pecho, lo que permite una visualización más fácil de la caja torácica subyacente.
3. Haz un corte horizontal por debajo del ancho de la caja torácica, evitando el hígado y el diafragma. Con pinzas finas, tire de la apófisis xifoides hacia arriba y corte cada lado lateral de la caja torácica. Levante la caja torácica hasta la región del cuello y sujétela en su lugar con pinzas hemostáticas.
4. Inserte una aguja de mariposa de 21 g en el ventrículo izquierdo del corazón y comience a perfundir con 1x PBS a temperatura ambiente a aproximadamente 5 mL/min. Haz una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras quirúrgicas pequeñas. Perfundir con PBS hasta que la solución que sale de la aurícula salga clara.
5. Apague la bomba de perfusión para asegurarse de que no entren burbujas en el tubo. Coloque el tubo de PBS en paraformaldehído (PFA) al 4% helado en PBS. Perfundir con PFA a una velocidad de 5 mL/min hasta que el animal esté completamente endurecido, aproximadamente 25 mL.
   NOTA: Asegúrese de que el PFA esté fresco (no más de 1 semana si el caldo se almacena a 4 ° C) para una fijación óptima.
6. Retire la piel de la superficie del cráneo con unas tijeras quirúrgicas pequeñas. Haz una incisión en la mitad del sagital con unas tijeras quirúrgicas pequeñas a lo largo de la fisura central del cráneo. Realizar cortes laterales rostrales al bulbo olfatorio y sobre el cerebelo.
7. Abrir el cráneo con pinzas finas para exponer el cerebro. Con una espátula, saque el cerebro suavemente de los bulbos olfativos y colóquelo en PFA al 4% en PBS durante la noche.
   NOTA: Para un protocolo más completo de perfusión de roedores, consulte Gage et ^al.33.
8. Crioproteja el cerebro fijo reemplazando el PFA al 4% con sacarosa al 15% en PBS durante 1 día. Después de esto, reemplace el 15% de sacarosa con el 30% de sacarosa en la solución de PBS durante 1 día hasta que el cerebro se hunda en la solución.
9. Retire el cerebro de la solución de sacarosa y colóquelo en una placa de Petri con PBS. Corta el cerebelo y el bulbo olfatorio con una hoja de bisturí.
10. Coloque una pequeña cantidad, de 1-2 cm de diámetro, de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la superficie del soporte de la muestra. Monte el cerebro coronalmente al portamuestras con la superficie de corte caudal en la OCT. Congele rápidamente el cerebro colocando el portamuestras en hielo seco pulverizado hasta que esté visiblemente congelado, aproximadamente 5-7 min.
11. Asegúrese de que el ángulo de la cuchilla del criostato esté entre 0° y 5° para producir secciones uniformes. Ajuste el ángulo de la placa del rodillo para un aplanamiento óptimo de las rebanadas. Consulte el manual del equipo para obtener instrucciones específicas.
12. Coloque el portamuestras en el criostato con la superficie ventral del cerebro más cerca de la cuchilla. Cortar el cerebro en secciones dorsales del hipocampo de 30 μm, desechando todas las rodajas rostrales del hipocampo.
    NOTA: Esta parte del protocolo se puede adaptar a cualquier región del cerebro que se desee. Los pasos 1.9-1.12 cambiarían en función de la región de interés.
13. Transfiera las rodajas del hipocampo dorsal a PBS. Con un pincel, monte suavemente las secciones del hipocampo en un portaobjetos de microscopio. Elimine el exceso de solución con bastoncillos de algodón o toallitas delicadas.
14. Aplique 100 μL de medio de montaje rígido al portaobjetos del microscopio cubriendo todos los cortes de cerebro. Para evitar burbujas, baje el cubreobjetos lentamente con pinzas sobre el medio de montaje. Si se forman burbujas, golpee suavemente el cubreobjetos con pinzas para permitir que escapen. Deje que las diapositivas se asienten durante la noche antes de tomar imágenes.

2. Imágenes confocales de alta resolución

1. Utilice oculares de bajo aumento para identificar las células fluorescentes. Cambie a un objetivo de 63x (NA = 1.4) o superior, aplicando el medio de inmersión adecuado al objetivo.
   NOTA: Para obtener los mejores resultados, utilice un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de 63x o más.
2. Identifique segmentos dendríticos bien etiquetados con superposición limitada para la adquisición de imágenes. Ajuste la potencia y la ganancia del láser para garantizar que las dendritas fluorescentes no estén saturadas. Además, la reducción de la velocidad de escaneo puede proporcionar una mejor resolución de imagen.
3. Adquiera pilas z que abarquen los segmentos dendríticos completos para análisis futuros. Las pilas Z mayores de 10 μm no son deseables debido al potencial adicional de superposición dendrítica en el plano z.
   NOTA: Utilice el tamaño de paso z más pequeño disponible (0,2-0,7 μm) y 1 tamaño de orificio de unidad aireado. El tamaño de paso más pequeño da como resultado más imágenes en la pila z, lo que compensa la resolución Z limitada de muchos microscopios.
4. Opcional: Si está disponible, utilice la funcionalidad del software de deconvolución respectiva del microscopio para desconvolucionar las imágenes. Esto permitirá imágenes de mayor resolución.

3. Cuantificación de la espina dendrítica

1. Abra Neurolucida 360 (v2022.1.1 o posterior). Abra el archivo de imagen en el software de análisis de columna vertebral (Archivo > Abrir > imagen). Asegúrese de que el archivo de imagen esté visible en la ventana principal y en el entorno 3D. Si no aparece la ventana del entorno 3D , haga clic con el botón izquierdo en Entorno 3D en la barra de herramientas superior de la ventana principal en la pestaña Trazado (Figura complementaria 1)
   NOTA: Esta sección del protocolo se puede adaptar para cualquier imagen dendrítica, no exclusivamente para dendritas de tejido de ratón.
2. En la pestaña Cambiar visualización de imagen de la ventana Entorno 3D, asegúrese de que la imagen se muestre como volumen 3D en el cuadro Mostrar imagen como . En el cuadro Configuración de pila de imágenes de la pestaña Imagen , seleccione Proyección máxima en el menú desplegable Mostrar superficie como . (Figura complementaria 2)
3. Identificar un segmento dendrítico adecuado para el trazado.
   1. Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta Mover punto de pivote en la barra de herramientas superior de la ventana Entorno 3D . Haga clic con el botón izquierdo en la dendrita deseada para establecer un nuevo punto de pivote. Esto cambiará la orientación para permitir un acercamiento efectivo.
   2. Restablezca la orientación original haciendo clic con el botón izquierdo en el icono Restablecer orientación . Después de establecer el punto de pivote, haga clic con el botón izquierdo en la herramienta Mover punto de pivote para comenzar a trazar la dendrita. (Figura complementaria 2).
      NOTA: La dendrita ideal es aquella con una superposición limitada con otras dendritas en cualquiera de los planos de coordenadas y que no se intersecta con otra dendrita o superficial con otra por debajo. Las dendritas en baja proximidad a otras en el plano XY también son preferibles para evitar la asignación inapropiada de las espinas vecinas a la dendrita trazada. También debe tenerse en cuenta que las dendritas de diferentes grosores, órdenes y distancias al soma tienen diferentes densidades de espinas dendríticas^34,35. Esto debe tenerse en cuenta en el diseño experimental. Las dendritas de orden secundario <1,5 μm de espesor son candidatas ideales para el trazado (Figura 1).
4. Haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Árbol de la ventana Entorno 3D . Haga clic con el botón izquierdo en Guiado por el usuario para el modo de rastreo y Kernels direccionales como método en Opciones de rastreo guiado por el usuario.
5. Haga clic con el botón izquierdo en la dendrita cuando aparezca un núcleo circular para comenzar el trazado. Mueva el cursor a lo largo del segmento dendrítico. Esto llenará los kernels automáticamente. Si los kernels no se rellenan automáticamente, consulte el paso 3.51.
   1. Mueva suavemente el cursor hacia adelante y hacia atrás en la dendrita hasta que los granos se llenen. Haga clic con el botón izquierdo para conservar los kernels detectados existentes. Si los kernels dejan de llenarse, haga clic con el botón izquierdo cuando un kernel se llene más abajo en la dendrita para colocar uno manualmente. Haga clic con el botón derecho para finalizar el seguimiento. Asegúrese de que la dendrita trazada tenga un mínimo de 7 μm de longitud (Figura complementaria 3).
6. Verifique la precisión del trazado dendrítico utilizando las tres direcciones del entorno 3D, cabeceo, guiñada y balanceo, haciendo clic con el botón izquierdo y arrastrando la ventana del entorno 3D . Identifique los puntos donde el trazado dendrítico está fuera de la ubicación apropiada en la dendrita. Puede haber casos en los que se vea trazado con precisión de arriba hacia abajo, pero en la dimensión z, los puntos no están en la dendrita (Figura 2).
7. Para corregir segmentos dendríticos trazados incorrectamente, haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Editar dentro del menú Árbol . Haga clic con el botón izquierdo en la dendrita de interés y, a continuación, haga clic con el botón izquierdo en Puntos.
8. Mueva los puntos colocados incorrectamente hacia el segmento de dendrita haciendo clic y arrastrando. Para eliminar puntos superfluos, haga clic con el botón izquierdo en el punto y haga clic en el botón Eliminar . Modifique el tamaño de los puntos si la dendrita no está adecuadamente llena. Para modificar el tamaño del punto, haga clic con el botón izquierdo en un punto y ajuste el control deslizante de grosor para cambiar el tamaño (Figura complementaria 4).
   NOTA: Las dendritas inadecuadamente rellenas pueden resultar en la identificación de espinas falsas que son componentes del segmento dendrítico. Por el contrario, el llenado excesivo de dendritas puede oscurecer las espinas verdaderas.
9. Repita los pasos 3.3-3.8 para varias dendritas en la imagen antes de continuar con la identificación de la columna vertebral en el paso 3.10.
10. Haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Lomo de la ventana Entorno 3D. Establezca la configuración de detección para el rango exterior, la altura mínima y el recuento mínimo de vóxeles. Dependiendo de la preparación, puede ser necesario modificar los valores preestablecidos en caso de una justificación clara y específica de los cambios. Las condiciones preestablecidas son Rango exterior: 2,5 μm, Altura mínima: 0,3 μm, Recuento mínimo de vóxeles: 10 vóxeles.
    NOTA: Las diferentes preparaciones, como los cultivos celulares frente a los tejidos agudos, así como los diferentes puntos de tiempo de desarrollo, requerirán diferentes criterios que deben derivarse de la literatura existente. También es vital tener en cuenta que alterar la configuración de detección puede alterar significativamente los resultados. Por ejemplo, una altura mínima más alta puede excluir espinas cortas. La configuración de detección debe permanecer constante durante todo el transcurso del experimento.
11. Establezca la sensibilidad del detector en 70% y haga clic con el botón izquierdo en Detectar todo. Esto poblará las espinas identificadas por esta sensibilidad del detector en todas las dendritas. Si desea seleccionar espinas de una manera específica para la dendrita, haga clic con el botón izquierdo en la casilla Haga clic en la imagen para detectar todas las ramas más cercanas y haga clic con el botón izquierdo en cada dendrita manualmente con diferentes sensibilidades del detector.
    NOTA: En esta etapa es normal que no todas las espinas dendríticas se pueblen. Del mismo modo, los no espinosos pueden poblarse incorrectamente. La sensibilidad inicial del 70% también es flexible; Esto puede cambiar dependiendo de la preparación.
12. Examine las espinas seleccionadas por la sensibilidad de este detector haciendo clic y arrastrando la dendrita en las tres direcciones. Si la mayoría de las espinas detectadas no están completamente llenas, continúe con el paso 3.12.1. Si las espinas que se han detectado están sobrellenas, continúe con el paso 3.12.2. Si las espinas detectadas parecen estar adecuadamente llenas, continúe con el paso 3.13.
    1. Aumente la sensibilidad del detector entre un 5% y un 10% y vuelva a hacer clic con el botón izquierdo en Detectar todo. Esto reemplazará todas las espinas detectadas anteriormente por otras nuevas con una sensibilidad más alta. Repita según sea necesario hasta que las espinas detectadas estén adecuadamente llenas.
    2. Disminuya la sensibilidad del detector entre un 5% y un 10% y vuelva a hacer clic con el botón izquierdo en Detectar todo . Esto reemplazará todas las espinas detectadas anteriormente por otras nuevas con menor sensibilidad. Repita según sea necesario hasta que las espinas detectadas estén adecuadamente llenas.
13. Haga clic con el botón izquierdo en Mantener lomos existentes en la pestaña Lomo del entorno 3D. Si se ha seleccionado Hacer clic en la imagen para detectar todo en la rama más cercana , anule la selección.
    NOTA: Al marcar Mantener espinas existentes , se asegura de que las espinas dendríticas recién identificadas manualmente no sobrescriban las espinas identificadas anteriormente. Asegúrese de que esta casilla esté seleccionada antes de continuar para no sobrescribir el trabajo anterior.
14. Haga clic con el botón izquierdo en Mover punto de pivote y haga clic con el botón izquierdo en la dendrita, lo que requiere una mayor detección de la columna vertebral para establecer el punto de pivote.
    1. Anule la selección de Mover punto de pivote. Identificar una espina dendrítica sin relleno. Aumente la sensibilidad del detector entre un 10% y un 20% más allá de la detección anterior y haga clic con el botón izquierdo en el lomo. Si el lomo detectado está subllenado o sobrellenado, continúe con el paso 3.14.3 o 3.14.4. Si el lomo no se rellena, aparecerá el mensaje No se puede detectar un lomo en la ubicación seleccionada. En este caso, continúe con el paso 3.14.2.
    2. Aumente la sensibilidad del detector de forma incremental, posiblemente por encima del 100%, hasta que el lomo se haya detectado y llenado adecuadamente. Si se detecta el lomo pero no se ha llenado adecuadamente, continúe con el paso 3.14.3. Si el lomo está sobrellenado, continúe con el paso 3.14.4 (Figura 3).
    3. Haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Editar y haga clic con el botón izquierdo en el lomo sublleno. Haga clic con el botón izquierdo en Eliminar. Anule la selección de la pestaña Editar . Aumente la sensibilidad en un 5%-10% y haga clic con el botón izquierdo en el lomo. Repita este paso si el lomo aún está sublleno.
    4. Haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Editar y haga clic con el botón izquierdo en el lomo sobrecargado. Haga clic con el botón izquierdo en Eliminar. Anule la selección de la pestaña Editar . Disminuya la sensibilidad en un 5%-10% y haga clic en el lomo. Repita este paso si la columna aún está demasiado llena.
15. Repita los pasos 3.14-3.14.4 hasta que se hayan detectado todas las espinas identificadas por identificación visual. Vuelva a verificar la dendrita en busca de espinas que pertenezcan a dendritas vecinas, espinas falsas que no correspondan a ninguna señal verdadera o segmentos potenciales de dendrita etiquetados erróneamente como una columna vertebral. Elimine estos espinazos falsos con la función Eliminar .
16. Examina las espinas identificadas en la dendrita. En algunos casos, pueden aparecer múltiples espinas como una columna vertebral de conglomerado. Si un lomo parece abarcar dos, haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Editar . Haga clic con el botón izquierdo en el lomo y haga clic con el botón izquierdo en Ocultar selección. Después de confirmar un lomo de conglomerado, en la pestaña Editar , haga clic con el botón izquierdo en Mostrar selección y seleccione Dividir. Si hay más de dos espinas en un conglomerado, puede ser necesario repetir este paso (Figura 4).
    NOTA: Si la columna vertebral del conglomerado no se divide después del paso 3.16, retire la columna vertebral. A continuación, seleccione la columna vertebral más intensa del conglomerado con una sensibilidad más baja. Una vez que se haya llenado la columna más intensa, aumente la sensibilidad para seleccionar la otra columna sin relleno. Alternativamente, eliminar la columna vertebral del conglomerado y luego aumentar la sensibilidad puede permitir una división adecuada.
17. Una vez detectadas y rellenadas correctamente todas las espinas visualmente identificables, en la pestaña Espina , haga clic con el botón izquierdo en Clasificar todo para clasificar las espinas en cuatro subtipos: delgadas, seta, rechonchos y filopodios (Figura 5).
    NOTA: Los parámetros de clasificación del lomo se pueden cambiar en la ventana Configuración del cuadro Clasificación en la pestaña Espina . Al igual que con la configuración del detector, se recomienda encarecidamente una justificación clara para modificar los parámetros existentes. Los valores preestablecidos son la relación cabeza-cuello: 1,1, la relación longitud-cabeza: 2,5, el tamaño de la cabeza del hongo: 0,35 μm, la longitud del filopodio: 3 μm.
18. En la barra de herramientas superior de la ventana Entorno 3D, seleccione Guardar y ver en Neurolucida Explorer. Neurolucida Explorer es donde se recopilan los datos de los trazados. El trabajo se guardará como un archivo de .dat que contiene todos los trazos y lomos.
19. En la ventana del Explorador, en la pestaña Vista , haga clic con el botón izquierdo en Seleccionar todo para resaltar todas las dendritas y espinas.
20. Haga clic con el botón izquierdo en la pestaña Analizar de la barra de herramientas superior. Haga clic con el botón izquierdo en el menú desplegable Estructura . Haga clic con el botón izquierdo en Análisis de estructura ramificada.
21. Dependiendo de las variables de interés, se puede seleccionar cualquiera de los análisis. Los dos más útiles para las preguntas centradas en la densidad de la columna vertebral y el volumen promedio de la columna vertebral son Cada árbol > cada dendrita y Espinas > detalles de la columna vertebral. Seleccione Aceptar y los datos aparecerán en dos ventanas separadas.
22. Copie los datos en una hoja de cálculo para su posterior compilación y análisis.
    NOTA: El árbol individual estará separado por dendrita, pero el volumen de la columna no lo estará. Con la función de ordenación de la hoja de cálculo, los detalles del lomo se pueden filtrar por características.

La utilización efectiva de este método de análisis comienza con la selección de segmentos dendríticos para el rastreo. Como se describe en la Figura 1, las dendritas ideales para el rastreo no están muy cerca de otras dendritas. Las dendritas que corren en paralelo pueden resultar en la identificación incorrecta de las espinas de una dendrita vecina. Las dendritas que se cruzan directamente o corren perpendiculares en un plano z diferente también agregan una dificultad significativa para el trazado dendrítico preciso. También es importante tener en cuenta las diferencias en el grosor de las dendritas. Como se informó anteriormente, existen diferencias clave en la densidad de la espina con dendritas de diferente grosor36. También puede haber diferencias en la misma dendrita con una mayor distancia desde el punto de ramificación37. El rastreo de dendritas del mismo orden y grosor, idealmente con orígenes de puntos de ramificación similares, puede controlar la heterogeneidad existente de la densidad de la espina dendrítica. La identificación del punto de ramificación en algunas preparaciones puede resultar inviable, pero el grosor de la dendrita siempre debe ser un factor controlable en el trazado de las dendritas. El trazado preciso de los segmentos dendríticos es vital para obtener resultados precisos de este análisis. Es necesario asegurarse de que todos los puntos de la dendrita trazada estén realmente dentro de la dendrita. Ver la dendrita tridimensional desde diferentes direcciones puede ayudar con este proceso. Como se muestra en la Figura 2A, B, la vista de arriba hacia abajo muestra lo que parece ser una dendrita trazada correctamente. En la vista lateral; Sin embargo, numerosos puntos no se encuentran en la propia dendrita. Estos problemas no están presentes en la vista lateral de la Figura 2C. También es vital asegurarse de que las dendritas se llenen correctamente durante el trazado. Una dendrita que está subllena puede dar lugar a que los trozos de dendritas se identifiquen incorrectamente como espinas. Una dendrita que está sobrellena puede impedir que se identifiquen las espinas verdaderas debido al umbral de altura mínima. Esta evaluación manual del trazado guiado por el usuario es fundamental para permitir un análisis preciso de la columna dendrítica.

La identificación de las espinas dendríticas también requiere un enfoque guiado por el usuario. El uso de la función "Detectar todo" para establecer el umbral uniforme de sensibilidad del detector es inadecuado por numerosas razones. El uso de la función "Detectar todo" es útil para identificar las espinas más evidentes, pero el llenado de estas espinas debe verificarse para verificarlo. Las espinas identificadas con la inicial "Detectar todo" pueden estar subllenas. Para corregir esto, la columna vertebral identificada debe eliminarse individualmente y luego volver a identificarse manualmente con una sensibilidad de detector más alta (Figura 3A-C). Esto asegura que la columna vertebral esté adecuadamente llena. Existe una heterogeneidad sustancial en la sensibilidad del detector requerida para las espinas que debe tenerse en cuenta manualmente. El aumento de la sensibilidad del detector para detectar todo puede dar lugar a espinas demasiado llenas, que también requieren corrección manual (Figura 3D). Un problema adicional con la sensibilidad inadecuada del detector es la creación inapropiada de una columna vertebral conglomerada, una columna dendrítica llena que abarca múltiples espinas. Dos espinas muy próximas entre sí pueden fusionarse incorrectamente en una espina de conglomerado (Figura 4A,B). El software de detección de espinas tiene una función de "división", que se puede utilizar para separar las espinas que se han fusionado por sobrellenado. La función "Split" permite que las espinas individuales se generen fácilmente a partir de la espina del conglomerado (Figura 4C). El trazado preciso de las dendritas y el relleno de la columna dendrítica permiten una clasificación precisa en subtipos de la columna vertebral. La clasificación de las espinas se basa en la morfología de las espinas rellenas y la distancia de las dendritas, por lo que cada paso del proceso desempeña un papel en la clasificación morfológica (Figura 5).

Debido a la necesidad de selección manual y umbrales, es crucial seguir un estándar uniforme para todos los análisis. Esto es especialmente pertinente si varios usuarios contribuyen al análisis de datos. Para asegurarse de que todos los investigadores que realizan análisis siguen el mismo estándar, los investigadores deben comparar los datos de las mismas dendritas trazadas. Esto puede reducir el potencial de sesgo del experimentador al garantizar que cada investigador identifique las espinas en función de criterios compartidos y uniformes de manera ciega. También existe la posibilidad de que un solo investigador sesgue entre días o incluso en el mismo día debido a la fatiga. Esto debe ser monitoreado a lo largo de todo el proceso de análisis de datos. Para garantizar aún más la validez del análisis, la comparación de los resultados iniciales con los publicados en la literatura garantiza que el protocolo se está siguiendo de manera efectiva. Es fundamental tener en cuenta que esta comparación solo será efectiva si se comparten la preparación y los parámetros. Las diferencias en la tinción, la adquisición de señales fluorescentes, el orden y el grosor de las dendritas o la región del cerebro pueden contribuir a diferentes resultados 8,36. En el caso de que falten resultados publicados, el uso de varios investigadores para validar la identificación de la columna vertebral permite aumentar la confianza en la fiabilidad y reproducibilidad del análisis. En este manuscrito se ha incluido una carpeta de análisis suplementaria. Esta carpeta contiene archivos de imágenes de muestra de segmentos dendríticos, dendritas trazadas, dendritas trazadas con espinas identificadas y clasificadas, y salida de datos (Tabla Suplementaria 1, Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3 y Archivo Suplementario 4). Los nuevos usuarios pueden entrenarse en este conjunto de datos para practicar los procedimientos descritos en este documento. Los resultados generados por el usuario dentro del 10% del conjunto de datos de muestra proporcionado se consideran aceptables para reproducir el estándar de análisis. Debido a los criterios potencialmente subjetivos de una columna vertebral completamente llena y la necesidad de un examen manual de las espinas detectadas automáticamente, la variación entre y dentro de los investigadores es una parte normal del análisis. En caso de que los resultados generados superen ese umbral; Sin embargo, se debe realizar una comparación lado a lado para determinar los casos de diferentes volúmenes de espinas, así como las espinas incluidas o excluidas incorrectamente. A continuación, el conjunto de datos de muestra se puede volver a analizar hasta que se alcance el umbral aceptable.

Figura 1: Selección de dendritas para el análisis de la espina dendrítica. (A) Visualización en volumen 3D de imágenes confocales de pila z tomadas de dendritas proximales CA1 en la línea de ratones transgénicos THY1-YFP. Nótese la heterogeneidad del orden de las dendritas, con dendritas primarias más gruesas en óvalos azules y dendritas más delgadas, secundarias y terciarias en óvalos rosados. (B) Los candidatos ideales para el trazado de dendritas se indican con óvalos verdes. Tenga en cuenta el grosor y las intersecciones limitadas, las superposiciones y la proximidad a otras dendritas. El óvalo rojo denota segmentos dendríticos que deben evitarse para el trazado dendrítico debido a las altas intersecciones, superposiciones y proximidad a otras dendritas. Las dendritas primarias más gruesas tampoco son candidatas adecuadas para el rastreo. Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Trazado preciso de segmentos dendríticos. (A) Visualización en volumen 3D de imágenes confocales de pila z tomadas de dendritas proximales CA1 en la línea de ratones transgénicos THY1-YFP para ser trazadas a través del método de kernel direccional guiado por el usuario. Barra de escala = 10 μm. (B) Ejemplo de trazado deficiente de dendritas. La dendrita parece estar trazada correctamente en la vista de arriba hacia abajo. La vista lateral muestra que la dendrita está incorrectamente llena de puntos que se desvían de la dendrita. (C) Ejemplo de un trazado adecuado de dendritas. La vista de arriba hacia abajo parece similar a la B, pero la vista lateral difiere sustancialmente. La dendrita en C se traza correctamente, como lo indica, al estar completamente llena sin desviaciones de la dendrita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Llenado preciso de espinas dendríticas mediante selección manual. (A) Visualización en volumen 3D de imágenes confocales de pila z tomadas de dendritas proximales CA1 en la línea de ratón transgénico THY1-YFP de una columna vertebral en espera de detección manual. Barra de escala = 0,5 μm. (B) Ejemplo de una espina dendrítica poco rellena. Todavía hay una señal fluorescente sustancial visible debido a un llenado incompleto. (C) Ejemplo de una espina dendrítica debidamente llena. La presencia de una "corona" de señal apenas visible alrededor del exterior del relleno es el estándar para rellenar con precisión las espinas dendríticas. (D) Ejemplo de una espina dendrítica sobrellena. La sensibilidad del detector es demasiado alta, lo que da como resultado un lomo demasiado lleno. El relleno ha traspasado los límites de la fluorescencia y tiene una corona casi imperceptible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: División de las espinas dendríticas del conglomerado. (A) Visualización en volumen 3D de imágenes confocales de pila z tomadas de dendritas proximales CA1 en la línea de ratones transgénicos THY1-YFP con dos espinas muy próximas. Barra de escala = 0,15 μm. (B) Un ejemplo de dos espinas independientes rellenadas incorrectamente como una espina dendrítica conglomerada. (C) Siguiendo el uso de la función "Dividir", la espina del conglomerado se divide en dos espinas dendríticas distintas debidamente llenas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Identificación de la espina dendrítica y clasificación en subtipos. (A) Visualización en volumen 3D de imágenes confocales de pila z tomadas de dendritas proximales CA1 en la línea de ratones transgénicos THY1-YFP de un segmento dendrítico trazado aislado para la cuantificación y clasificación de la espina dendrítica. Barra de escamas = 5 μm. (B) Segmento dendrítico trazado con todas las espinas dendríticas identificadas y examinadas para asegurar el llenado y la división adecuados. El software asigna arbitrariamente colores a las espinas identificadas en este paso. (C) Clasificación de todas las espinas dendríticas identificadas en subtipos utilizando parámetros definidos en el software. Azul = champiñón, amarillo = delgado y verde = rechoncho. Los filopodios no están presentes debido a la edad de este tejido. (D) Imágenes representativas de espinas en forma de hongo, delgadas y rechonchos sin rellenar (arriba) y llenas (abajo). Barra de escala = 0,3 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Acceso al entorno 3D. Pila Z de imágenes confocales visualizadas en la interfaz del software. La navegación del entorno 3D desde la pestaña Trazado en el visor principal se ha resaltado en amarillo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Parámetros de imagen y configuración de orientación para el entorno 3D. Visor de entorno 3D para imágenes confocales z-stack. Los parámetros de la pestaña Mostrar imagen de cambio resaltada indicada por flechas amarillas se establecen en Mostrar imagen como: Volumen 3D y Mostrar superficie como: Proyección máxima. Mover punto de pivote y Restablecer orientación se identifican con flechas amarillas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Trazado de segmentos de dendritas. (A) Volumen 3D de imágenes confocales z-stack para el trazado de dendritas. Con la pestaña de árbol, los kernels guiados por el usuario y direccionales seleccionados, el rastreo comienza colocando el kernel inicial en la dendrita con un clic izquierdo. (B) Propagación de granos direccionales por la dendrita siguiendo el movimiento del cursor. (C) Al hacer clic con el botón izquierdo más abajo en la dendrita, se llenan los núcleos direccionales. (D) Ejemplo de núcleos direccionales que no pueblan la dendrita. En su lugar, un kernel solitario está presente más abajo en el segmento. (E) Al hacer clic con el botón izquierdo en el núcleo solitario, se llena la dendrita entre los dos puntos. Al hacer clic con el botón derecho, se finaliza el seguimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Puntos de ajuste en dendritas trazadas. (A) Segmento de dendrita trazado pendiente de ajuste de punto. La edición de dendritas requiere que se seleccionen las pestañas "Árbol" y "Editar". Ambos están resaltados en amarillo. Se ha seleccionado Dendrite para editarla con un clic izquierdo. (B) La selección de la pestaña de puntos, resaltada en amarillo, permite la selección de puntos individuales en el segmento de dendrita. El punto verde tiene un grosor de 1,2 μm. (C) Punto ajustado para rellenar la dendrita con mayor precisión. El nuevo valor de espesor del punto verde es de 0,6 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Resultados del análisis de imágenes de muestra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Ejemplos de trazados de imágenes con dendritas y spines.dat Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Ejemplos de calcos con dendrites.dat Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Archivo de imagen de dendrita de muestra.czi Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Archivo de imagen de dendrita de muestra.jpx Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.